CN110157738B

CN110157738B - 靶向cd19和cd22的工程化免疫细胞及其应用

Info

Publication number: CN110157738B
Application number: CN201910117288.3A
Authority: CN
Inventors: 江鹏斐; 曹卫; 沈连军; 朱小彬; 马安云; 刘丽萍; 董琦
Original assignee: Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2039-02-13
Also published as: CN110157738A

Abstract

本发明涉及靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞及其应用。具体地，本发明提供了一种具有P1‑X‑P2‑Y(式I)结构的核酸构建物，各元件的定义如说明书所述。本发明的工程化免疫细胞可以同时识别CD19和CD22两种抗原，并且靶向CD19和CD22的两个CAR在工程化免疫细胞中的表达水平相近，减少了识别单靶点CAR‑T细胞治疗过程中因抗原表达下调或者缺失产生的免疫逃逸风险，并可以大大减小该发明的产业化应用难度。

Description

靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，更具体地涉及靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞及其应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。现在血液肿瘤的临床试验中应用最多的是第二代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。

CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

然而，目前细胞免疫治疗的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的的工程化免疫细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供同时靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述的核酸构建物具有从5”端至3”端的式I结构：

P1-X-P2-Y (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

P1为第一启动子，

P2选自下组：第二启动子、IRES、P2A多肽编码序列、连接肽编码序列、或其组合；

X和Y分别为靶向CD19的第一CAR或靶向CD22的第二CAR的编码序列，且X和Y两者中一个为靶向CD19的第一CAR的编码序列，另一个为靶向CD22的第二CAR的编码序列。

在另一优选例中，所述P1和P2分别为第一启动子和第二启动子，且P2对RNA聚合酶的亲和力V2≥P1对RNA聚合酶的亲和力V1。

在另一优选例中，所述P1和P2分别为第一启动子和第二启动子，且P2对RNA聚合酶的亲和力V2≤P1对RNA聚合酶的亲和力V1。

在另一优选例中，所述X为靶向CD19的第一CAR，Y为靶向CD22的第二CAR。

在另一优选例中，所述X为靶向CD19的部分编码序列和靶向CD22的部分编码序列的组合，Y为靶向靶向CD19的另一部分编码序列和靶向CD22的部分另一编码序列的组合。

在另一优选例中，所述X和/或Y的3”端还含有终止子。

在另一优选例中，所述P1选自下组：CMV、CAG、CBG、EF1a、UbC、H1、U6、PGK、TRE、GBG、ELF1、ELF4、SV40、RSV、MSCV、EF1A、或其组合。

在另一优选例中，所述P2选自下组：CMV、CAG、CBG、EF1a、UbC、H1、U6、PGK、TRE、GBG、ELF1、ELF4、SV40、RSV、MSCV、EF1A、或其组合。

在另一优选例中，所述V2/V1的比值为1-10，优选地1-5。

在另一优选例中，所述V1/V2的比值为1-10，优选地1-5。

在另一优选例中，所述的靶向CD19的第一CAR由CMV启动子启动表达；而靶向CD22的第二CAR由EF1A启动子启动表达。在另一优选例中，所述P2为IRES系列。

在另一优选例中，所述P2为P2A肽的编码序列系列。

在另一优选例中，所述P2连接肽的编码序列系列。

在另一优选例中，所述靶向CD19的第一CAR的结构如下式II所示：

L1-scFv1-H1-TM1-C1-CD3ζ (II)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L1为任选的信号肽序列；

scFv1为靶向CD19的抗原结合结构域；

H1为任选的铰链区；

TM1为跨膜结构域；

C1为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的scFv1的结构如下式1所示：

VL1-VH1 (1)

其中，VL1为抗CD19抗体轻链可变区；VH1为抗CD19抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述靶向CD22的第二CAR的结构如下式III所示：

L2-scFv2-H2-TM2-C2-CD3ζ (III)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L2为任选的信号肽序列；

scFv2为靶向CD22的抗原结合结构域；

H2为任选的铰链区；

TM2为跨膜结构域；

C2为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的scFv2的结构如下式2所示：

VL2-VH2 (2)

其中，VL2为抗CD22抗体轻链可变区；VH2为抗CD22抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述的L1,L2，L3各自独立地为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H1,H2,H3各自独立地为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM1,TM2,TM3各自独立地为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的C1,C2,C3各自独立地为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，所述靶向CD19的CAR的编码序列如SEQ ID NO.:1，氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

SEQ ID NO.:1

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGCGGTTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTA//

SEQ ID NO.:2

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

在另一优选例中，所述靶向CD22的CAR的编码序列如SEQ ID NO.:3，氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

SEQ ID NO.:3

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGcaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgattatgcagtatctgtgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagagaagtgactggggatctcgaggatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcctcaggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacatccagatgacccagtctccatcgtccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagccagaccatttggagctacttaaattggtatcagcagagaccagggaaagcccctaacctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcaggggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaagctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtatccctcagacttttggccaggggaccaagctggagatcaaaACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA//

SEQ ID NO.:4

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

在另一优选例中，所述L1与scFv1之间，和/或所述L2与scFv2之间，还含有多重复Flag(氨基酸序列DYKDDDDK如SEQ ID No.7所示，核酸序列如SEQ ID No.8)、多重复C-myc(氨基酸序列EQKLISEEDL，如SEQ ID No.9所示,核酸序列如SEQ ID No.10)、或其组合；

SEQ ID No.7

DYKDDDDK*

SEQ ID No.8

GATTACAAGGATGACGACGATAAG//

SEQ ID No.9

EQKLISEEDL*

SEQ ID No.10

GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTC//

在另一优选例中，所述的第一CAR和/或第二CAR中还包含蛋白标签。

在另一优选例中，所述的蛋白标签选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二CAR含有选自下组的蛋白标签：EGFR截断体(EGFRt)、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，靶向CD22的第二CAR和EGFRt由一个EF1A启动子启动表达。

在另一优选例中，靶向CD22的第二CAR和RQR8由一个EF1A启动子启动表达。

在另一优选例中，所述的EGFRt核酸构建物选自下组：

(a)具有如SEQ ID NO.:11所示的核酸序列；或

(b)与SEQ ID NO.:11所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

SEQ ID NO.:11

cgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatg//

在另一优选例中，所述的EGFRt核酸构建物编码的氨基酸序列选自下组：

(a)具有如SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列；或

(b)与SEQ ID NO.:12所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

SEQ ID NO.:12

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM*

在另一优选例中，所述的RQR8核酸构建物选自下组：

(a)具有如SEQ ID NO.:13所示的核酸序列；或

(b)与SEQ ID NO.:13所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

SEQ ID NO.:13

在另一优选例中，所述的RQR8核酸构建物编码的氨基酸序列选自下组：

(a)具有如SEQ ID NO.:14所示氨基酸序列；或

(b)与SEQ ID NO.:14所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

SEQ ID NO.:14

1 CPYSNPSLCS GGGGSELPTQ GTFSNVSTNV SPAKPTTTAC PYSNPSLCSG GGGSPAPRPP

61 TPAPTIASQP LSLRPEACRP AAGGAVHTRG LDFACDIYIW APLAGTCGVL LLSLVITLYC

121 NHRNRRRVCK CPRPVV//

在另一优选例中，所述核酸构建物还包括选自下组的基因：截短的表皮生长因子受体(EGFRt)、截短的CD19(CD19t)基因、诱导的胱天蛋白酶9基因(iCasp9)、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，所述的核酸构建物中还含有至少一个用于表达细胞自杀元件的表达盒。

在另一优选例中，所述的核酸构建物中含有一个或两个用于表达细胞自杀元件的表达盒。

在另一优选例中，所述表达盒中还包含任选的第三启动子。

在另一优选例中，所述第三启动子为组成型启动子或诱导型启动子。

在另一优选例中，所述表达盒与所述P1或所述Y相连，优选地通过2A序列或IRES序列连接；和/或

所述表达盒位于所述Y之后，优选地通过2A序列或IRES序列与X和P2连接。

在另一优选例中，所述核酸构建物的结构选自式B、式C或式D；

P1-X-P2-Y-P3-Z (B)；P3-Z-P1-X-P2-Y (C)；P1-X-P3-Z-P2-Y (D)。

在另一优选例中，所述Z为细胞自杀元件的编码序列。

在另一优选例中，P3选自下组：第三启动子、IRES、P2A多肽编码序列、连接肽编码序列、或其组合。

在另一优选例中，所述P3为CMV、CAG、CBG、EF1a、UbC、H1、U6、PGK、TRE、GBG、ELF1、ELF4、SV40、RSV、MSCV、或其组合。

在另一优选例中，所述P3为IRES系列。

在另一优选例中，所述P3为P2A肽的编码序列系列。

在另一优选例中，所述P3为连接肽的编码序列系列。

在另一优选例中，所述细胞自杀元件选自下组的自杀开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式A所示：

B-D-F (A)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

B为自杀开关诱导元件；

D为柔性接头；

F为自杀开关。

在另一优选例中，所述的细胞自杀元件包含iCasp9。

在另一优选例中，所述的自杀开关为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9。

在另一优选例中，所述的B为FKBP12-F36V结构域。

在另一优选例中，所述的FKBP12-F36V结构域包含FKBP结构域，且FKBP结构域的第36位氨基酸由苯丙氨酸替代了缬氨酸。

在另一优选例中，所述D的序列如SEQ ID NO.:15所示(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。

在另一优选例中，所述的式II、式III、式A、式B、式C、式D均按照从N端到C端方向排列。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明的第三方面，提供了一种基因工程化细胞，所述细胞含有本发明第二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的核酸构建物。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为免疫细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，所述细胞的细胞膜上表达有所述第一CAR和第二CAR。

在另一优选例中，当所述X为第一CAR的编码序列时，第二CAR的表达量E2≥第一CAR的表达量E1，或者所述细胞膜上第二CAR的数量S2≥第一CAR的数量S1。优选地，E2/E1的比值为1-10，优选地1-5。优选地，S2/S1的比值为1-10，优选地1-5。

在另一优选例中，当所述X为第一CAR的编码序列时，第二CAR的表达量E2小≤第一CAR的表达量E1，或者所述细胞膜上第二CAR的数量S2≤第一CAR的数量S1。优选地，E1/E2的比值为1-10，优选地1-5。优选地，S1/S2的比值为1-10，优选地1-5。

在另一优选例中，当所述X为第二CAR的编码序列时，第一CAR的表达量E1≥第二CAR的表达量E2，或者所述细胞膜上第一CAR的数量S1≥第二CAR的数量S2。E1/E2的比值为1-10，优选地1-5。优选地，S1/S2的比值为1-10，优选地1-5。

在另一优选例中，所述细胞同时靶向CD19和CD22。

在另一优选例中，所述细胞内还包括细胞自杀元件。

在另一优选例中，所述的细胞自杀元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞自杀元件为CAR的形式。

在另一优选例中，所述细胞自杀元件与所述第一CAR(N端或C端)和/或所述第二CAR(N端或C端)通过2A多肽(如T2A、P2A)连接。

在另一优选例中，所述细胞内还包括细胞纯化需要的表达元件。

在另一优选例中所述的细胞纯化需要的表达元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8，多重复Flag(氨基酸序列DYKDDDDK如SEQ ID No.7所示，核酸序列如SEQ ID No.8)、多重复C-myc(氨基酸序列EQKLISEEDL，如SEQ ID No.9所示,核酸序列如SEQ ID No.10)绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、RQR8、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞的PD1基因表达是被沉默的。

在另一优选例中，所述“PD-1基因表达是被沉默的”指PD-1基因不表达或低表达。

在另一优选例中，所述“低表达”指所述免疫细胞PD-1基因的表达量G1与正常免疫细胞PD-1基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR-T细胞PD-1基因的表达量G1与正常T细胞PD-1基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

本发明的第四方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的基因工程化细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述基因工程化细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述方法包括步骤：将本发明第一方面所述的核酸构建物、或本发明第二方面所述的载体导入到免疫细胞内，从而得到所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述工程化免疫细胞为CAR-T细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明的第六方面，提供了如本发明第一费那个慢所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的基因工程化细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、或其组合。

本发明的第七方面，提供了一种用于制备本发明第三方面所述细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第一方面所述的核酸构建物、或本发明第二方面所述的载体。

本发明的第八方面，提供了一种靶向CD19和CD22的CAR，所述CAR的结构如下式IV所示：

L3-VL3A-H3A-VH3A-LK3-VL3B-H3B-VH3B-H3-TM3-C3-CD3ζ (IV)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L3为任选的信号肽序列；

VL3A为靶向CD19的抗原结合轻链可变区；

H3A为连接肽，结合VL3A和VH3A；

VH3A为靶向CD22的抗原结合重链可变区；

LK3为连接肽，结合VH3A和VL3B；

VL3B为靶向CD22的抗原结合轻链可变区；

H3B为连接肽，结合VL3B和VH3B；

VH3B靶向CD19的抗原结合重链可变区；

H3为任选的铰链区；

TM3为跨膜结构域；

C3为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述靶向CD19和CD22的CAR的编码序列如SEQ ID NO.:5，氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

SEQ ID NO.:5

atgctgctgctcgtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccctgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgatagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagcagactgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcaaggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcacaggcggcggaggatcccaggtgcagctgcagcagtctggacccggcctcgtgaagcctagccagaccctgtctctgacctgcgccatcagcggcgatagcgtgtccagcaatagcgccgcctggaactggatccggcagagcccttctagaggcctggaatggctgggccggacctactaccggtccaagtggtacaacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccatcaaccccgacaccagcaagaaccagttctccctgcagctgaacagcgtgacccccgaggataccgccgtgtactactgcgccagagaagtgaccggcgacctggaagatgccttcgacatctggggccagggcacaatggtcaccgtgtctagcggcagcacaagcggctctggcaagcctggatctggcgagggctctaccaagggcgatattcagatgacacagagcccctccagcctgtccgcctctgtgggagacagagtgacaatcacctgtcgggcctcccagaccatctggtcctatctgaattggtatcagcagcggcctggcaaggcccccaacctgctgatctatgccgccagctctctgcagtccggcgtgccatctagattcagcggcagaggcagcggcaccgatttcaccctgacaattagcagtctgcaggccgaggacttcgccacctactattgccagcagagctacagcatcccccagaccttcggccagggaacaaaactggaaatcaaagggggaggcggcagcgaagtgaaactgcaggaatctggccctggcctggtggccccaagccagtctctgagcgtgacctgtaccgtgtctggcgtgtccctgcccgattacggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggactggaatggctgggagtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtccaggctgaccatcatcaaggacaactccaagagccaggtgttcctgaagatgaattccctgcagaccgacgacaccgccatctattactgtgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggacagggaacctccgtgaccgtgtcctcttccggaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

SEQ ID NO.:6

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

在本发明的第九方面，提供了一种本发明第三方面所述细胞、或本发明第四方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的细胞、或本发明第四方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A和1B显示了本研究中设计的核酸构建物。

其中，构建物1为只表达CD19 CAR的对照。

构建物2为只表达CD22 CAR的对照。

构建物3为表达CD19 CAR和CD22 CAR，分别由CMV和EF1A启动子启动表达。

构建物4为表达CD19 CAR和CD22 CAR,EGFRt其中CD19 CAR由CMV启动子启动表达；CD22 CAR和EGFRt由EF1A启动子启动表达。

构建物5为表达CD19和CD22 CAR,RQR8：其中CD19 CAR由CMV启动子启动表达；CD22CAR和RQR8由EF1A启动子启动表达。

构建物6表达CD19和CD22 CAR,由EF1A启动子启动表达。X为靶向CD19的部分编码序列和靶向CD22的部分编码序列的组合，Y为靶向靶向CD19的另一部分编码序列和靶向CD22的部分另一编码序列的组合。

图2显示了设计的核酸构建物转染细胞产生逆转录病毒，病毒转染活化的PBMC细胞得到CART细胞。检测表明CART细胞表面表达相应的蛋白。

图2A显示了CD19 CAR的表达情况，含有CD19 CAR结构的结构物在CART细胞表面都表达CD19CAR，没有转染的T细胞为对照.

图2B显示了CD22 CAR的表达情况，CD22 CAR为人源化的scFv结构，可以被抗人Fab抗体特异性的识别。含有CD22 CAR结构的结构物在CART细胞表面都表达CD19CAR,没有转染的T细胞为对照

图2C显示了EGFRt和RQR8的表达情况，含有EGFRt和RQR8的结构物在CART细胞表面都表达EGFRt和RQR8,没有转染的T细胞为对照

图3显示了CART细胞在体外可以识别表达CD19和CD22抗原的肿瘤细胞系Raji-luciferase细胞，并且有不同程度的杀伤作用。在加入CART细胞，可以观察到肿瘤细胞减少。不加CART细胞或者是加入未感染病毒的T细胞没有杀伤效果。

图4A和4B显示了不同的CART细胞的特异性杀伤效果。

图5A、5B和5C显示了本发明的CART细胞(对应于构建物5的CAR)可显著降低小鼠瘤负荷，且对体重无影响。

各附图中，编号1、2、3、4、5和6分别表示构建物1、2、3、4、5和6，或相应的CAR或CAR-T细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种同时靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞。具体地，本发明提供了一种具有如上所述的式I结构的核酸构建物。本发明的工程化免疫细胞可以同时识别CD19和CD22两种抗原，并且靶向CD19和CD22的两个CAR在工程化免疫细胞中的表达水平相近，减少了识别单靶点CAR-T细胞治疗过程中因抗原表达下调或者缺失产生的免疫逃逸风险，并可以大大减小该发明的产业化应用难度。与靶向单抗原的CAR-T相比，同时识别两个靶点的CAR-T细胞亲和力和细胞激活水平增强，治疗的范围更广。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

共表达元件

如本文所用，术语“共表达元件”是指在一个载体中表达两个或者多个蛋白需要的核酸构建物：包括加入另一个启动子，内部核糖体进入位点，2A多肽编码序列。

内部核糖体进入位点，缩写IRES，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5”帽结构，从而使直接从信使RNA(mRNA)中间起始翻译成为可能。IRES可以实现单一启动子同时表达两个基因。

“2A多肽编码序列”、“2A序列”指的是发现于病毒中的一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列，类似于IRES，利用2A可以实现单一启动子同时表达两个基因。它也广泛存在于各类真核细胞。与IRES不同的是，下游蛋白表达量不会减少。但剪切后2A多肽残基与上游蛋白连为一体，可在上游蛋白和2A多肽间加入一种Furin蛋白酶剪切点(4个碱性氨基酸残基，如Arg-Lys-Arg-Arg)以从上游蛋白末端完全切除2A多肽残基。

抗体

术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

自杀开关

为进一步控制CAR-细胞非肿瘤靶向和细胞因子释放综合征等不良，本发明中的CAR-细胞皆带有自杀开关，在外源性药物的作用下，可以有效清除体内的CAR-细胞，阻断未知的或不可控的远期毒性，以保证患者的安全。

本发明中所用自杀开关可以为单纯疱疹病毒胸苷激酶(the herpes symplexvirus thymidine kinase，HSV-TK)、可诱导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(induciblecaspase 9,iCasp9)、CD20、突变型人胸苷酸激酶(mutated human thymidylate kinase，mTMPK)，eGFRt等。比较而言，HSV-TK、iCasp9和CD20对CAR-细胞的清除能力等同，但是iCasp9和CD20的清除较迅速，HSV-TK清除速度较慢。

iCasp9自杀开关包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性接头连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。当加入小分子后，能够促使其二聚话，从而诱导细胞的凋亡，而对未携带自杀开关的正常细胞无效用。

诱导安全开关caspase9(iCasp9)使用人的caspase9融合FK506结合蛋白(FKBP)，使其可以用化学诱导剂(AP1903/Rimiducid，Bellicum Pharmaceutical)诱导形成二聚体，导致表达融合蛋白的细胞凋亡。

如何控制CAR-细胞的安全性一直都是急需解决的问题。在CAR-细胞上加入安全开关，是用于终止CAR-细胞活性最安全的方式。在CAR-细胞产生严重毒性(CRS/神经毒性)或者在病人达到长期持续缓解后，可诱导的iCasp9安全开关控制CAR-细胞清除。

细胞纯化需要的表达元件

CAR通过载体引入细胞后表达CAR在细胞表面发挥功能，但是不是所有的细胞都能被病毒等载体感染，实际的CAR阳性的细胞比例在10％-60％。大量不表达CAR无功能的细胞输入病人体内增加的各种风险。通过纯化可以提高功能降低风险。

细胞纯化需要的表达元件包括：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、RQR8，多重复Flag(序列DYKDDDDK)、多重复C-myc(序列EQKLISEEDL)，绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、RQR8、或其组合。

细胞纯化需要的表达元件表达在CAR细胞表面可以特异的含有结合偶联抗体的磁珠(Beads)从而富集纯化阳性的CAR细胞。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，包含两种CAR，抗CD19CAR和抗CD22CAR。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab”片段，F(ab”)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD19和/或CD22的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

在另一优选例中，本发明所述CAR还包括有细胞自杀元件。

在本发明中，“第一CAR”和“CD19 CAR”可互换使用，均表示本发明第一方面中所述的靶向CD19的CAR。

在本发明中，“第二CAR”和“CD22 CAR”可互换使用，均表示本发明第一方面中所述的靶向CD22的CAR。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“CART”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第三方面所述的同时靶向CD19和CD22的CAR-T细胞。

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最常见的儿童肿瘤，尽管前期治疗有很大进步，但复发难治的ALL仍是儿童癌症相关死亡的首要因素。使用靶向CD19的CAR进行ALL免疫治疗，在成人和青年中均取得了很好的疗效，多个临床试验显示治疗ALL达到70-90％的缓解率。但不是所有病人都能从CAR-T受益，至少10％的病人因为缺失CD19抗原表位而复发。

CD19是分子量95kDa的糖蛋白,表达于前B细胞和成熟B细胞膜表面,与B细胞Ca++的跨膜传导通路密切相关,对B细胞的增殖和分化具有调节作用。CD19主要表达在正常B细胞和癌变B细胞中，组织表达特异性较高，是一个很好的抗体或CAR-T免疫治疗靶点。但在免疫治疗过程中，经常会出现B细胞的CD19表位丢失情况，造成病人对免疫治疗无反应或者复发。CD22是pre-B细胞(B细胞前体细胞)的另一个表面抗原，广泛表达于ALL blast(急性淋巴白血病母细胞)，目前已被免疫交联物成功靶向，可用于在B细胞CD19抗原丢失后免疫治疗的替代靶点，让免疫治疗继续发挥作用。

本发明提供一个同时表达抗CD19的CAR和抗CD22的CAR的免疫工程化细胞。本发明的靶向CD19和CD22的CAR为两个独立结构，包含抗CD19的CAR和CD22的CAR。其中抗CD19CAR和抗CD22CAR的表达水平是其功能的主要影响因素。

本发明使用双向靶向pre-B ALL的CD19和CD22的CAR，与靶向单抗原的CAR相比，亲和力增强，T细胞的活性增加，具有相加或协同效应。此外，由于CD19和CD22在白血病细胞中的表达水平不均一，使双靶向CAR-T治疗范围更广泛。同时靶向pre-B ALL表面的CD19和CD22的CAR-T可以减少因单一表面抗原下调或者缺失造成的抗原逃逸的可能性。与靶向单抗原的CAR-T相比，同时识别两个靶点的CAR-T细胞亲和力和细胞激活水平增强，治疗的范围更广。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第三方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗CD19和/或CD22高表达的肿瘤，如B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

PD-1基因表达下调或沉默

CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。但是在实体肿瘤治疗中，Moon等发现在小鼠中注射meso-cart能够约束肿瘤的生长，但是不能治疗肿瘤。因此认为是肿瘤微环境中负调控因子的上调导致cart功能的减退，如在肿瘤微环境中，T细胞表面PD-1(programmed death protein-1)表达上调限制了T细胞的功能。有研究表明，在小鼠上用抗体阻断PD1后，CAR-T细胞功能得到增强。PD1抗体可以提高CAR-T细胞功能，但是注射抗体后全身阻断PD1，增强了自体所有反应T细胞的激活，导致毒性较大。

本发明将CAR-T中PD1的表达沉默只特异性解除肿瘤细胞对CART细胞的抑制作用，而不会对其他T细胞发挥作用，从而降低毒性，更好的发挥CAR-T细胞抗肿瘤的效果。

如本文所用，“PD-1基因表达是被沉默的”指PD-1基因不表达或低表达。“低表达”指所述CAR-T细胞PD-1基因的表达量G1与正常T细胞PD-1基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

本发明中PD-1基因表达下调或沉默方法有CRISPR/Cas9、RNA干扰技术、转录激活因子样效应物核酸酶TALENs(transcription activator-like(TAL)effector nucleases)和锌指核酸酶Zinc finger nucleases(ZFNs)。优选地，本发明通过CRISPR/Cas9、RNA干扰技术使PD-1基因下调或沉默。在本发明的一个实施例中，采用CRISPR/Cas9使PD-1基因下调或沉默。

多基因共表达策略

常见的基因共表达策略包括：1.构建多启动子表达策略；2.构建剪切载体；3.表达融合基因；4.基因之间以IRES序列连接；5.基因之间以Furin的切割靶点序列连接；6.基因之间以2A序列连接；7.各种构建方式的联合应用。以上多基因共表达方式各有利弊，但在免疫细胞中的应用受到了限制。本发明提供了一种方法，将抗CD22嵌合抗原受体和抗CD19嵌合抗原受体通过一种共表达元件连接在表达载体中，导入T细胞中，使两个基因在T细胞中表达水平相近，此方法可大大减小本发明未来产业化应用的难度。

核酸构建物

本发明提供了一种核酸构建物，所述的核酸构建物如本发明第一方面所述，能够所述的核酸构建物具有从5”端至3”端的式I结构：

P1-X-P2-Y-P3-Z (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

P1和P2分别为第一启动子和第二启动子，且P2对RNA聚合酶的亲和力V2≥P1对RNA聚合酶的亲和力V1；

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD19和CD22，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

在另一优选例中，所述细胞的细胞膜上表达有所述第一CAR和第二CAR，同时靶向CD19和CD22。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD19和CD22的CAR-T细胞引起抗表达CD19和/或CD22的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-CD19CAR、-CD22CAR的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的工程化免疫细胞可以同时识别CD19和CD22两种抗原，减少了识别单靶点CAR-T细胞治疗过程中因抗原表达下调或者缺失产生的免疫逃逸风险。与靶向单抗原的CAR-T相比，同时识别两个靶点的CAR-T细胞亲和力和细胞激活水平增强，治疗的范围更广。

(b)本发明提供了一种基因共表达方法，将抗CD22嵌合抗原受体和抗CD19嵌合抗原受体通过一种共表达元件连接，放入同一载体中，使两者能在工程化免疫细胞中表达并且表达水平相近，此方法可大大减小该发明的产业化应用难度。尤其是采用双启动子的CAR构建物，居然可以更有效地和更快速地显著降低肿瘤负荷。

(c)本发明的工程化免疫细胞包含一个安全开关，用于在达到某些条件后，清除病人体内的工程化免疫细胞，可用于控制病人体内的副反应。

(d)本发明的工程化免疫细胞肿瘤杀伤效果更强，体内存活时间更久，疗效更佳，可以避免自体反应T细胞的激活，不干扰体内正常T细胞，更安全、毒副作用更小。

(e)本发明工程化免疫细胞的CAR结构中同时包含CAR基本结构和细胞自杀元件，并且该工程化免疫细胞的PD-1基因沉默，上述改造各自独立地发挥功能，互不干扰。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1CAR的结构设计和病毒制备

本发明提供一个共表达针对CD19抗原的特异性嵌合抗原受体和CD22抗原的特异性嵌合抗原受体的核酸构建物。共表达靶向CD19的CAR和CD22的CAR结构组分可以包括一个靶向CD19的CAR，和一个靶向CD22的CAR。

各构建物的结构如图1A和1B所示。

构建CD19,CD22已经共同表达的慢病毒转移载体质粒，质粒的骨架来源于pCDH；将慢病毒转移载体质粒pCDH-EF1α-CD19/CD22CAR，和慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000同时转入293T中制备慢病毒表达载体；在第二天和第三天收集病毒上清，超离进行病毒浓缩，浓缩之后的慢病毒可以直接用于感染细胞，或于-80℃保存备用。

实施例2T细胞的分离和扩增

从外周血中分离单核细胞，使用Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)进行密度梯度离心，从外周血中分离单核细胞，并富集T细胞(EasySep human T cell enrichment kit，Stemcell Technologies)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用X-vivo15(含5％FBS，2mM L-glutamine，1mM丙酮酸钠，300IU/mlrhIL2)；所有细胞均置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

实施例3细胞培养

CD19/CD22表达的细胞系：Raji(Burkitt”s淋巴癌细胞系，ATCC-CCL86)Raji-Luc细胞系使用firefly luciferase的慢病毒感染Raji细胞筛选单克隆后得到；Hela细胞系(人宫颈癌细胞系,ATCC-CCL2)，使用CD19,CD22的慢病毒转染构建稳转株Hela-CD19和Hela-CD22，用CD22感染Hela-CD19细胞株获得双表的细胞株Hela-CD19/CD22以上细胞均使用RPMI 1640培养基培养；293T(ATCC-CRL3216)使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠；所有细胞均置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

实施例4CAR-T细胞制备

CAR基因表达的载体可以是DNA、RNA、表达质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子或其他基因转移系统。

分离纯化的原代T细胞在激活三天后，转入包含CD19和或CD22CAR(包含CD19scFv和或CD22scFv的CAR)的表达载体；使用293T细胞进行CAR的慢病毒包装，再用包含CAR的慢病毒感染激活后的T细胞，感染两天后CAR-T细胞进行转移至12ml的细胞板，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。感染后3-5天后检测CAR+阳性率，检测方法为不同荧光标记的CD19抗原肽和抗人Fab抗体(CD22scFv来源于人源抗体，可以特异性的被抗人Fab抗体识别)与CAR-T细胞共孵育，使用流式细胞术进行检测。每隔2-3天更换一半培养基。

结果显示图2A，图2B，可以制备同时靶向CD19和CD22的CAR-T细胞，即抗CD19/CD22双特异性CAR-T细胞，在6号构建CAR-T中CD19CAR和CD22CAR的表达比例约为1:1。

图2C表明在表达两个CD19和CD22CAR-T的同时表达第三个外源基因(EGFRt，RQR8)是可行的。

实施例5基于Luciferase活性的的细胞杀伤实验

取50ul 2×10⁵/ml带有Luciferase标记靶细胞Raji-luc，与100μl 5或者1×10⁵/ml的CAR-T阳性细胞(效靶比为5：1和1：1),接种于96孔白板中，在5％CO₂/37℃培养箱中共培养4-24小时。取出后加入100μl luciferase酶的发光底物(Steady-Glo luciferaseassay)，室温混合10分钟，读取荧光值。细胞杀伤率的计算方法：(靶细胞荧光读值-加CAR-T处理的荧光读值)/靶细胞的荧光读值×100

结果如图3显示，构建的6种CAR-T细胞具有强烈的细胞杀伤作用。对细胞的杀伤程度进行分析，3种用两个启动子表达两种CAR结构(No.3，4，5)杀伤效果对比用1个启动子表达的CAR结构No.6杀伤效果更为优异：在1：1效靶比时的杀伤百分比为74.5±1.0，75.9±0.4，75.4±3.4和61.7±2.0，用T-test分析表明CAR结构编号No.3和6，4和6以及5和6之间差异显著，P值均小于0.0001，在编号No.3、4、5这三种结构CAR-T之间的无明显差异。

实施例6基于RTCA的特异性杀伤实验

取10⁴个Hela,Hela-CD19,Hela-CD22以及Hela-CD19/CD22细胞加入E-plate过夜培养至铺满孔。每孔放入5X10⁴CAR-T细胞(效靶比为5：1)，将E-plate放入仪器继续检测。最终得到细胞生长指数的实时信号，如果加入的CAR-T细胞对效应细胞有杀伤，细胞的生长指数会显著减低，通过细胞的生长指数的变化可以计算杀伤的效率(图4A)。

在CAR-T细胞加入后5小时左右，细胞的生长指数的变化基本达到最大值，将CAR-T细胞杀伤的百分比减去T细胞对照杀伤的百分比，得到图4B。

结果显示，单独表达CD19scFv的CAR-T细胞只能杀伤Hela-CD19和Hela-CD19/CD22,不能杀伤Hela-CD22细胞。单独表达CD22scFv的CAR-T细胞只能杀伤Hela-CD22和Hela-CD19/CD22,不能杀伤Hela-CD19细胞。同时靶向CD19和CD22的CAR-T细胞既可以杀伤Hela-CD19，也可以杀伤Hela-CD22和同时表达的Hela-CD19/CD22细胞。

对比不同的CAR-T/细胞的杀伤曲线，如在Hela-CD19/CD22细胞中的箭头所示，编号为No.6的CAR-T的杀伤作用比其他结构的CAR-T较弱，完全杀伤需要的时间更长(约14小时)，而编号为No.3、4和5的CAR-T完全杀伤仅需要约8小时。

如图4B所示，在加入No.6CAR-T后5小时Hela-CD19CD20杀伤百分比为：37.5±1.1，显著低于No.3，No.4，No.5结构的杀伤百分比74.8±0.3，73.3±0.6，69.6±2.4。

实施例7体内药效研究

选取6-12周大的NOD-Prkdcscid IL2rgnull(NPG)小鼠，尾静脉注射5×10⁶Raji-luciferase细胞。六天后检测肿瘤移植物的负荷，分成肿瘤负荷相当的3组，分组后一天分别注射200uL DPBS/鼠(对照组)，5×10⁶T细胞/鼠(NT组)，5×10⁶CD19/CD22CAR-T细胞/鼠(CAR-T治疗组)，CAR-T处理后每周2次评估小鼠肿瘤负荷及小鼠体重，腹腔注射3mg的d-luciferin，反应四分钟，使用Xenogen IVIS ImagingSystem拍照，曝光30s。

结果显示，与对照组和NT细胞组相比，采用CD19/CD22CAR-T细胞(对应于No.3、4、5和6)的治疗组，小鼠瘤负荷均显著降低，且体重无影响。其中，采用No.3、4和5的CAR-T的效果最佳。图5显示了采用No.5的CAR-T治疗效果：不仅显著降低小鼠瘤负荷(下降了约1000倍)，且对体重基本无影响。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 亘喜生物科技（上海）有限公司

<120> 靶向CD19和CD22的工程化免疫细胞及其应用

<130> P2018-0314

<150> CN201810150545.9

<151> 2018-02-13

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacta agttggaaat aacaggtggc ggtggcagcg gcggtggtgg ttccggaggc 420

ggcggttctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcta 1460

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

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465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 3

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tataatgatt atgcagtatc tgtgaaaagt cgaataacca tcaacccaga cacatccaag 300

aaccagttct ccctgcagct gaactctgtg actcccgagg acacggctgt gtattactgt 360

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aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080

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cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

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<210> 4

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp

35 40 45

Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp

65 70 75 80

Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro

85 90 95

Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu

115 120 125

Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

165 170 175

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr

180 185 190

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

225 230 235 240

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln

245 250 255

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 5

<211> 2202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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tattactgtg ccaagcacta ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggacag 1500

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cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1800

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acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 2202

<210> 6

<211> 733

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly

130 135 140

Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser

165 170 175

Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys

180 185 190

Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn

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Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr

210 215 220

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225 230 235 240

Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

260 265 270

Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

275 280 285

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr

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Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro

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Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

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Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

355 360 365

Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

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Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val

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Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser

405 410 415

Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly

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Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn

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Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser

450 455 460

Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile

465 470 475 480

Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp

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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Thr Thr

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Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

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Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

545 550 555 560

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

565 570 575

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

580 585 590

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

595 600 605

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

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Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctc 30

<210> 11

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60

acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120

gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180

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gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720

cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780

acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840

ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900

gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960

ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005

<210> 12

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 13

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcccctaca gcaaccccag cctgtgcagc ggaggcggcg gcagcgagct gcccacccag 60

ggcaccttct ccaacgtgtc caccaacgtg agcccagcca agcccaccac caccgcctgt 120

ccttattcca atccttccct gtgtagcgga gggggaggca gcccagcccc cagacctccc 180

accccagccc ccaccatcgc cagccagcct ctgagcctga gacccgaggc ctgccgccca 240

gccgccggcg gcgccgtgca caccagaggc ctggatttcg cctgcgatat ctacatctgg 300

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aaccaccgca accgcaggcg cgtgtgcaag tgccccaggc ccgtggtg 408

<210> 14

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro

20 25 30

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys

35 40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

50 55 60

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

85 90 95

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

100 105 110

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

115 120 125

Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val

130 135

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物具有从5'端至3'端的式I结构：

P1-X-P2-Y (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

P1为启动子，

P2为启动子；

所述X为靶向CD19的第一CAR的编码序列，Y为靶向CD22的第二CAR的编码序列，并且所述的第二CAR含有蛋白标签RQR8的编码序列，所述RQR8与所述第二CAR C端通过2A多肽连接。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述P1和P2分别为第一启动子和第二启动子，且P2对RNA聚合酶的亲和力V2≥P1对RNA聚合酶的亲和力V1。

3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述P1和P2分别为第一启动子和第二启动子，且P2对RNA聚合酶的亲和力V2≤P1对RNA聚合酶的亲和力V1。

4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述P1选自下组：CMV、CAG、CBG、EF1a、UbC、H1、U6、PGK、TRE、GBG、ELF1、ELF4、SV40、RSV、MSCV、EF1A、或其组合。

5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述P2选自下组：CMV、CAG、CBG、EF1a、UbC、H1、U6、PGK、TRE、GBG、ELF1、ELF4、SV40、RSV、MSCV、EF1A、或其组合。

6. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述靶向CD19的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述靶向CD22的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

8.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，靶向CD22的第二CAR和RQR8由一个EF1A启动子启动表达。

9. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的RQR8核酸构建物编码的氨基酸序列为如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。

10.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的核酸构建物。

11.一种基因工程化细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求10所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求1所述的核酸构建物。

12.如权利要求11所述的基因工程化细胞，其特征在于，第二CAR的表达量E2≥第一CAR的表达量E1，或者所述细胞膜上第二CAR的数量S2≥第一CAR的数量S1。

13.如权利要求11所述的基因工程化细胞，其特征在于，第二CAR的表达量E2小≤第一CAR的表达量E1，或者所述细胞膜上第二CAR的数量S2≤第一CAR的数量S1。

14.如权利要求11所述的基因工程化细胞，其特征在于，第一CAR的表达量E1≥第二CAR的表达量E2，或者所述细胞膜上第一CAR的数量S1≥第二CAR的数量S2。

15.如权利要求11所述的基因工程化细胞，其特征在于，所述细胞的PD1基因表达是被沉默的。

16.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的核酸构建物、权利要求10所述的载体或权利要求11所述的基因工程化细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。