CN116478929A - 靶向bcma和cd19的双特异性car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向BCMA和CD19的CAR‑T细胞。具体地，本发明提供了一种同时针对B细胞成熟抗原(BCMA)和CD19抗原分子的嵌合抗原受体(CAR)的并联表达的核酸序列结构。本发明还提供了所述嵌合抗原受体用于B细胞相关病况的过继T细胞疗法的用途。

Description

靶向BCMA和CD19的双特异性CAR-T细胞
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及靶向BCMA和CD19和CD19CAR-T细胞。
背景技术
B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)即CD269，是肿瘤坏死因子超家族的成员(tumor necrosis factor receptor superfamily member 17，TNFRS17)，由185个氨基酸残基组成，属于III型跨膜蛋白，具有富含半胱氨酸的细胞外结构域，且具有一定的保守性。作为一种仅在B细胞谱系上表达的细胞表面蛋白，它与另外2种TNF受体超家族成员B细胞激活因子(B-cell activation factor，BAFF)受体和跨膜激活剂以及钙调亲环素配体(transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand，TACI)一起，对B细胞增殖、存活以及成熟和分化成浆细胞发挥重要调节作用。这3种受体通过与BAFF和/或同源配体APRIL结合支持B细胞在不同发育阶段的长期存活。而对于BCMA敲除小鼠的研究进一步表明BCMA虽然对于整体B细胞稳态并不是必要的，但对于长寿浆细胞的存活却至关重要。同时，BCMA在恶性MM浆细胞中高表达，并且随着疾病进展，BCMA表达增加，基因和蛋白质表达谱分析证实BCMA是最具选择性表达的MM细胞系上的细胞表面受体，使其成为MM的CAR-T细胞治疗中一个非常有前景的理想靶点。此前，在CAR的设计中研究者关注的主要是scFv的亲和性、其识别的抗原表位的位置及其对CAR T细胞疗法有效性的贡献等方面，但是较少有研究者关注scFv的免疫原性。最初，大多数CAR含有的都是来自鼠源抗体的scFv，然而，鼠源抗体会诱导患者产生排斥反应，降低疗效，增加复发率。人源化CAR-T可能会有助于降低患者免疫排斥反应，维持CAR-T细胞在患者体内长期存在，提高长期治疗效果。
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。近年来，CD19CAR T细胞领域竞争激烈，一些大的制药公司也和研究机构建立了合作关系。接受表达CD28或4-1BB的CD19CAR T细胞治疗后，小儿和成人复发或难治性急性B细胞淋巴瘤具有大约90％的完全缓解率。最近，CD19CAR T细胞治疗在弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤或慢性淋巴瘤中具有50％-100％的总体缓解率。CD19CAR T细胞治疗多发性骨髓瘤病人中具有临床优势，由于终末分化的浆细胞不表达CD19，恶性B细胞前体持续产生恶性浆细胞。
因此，针对CD19阴性复发，以及CD19低表达的B细胞肿瘤，本领域有需要开发多特异性的嵌合抗原受体免疫细胞，以解决CD19存在的易突变和表达量低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向BCMA和CD19的并联结构的CART结构及其应用。本发明联合针对CD19和BCMA双重肿瘤靶点，具有强特异性、高靶向性的特点，能够有效的提高且延长CART治疗的效果，针对表面抗原CD19和BCMA阳性的白血病或B细胞淋巴瘤有着更好的治疗效果，有效地避免单靶点的脱靶逃逸。
在本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，
(1)所述第一CAR含有靶向BCMA的抗原结合结构域，所述靶向BCMA的抗原结合结构域包括第一轻链可变区和重链可变区，
所述靶向BCMA的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第1-111位所示，
所述靶向BCMA的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第127-243位所示；并且
(2)所述第二CAR含有靶向CD19的抗原结合结构域，所述靶向CD19的抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，
所述靶向CD19的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第1-107位所示，
所述靶向CD19的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第123-242位所示；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留BCMA或CD19结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞，较佳地为T细胞。
在另一优选例中，所述第一CAR、第二CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述第一CAR的结构如式I所示：
L1-S1-H1-TM1-C1-CD3ζ(I)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L1为无或第一信号肽序列；
S1为靶向BCMA的抗原结合结构域；
H1为无或第一铰链区；
TM1为第一跨膜结构域；
C1为无或第一共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述靶向BCMA的抗原结合结构域包括靶向BCMA的Fab或抗体单链可变区(scFv)。
在另一优选例中，所述的靶向BCMA的抗体单链可变区序列的结构如式A1或A2所示：
VH1-VL1(A1)；或
VL1-VH1(A2)；
其中，VL1为抗BCMA抗体的轻链可变区；VH1为抗BCMA抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在另一优选例中，所述的VL1和VH1通过柔性接头相连。
在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的GGGGS所示的序列。
在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，VL1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中第1-111位所示，且VH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第127-243位所示。
在另一优选例中，所述靶向BCMA的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述第二CAR的结构如式II所示：
L2-S2-H2-TM2-C2-Z2(II)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L2为无或第二信号肽序列；
S2为靶向CD19的抗原结合结构域；
H2为无或第二铰链区；
TM2为第二跨膜结构域；
C2为第二共刺激信号分子；
Z2为无或源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域包括靶向CD19的Fab或抗体单链可变区(scFv)。
在另一优选例中，所述的靶向CD19的抗体单链可变区序列的结构如式B1或B2所示：
VH2-VL2(B1)；或
VL2-VH2(B2)；
其中，VL2为抗CD19抗体的轻链可变区；VH2为抗CD19抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
在另一优选例中，所述的VL2和VH2通过柔性接头相连。
在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的GGGGS所示的序列。
在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，VL2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9中第1-107位所示，且VH2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第123-242位所示。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述L1、L2各自独立地为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述L1为GM-CSF来源的信号肽；优选地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在另一优选例中，所述L2为CD8来源的信号肽；优选地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。
在另一优选例中，所述H1、H2各自独立地为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、或其组合。
在另一优选例中，所述H1为CD8来源的铰链区；优选地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
在另一优选例中，所述H2为CD28来源的铰链区。
在另一优选例中，所述TM1、TM2各自独立地为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD8a、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、CD3ε、或其组合。
在另一优选例中，所述TM1为CD8来源的跨膜区；优选地，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
在另一优选例中，所述TM2为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述C1、C2各自独立地为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、4-1BB、CD30、CD40、CD70、CD134、LIGHT、DAP10、CDS、ICAM-1、OX40、或其组合。
在另一优选例中，所述C1为4-1BB来源的共刺激信号分子；优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述C2为CD28来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的H2-TM2-C2氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的第一CAR和第二CAR，从而获得如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达靶向所述BCMA的第一CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达靶向CD19的第二CAR的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。
在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的第一CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码所述第二CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于不同载体。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，所述药物组合物还含有治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、其他CAR-T药物或化疗药物)。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞或如本发明第三方面所述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的疾病为肿瘤或癌症。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达CD19和/或BCMA的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达CD19和BCMA的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、胸腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述高表达CD19和/或BCMA的肿瘤为多发性骨髓瘤，较佳地为复发性和/或难治性多发性骨髓瘤。
在本发明的第五方面，提供了一种体外抑制肿瘤细胞的方法，包括：
将肿瘤细胞与如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第三方面所述的药物组合物接触，从而抑制所述肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自：髓系白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自：H929细胞、H929-CD19细胞、Nalm6细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括：
给需要治疗的对象施用安全有效量的如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第三方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法还包括给需要治疗的对象施用治疗癌症或肿瘤的其他药物。
在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达CD19和/或BCMA的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括同时表达CD19和BCMA的肿瘤。
在另一优选例中，所述高表达CD19和/或BCMA的肿瘤为多发性骨髓瘤，较佳地为复发性和/或难治性多发性骨髓瘤。
在本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一CAR和第二CAR，
(1)所述第一CAR含有靶向BCMA的抗原结合结构域，所述靶向BCMA的抗原结合结构域包括第一轻链可变区和重链可变区，
所述靶向BCMA的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第1-111位所示，
所述靶向BCMA的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第127-243位所示；并且
(2)所述第二CAR含有靶向CD19的抗原结合结构域，所述靶向CD19的抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，
所述靶向CD19的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第1-107位所示，
所述靶向CD19的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第123-242位所示；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留BCMA或CD19结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述第一CAR和第二CAR通过连接肽连接。
在另一优选例中，所述连接肽包括自剪切蛋白。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括T2A。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式III所示：
L1-S1-H1-TM1-C1-CD3ζ-Z-L2-S2-H2-TM2-C2-CD3ζ(III)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
Z为连接肽；
其余各元件如本发明第一方面所定义。
在本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第七方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)序列如SEQ ID NO:12所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与(c)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％，更佳地≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％、或≥99％)的多核苷酸；
(c)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述载体包括如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第九方面所述的多核苷酸的载体。
在另一优选例中，所述载体用于表达如本发明第七方面所述的融合蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了B19-CAR、CD19-CAR和BCMA-CAR结构模式图。
图2显示了K562-Luciferase细胞膜表面CD19抗原，BCMA抗原检测结果。
图3显示了H929-CD19-Luciferase细胞膜表面CD19抗原，BCMA抗原检测结果。
图4显示了B19-CART，CD19-CART和BCMA-CART细胞CAR阳性率检测结果。
图5显示了B19-CART，CD19-CART和BCMA-CART细胞CD3+，CD4+和CD8+细胞比例检测结果。
图6显示了B19-CART，CD19-CART和BCMA-CART细胞CD3+，CD4+和CD8+细胞比例检测结果。
图7显示了B19-CART，CD19-CART和BCMA-CART细胞表型。
图8显示了CART细胞体外扩增结果，B19 CAR-T细胞与靶抗原肿瘤细胞经过3轮次共培养刺激后依旧保持良好的增值能力。
图9显示了B19-CART、CD19-CART、BCMA-CART细胞因子释放。
图10显示了B19-CART、CD19-CART、BCMA-CART对H929-CD19-Luciferase细胞的杀伤。
图11显示了B19质粒图谱。
图12显示了BCMA-CART质粒图谱。
图13显示了CD19-CART质粒图谱。
图14显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效(Day 0分组给药前)。
图15显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效(Day 7给药后7天)。
图16显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效(Day 14给药后14天)。
图17显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效(Day 21给药后21天)。
图18显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效(Day 28给药后28天)。
图19显示了B19-CAR-T、CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T体内药效。
图20显示了各组动物实验期间的生存率曲线(纵坐标为存活动物的百分比，横坐标为日期)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，构建了同时表达BCMA和CD19的CAR T细胞，以及用于制备该细胞的BCMA和CD19嵌合抗原受体表达盒。意外地发现了本发明的双特异性CAR-T细胞的细胞因子释放和对靶细胞的杀伤力高于等量的CD19-CART和BCMA CAT，具有协同效果。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。“鼠源抗体”是由鼠类针对特异抗原产生的抗体，通常指小鼠B淋巴细胞产生的抗体。在大多情况下，所述鼠源抗体为杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。本申请的全人源抗体是从人源噬菌体抗体库筛选获得，其相对于鼠源抗体降低了免疫原性，更利于人体的治疗用途。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。在一些实施方案中，本申请所述“至少90％序列一致性”包括但不限于：至少95％、至少98％、至少99％或甚至100％序列一致性的情形。
BCMA
BCMA全称为B细胞成熟抗原，也称CD269，是III型跨膜蛋白，不含信号肽，含有富含半胱氨酸的胞外域，仅表达在成熟B细胞表面，在T细胞或单核细胞中都不表达，是一种重要的B细胞生物标记物。编码BCMA的基因属于TNF受体超家族成员，所述TNF受体优先在成熟B淋巴细胞中表达，对B细胞发育和自身免疫应答起着重要作用。所述TNF受体特异性结合肿瘤坏死因子(配体)超家族成员13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)，并导致NF-κB和MAPK8/JNK活化。所述TNF受体还与各种TRAF家族成员结合，介导细胞存活和增殖的信号。在多发性骨髓瘤中BCMA的表达增加，促增殖信号增强，最终癌化。因此，在多发性骨髓瘤细胞上BCMA的表达水平显著高于健康的浆细胞。
CD19
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域、与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。
如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。较佳地，接头为柔性接头，例如，所述接头为(G4S)n，其中n为1-4。
本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB和/或CD28信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD19和/或BCMA的抗体，较佳地为单链抗体。
在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。
如本文所用，“本发明的CAR-T”、“B19-CAR T”、均是指本发明第一方面的靶向BCMA和CD19的双特异性T细胞。
载体
本发明还提供了编码本发明CAR序列的DNA构建物。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性地使用基因组编辑技术来完成本发明，例如CRISPR-Cas9、ZFN或TALEN。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
DNA构建物进一步包含信号肽编码序列。优选地，该信号肽序列连接在抗原结合结构域的核酸序列上游。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞。转导的T细胞可以诱导CAR介导的T细胞反应。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞经基因修饰以表达本发明的CAR，并且将CAR-T细胞输注给需要的受体。输注的细胞能够杀死受体体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD19 scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可被治疗的适应疾病包括CD19相关的癌症或肿瘤，例如CD19阳性肿瘤或癌症。CD19相关的癌症或肿瘤可以包括实体瘤，特别是肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌或其组合。
用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述的激活和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的T细胞用于肿瘤的治疗。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗有患肿瘤风险的患者。因此，本发明提供治疗或预防肿瘤的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，GC76BBζ细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
a)本发明的B19-CART可以杀伤BCMA单阳性，CD19单阳性和BCMA/CD19双阳性的肿瘤细胞，扩大了CART细胞的治疗范围，提升B19-CAR-T的治疗效果。
b)本发明的B19-CART在细胞因子分泌和肿瘤细胞杀伤性上均优于单用CD19-CAR和BCMA-CAR。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1质粒构建
本实例选择BCMA的scFV抗体(克隆号C11D5.3)的序列SEQ ID NO:2和CD19的scFV抗体(克隆号FMC63)序列SEQ ID NO:15，分别同序列SEQ ID NO:1～6组合成BCMA-CART和CD19-CART，组合顺序按照SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示，B19-CART质粒序列如SEQ IDNO：12所示。质粒由苏州金唯智生物科技有限公司完BCMA-CART，CD19-CART和B19-CART序列合成及慢病毒载体质粒制备。
实施例2慢病毒制备
本实施例包装慢病毒采用HD转染试剂(Promega)试剂盒，具体为用含有10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞至最佳状态，慢病毒3代包装系统的包装质粒和表达质粒按比例1:1:2加入到15mL离心管中。然后加入对应量的/>HD转染试剂。混匀室温静置15min后加入到准备好的293T细胞中，并于48h和72h后收集细胞上清，纯化病毒，滴度检测和冻存备用。
实施例3T细胞激活
打开水浴锅，设置温度为37℃。从液氮灌中取出冻存的PBMC，迅速放入水浴锅中并快速晃动，在1min内使细胞溶液完全溶解；取1支15ml离心管，加入5ml 1×PBS，将细胞冻存悬液加入离心管，400g离心3min；用5ml 1×PBS重悬细胞，400g离心5min，弃上清，重复洗涤一次；用3ml X-VIVO-15培养基(培养基成分：X-VIVO-15+5％ FBS+1％ P/S+200IU/ml IL-2)重悬细胞，用Count Star细胞计数仪器计数。计算所需的磁珠用量(磁珠：T细胞＝2:1)，取600μl激活磁珠于1.5ml EP管中并放置于磁力架上。待磁珠全部被磁力吸附，吸走溶剂，加入1ml 1×PBS，离开磁力架将磁珠混匀，混匀后再次放于磁力架上，如此重复洗涤3次。将T细胞稀释到2e6个/ml，将洗涤好的磁珠加入T细胞中吹打混匀。取12孔板，每孔加入500μl混合液，T细胞铺板密度为1e6个/ml。每孔继续加入500μl培养基，轻轻摇晃12孔板，使溶液混合均匀，37℃，5％CO2培养24小时。
实验例4病毒感染
取出前一天铺好细胞的12孔板，每孔加入5μl促感试剂Polybrene(工作浓度：5μg/ml)；根据病毒滴度以及MOI＝3计算使用病毒量，设置一个对照孔(不加病毒)，每孔对应加入所需的BCMA-CART,CD19-CART和B19-CART病毒；每孔依次混匀，用锡箔纸包裹住12孔板避光，500g离心30min。将离心好的12孔板放入37℃，5％CO2孵育；孵育24h后，每孔更换培养液，加入新鲜培养液体积为2ml；每隔48～72h用完全培养基(培养基成分：X-VIVO-15+5％FBS+1％P/S+200U/ml IL-2)进行传代换液，CAR-T细胞传代培养密度保持在5e5个/ml～1e6个/ml；分别在培养day5、day7、day9、day12，收集CART细胞，用细胞计数仪计数。
实验例5CART阳性率、表型、分型和肿瘤细胞抗原表达流式检测
分别取培养的CAR-T细胞和肿瘤，用细胞计数仪计数，各取0.5-1e6个细胞至1.5mlEP管中，加入1ml 1×PBS混合，400g离心5min；弃上清，用100μL 1×PBS重悬，每管分别按照商业化检测抗体推荐使用量加入抗体，4℃避光孵育30-40min；加入1ml 1×PBS清洗细胞，400g离心5min，弃上清，加入200μL 1×PBS重悬，流式细胞仪上机检测。
本实例的结果显示在图2～7中。图2所示，K562细胞为CD19和BCMA抗原表达阴性，图4所示B19并联结构由于质粒长度的增加而导致转导效率相对下降，但是B19在T细胞中表达的比例仍然可以做到满足临床使用要求。图5～图6结果所示，B19转导后并未因为B19质粒增加而引起细胞表型和分型发生显著变化。
实验例6CAR-T细胞因子释放能力检测
1、效应细胞处理
取未转导T细胞、BCMA-CART、CD19-CART、B19-CART细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，400g离心3min；用5ml 1×PBS重悬细胞，400g离心5min，弃上清；重复步骤(2)，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count Star计数仪计数，调整细胞密度为1e6个/ml，备用。
2、靶细胞准备
收集生长状态良好的靶细胞和非靶细胞于15ml离心管中，400g离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，400g离心3min，弃上清；以含1％ FBS的X-VIVO-15重悬细胞，用Count Star计数并检测细胞活率，将细胞稀释到1e6个/ml浓度，备用。
3、效靶细胞混合
将处理好的效应细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养：将100μL靶细胞和100μLCAR-T细胞1:1混合加入96孔板中；按照CAR-T细胞：靶细胞为1:1共培养(每个样品2个重复)，放入37℃、5％CO2培养箱中共同培养20～24小时；取适量1.5ml EP管，每管分别加入50μL各组相应的细胞共培养上清，400g离心5min，收集30μL上清检测细胞因子释放情况。`
4、细胞因子检测
按照CBA检测试剂盒说明书要求，确定好需要检测的细胞因子及样品个数，准备捕获珠：取出待检测的细胞因子捕获珠瓶，用力混匀，每种珠子取出(待检测样品数+阴性对照数)×10μl/6的捕获珠子量，并将每种珠子进行涡轮震荡混匀；取n个1.5ml EP管(n＝样品数+对照数)向每管(样品、阴性对照)中加入10μl混合珠子；向各管中加入相应待测试剂(样品、对照)10μl；向各管中加入10μl PE Detection Reagent，充分混合均匀后，避光室温孵育3小时；孵育结束后，每个样品加入500μl wash buffer，充分混匀后，500g离心5min，弃上清；用200μl wash buffer重悬，500g离心5min洗涤，弃上清，用150μl wash buffer重悬样品；流式上机检测。
本实例的结果显示在图9中。如图9所示，两个Donor的数据显示，并联结构的B19-CART有释放IL2和TFN-α的能力显著高于单靶的BCMA-CART或CD19-CART细胞，IFN-γ的释放能力相对较高或相当，这提示并联结构的B19在治疗疾病方面可能会有更好的疗效。
实验例7CAR-T细胞杀伤能力检测
1.效应细胞准备
取未转导T细胞、BCMA-CART、CD19-CART、B19-CART细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，400g离心3min；用5ml 1×PBS重悬细胞，400g离心5min，弃上清；重复步骤(2)，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star计数，调整CAR-T细胞密度为4e5个/ml、2e5个/ml、1e5个/ml、0.5e5个/ml,效靶比为2:1、1:1、1:2、1:4(根据CAR-T阳性细胞来计算)，备用。
2.靶细胞准备
收集生长状态良好的靶细胞H929-Luc于15ml离心管中，400g离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，400g离心3min，弃上清；以含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star细胞计数仪计数并检测细胞活率，最终将细胞密度稀释到2e5个/ml，备用。
3.效靶细胞混合
将处理好的效应细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养：将50μL靶细胞和50μLCAR-T细胞混合加入96孔板中；37℃5％CO2共同培养18小时；培养结束后，每孔加入100μlONE-Glo TM luciferase Assay System检测底物，混匀后，静置5min。TECAN酶标仪上机检测(波长560nm)。
根据OD值计算杀伤率。
本实例的结果显示在图10中。如图10所示，B19-CART细胞对CD19阳性和BCMA双阳性的细胞的杀伤能力并没有因为并联表达而显示出明显降低，而CD19-CART细胞产品的临床获批，提示B19的临床上疗效可能会有较大提升。
实验例8CAR-T细胞细胞靶向增殖
1.效应细胞准备
取未转导T细胞、BCMA-CART、CD19-CART、B19-CART细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，400g离心3min；用5ml 1×PBS重悬细胞，400g离心5min，弃上清；重复步骤(2)，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star计数，调整细胞密度为2e5个/ml,效靶比为1:1(根据CAR-T阳性细胞来计算)，备用。
2.靶细胞准备
收集生长状态良好的靶细胞于15ml离心管中，400g离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，400g离心3min，弃上清；以含1％ FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star细胞计数仪计数并检测细胞活率，最终将细胞密度稀释到2e5个/ml浓度，备用。
3.效应细胞与靶细胞共培养
将处理好的效应细胞和靶细胞，按上述设置的效靶比加入12孔板中，每孔加入500μl靶细胞和500μl CAR-T细胞；加样完成后，轻轻摇晃12孔板，使细胞混合均匀；细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4.多轮肿瘤细胞刺激增殖
细胞共培养3～4天，待肿瘤细胞裂解完全后，分别收获CAR-T细胞，500g离心5min，细胞重悬于1ml含1％ FBS的X-VIVO-15培养基，对CAR-T细胞计数；取500μl重悬后的CAR-T细胞，与1e5个肿瘤细胞共培养进行第二轮刺激增殖，最后观察残存的肿瘤细胞并统计CAR-T细胞最终增殖倍数。
本实例的结果显示在图8中，如图8所示，B19-CART体外增殖能力与CD19-CART或BCMA-CART的增殖能力相当。B19-CART在双阳的肿瘤细胞系3次刺激后，表现出良好的增殖效果，提示B19-CART具有持久的杀伤肿瘤细胞的能力。
实施例9体内实验
图14-20中的体内实验数据显示：BCMA/CD19双靶CAR-T细胞与单靶向CD19-CAR-T、BCMA-CAR-T细胞体内药效比较，在不同的检测时间点均具有更好的杀伤肿瘤的作用，不同剂量双靶CAR-T细胞的肿瘤杀伤作用具有剂量依赖性作用。在给药后25天或27天，肿瘤+细胞溶剂组死亡3只；没有转染CAR的Mock T组死亡一只。其余组均未见动物死亡。显示CART具有延长动物生存时间的作用。实验期间，细胞保护液组、Mock-T组、CD19-CART组、BCMA-CART组、供试品低、中、高剂量组，各组动物体重维持增长，均未见显著性差异，也证明BCMA/CD19双靶CART细胞未见影响体重的毒副作用。
表1实验动物死亡信息表
动物号 组别 死亡时间 死亡前临床观察症状表现
Y22-8462 细胞保护液组 D27 被毛粗糙
Y22-8466 细胞保护液组 D25 弓背，被毛粗糙
Y22-8469 细胞保护液组 D27 弓背
Y22-8472 Mock-T组 D27 弓背，被毛粗糙
序列表
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SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9中，单下划线表示scFv的轻链可变区，双下划线标识scFv的重链可变区。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，
(1)所述第一CAR含有靶向BCMA的抗原结合结构域，所述靶向BCMA的抗原结合结构域包括第一轻链可变区和重链可变区，
所述靶向BCMA的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第1-111位所示，
所述靶向BCMA的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第127-243位所示；并且
(2)所述第二CAR含有靶向CD19的抗原结合结构域，所述靶向CD19的抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，
所述靶向CD19的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第1-107位所示，
所述靶向CD19的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第123-242位所示，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留AXL结合亲和力的衍生序列。
2.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述靶向CD19的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述靶向BCMA的抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.一种制备如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的第一CAR和第二CAR，从而获得如权利要求1所述的工程化的免疫细胞。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
6.一种如权利要求1所述的工程化的免疫细胞或如权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗疾病的药物或制剂。
7.一种体外抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：
将肿瘤细胞与如权利要求1所述的工程化免疫细胞、或如权利要求5所述的药物组合物接触，从而抑制所述肿瘤细胞。
8.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一CAR和第二CAR，
(1)所述第一CAR含有靶向BCMA的抗原结合结构域，所述靶向BCMA的抗原结合结构域包括第一轻链可变区和重链可变区，
所述靶向BCMA的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第1-111位所示，
所述靶向BCMA的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第127-243位所示；并且
(2)所述第二CAR含有靶向CD19的抗原结合结构域，所述靶向CD19的抗原结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，
所述靶向CD19的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第1-107位所示，
所述靶向CD19的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9的第123-242位所示，
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留BCMA或CD19结合亲和力的衍生序列。
9.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求8所述的融合蛋白。
10.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求9所述的多核苷酸。
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