CN113286811A - 改善过继性细胞疗法的效力和安全性 - Google Patents

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antigen
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本公开总体上涉及免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的制备和用途，该免疫效应细胞被基因改造成表达免疫受体(例如，嵌合抗原受体、合成的免疫受体、T细胞受体等)，以治疗与靶抗原表达相关的疾病。

Description

改善过继性细胞疗法的效力和安全性
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月30日提交的美国临时申请号62/712,102的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
序列表
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技术领域
本公开总体上涉及经基因改造成表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，用于治疗与肿瘤抗原表达有关的疾病的用途。
背景技术
使用免疫细胞、特别是经嵌合抗原受体(CAR)和重组TCR转导的T细胞进行过继性细胞转移(ACT)疗法，已经在血液学恶性肿瘤和实体瘤试验中显示出希望。但是，在细胞疗法产品的制造中存在高失败率，导致收率差，施用后产品的增殖、繁殖和组织(例如，肿瘤)穿透差，效力差，和成本增加。
还存在对效力改善和毒性降低的细胞疗法(例如，免疫细胞疗法，例如，CAR-T、SIR-T、Ab-TCR-T、TFP-T、TIL或TCR-T)的医学需求。过继免疫疗法的效力与T细胞在输入患者后的繁殖和增殖密切相关，其中过继免疫疗法使用表达常规和下一代嵌合抗原受体(例如，SIR、zSIR、AbTCR和TFP)，和天然的(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞)或经基因改造的T细胞受体(例如，NY-ESO-1TCR)的T细胞。因而，与过继转移的T细胞在其中繁殖失败或繁殖较差的患者相比，表现出过继转移的T细胞在体内稳健繁殖的患者具有显现疾病应答的更大的可能性。与血液学恶性肿瘤相比，输入的T细胞繁殖失败在实体瘤的过继免疫疗法中是一个更大的问题，并且可能在实体瘤对过继免疫疗法总体应答较差中起作用。改善过继转移的T细胞的体内繁殖策略包括施用淋巴细胞耗竭性化学疗法。例如，通常在输注过继转移的T细胞之前，将氟达拉滨和环磷酰胺施用给患者。但是，淋巴细胞耗竭性化学疗法的施用与显著的毒性(例如，全血细胞减少症、发热、感染风险、神经毒性)和死亡有关。另外，尽管施用了淋巴细胞耗竭性化学疗法，过继转移的T细胞仍繁殖失败。与过继转移的免疫细胞相关的一个问题是过度的刺激和增殖，这与毒性诸如细胞因子释放综合征、神经毒性(包括死亡)有关。另外，过继转移的T细胞的过度刺激和增殖已经与早期T细胞衰竭和疾病复发有关。
因此，需要改善细胞疗法产品(例如，免疫细胞疗法产品，例如，CAR-T、SIR-T、TFP-T、Ab-TCR-T和TCR-T产品等)的收率、繁殖、活化、增殖、繁殖、多样性、组织(例如，肿瘤)穿透性、持久性、效力和安全性。具体地，需要改善制造细胞疗法产品的新方法，以改善收率、减少制造时间、改善体内繁殖和效力以及降低成本。另外，需要这样的方法：其中过继转移的免疫细胞的繁殖、活化和增殖在其输注给受试者以后可以受到控制。最后，需要改善过继转移的细胞对疾病部位(例如，肿瘤)的穿透。
发明内容
本公开涉及一种改善细胞疗法产品(例如，免疫细胞疗法产品，例如，CAR-T、SIR-T、TFP-T、Ab-TCR-T和TCR-T产品等)的收率、繁殖、活化、增殖、繁殖、多样性、组织(例如，肿瘤)穿透性、持久性、效力和安全性的方法。本公开涉及通过使用动员的免疫细胞制造细胞疗法产品，来改善免疫细胞疗法(诸如经基因改造的CAR-T、TCR-T、SIR-T、Ab-TCR-T细胞疗法或NK细胞疗法)的收率、繁殖、活化、增殖、繁殖、多样性、组织(例如，肿瘤)穿透性、持久性和效力。在不同的实施方案中，所述方法包括在从供体收集免疫细胞(例如白细胞单采术)之前，动员免疫细胞。在不同的实施方案中，通过在收集免疫细胞之前，给从其收获免疫细胞的供体施用CXCR拮抗剂(例如，Mozibil或普乐沙福)、细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、非格司亭(Neulasta)或培非格司亭(Pegfilgastrim))、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如，环磷酰胺、多柔比星)或以上药剂的组合，来动员免疫细胞。在不同的实施方案中，通过使受试者(即供体)锻炼，来动员免疫细胞。在某些实施方案中，从自体供体，动员免疫细胞。在其它实施方案中，从同种异体的供体，动员免疫细胞。
本公开也至少部分地涉及，为了过继性细胞疗法的目的，而改善免疫细胞(例如，免疫T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL或NK细胞或CAR-NK细胞或巨噬细胞细胞或巨噬细胞-CAR细胞)的繁殖和/或活化(例如，体外和体内繁殖和/或活化)的方法。本文描述的一些实施方案提供了，通过将免疫细胞暴露于双特异性的或多特异性的衔接物(engager)来繁殖和/或活化免疫细胞，所述衔接物含有至少一个能够衔接免疫细胞的抗原结合结构域和至少一个能够衔接抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)(例如抗原缀合的珠子)的抗原结合结构域。
本公开也至少部分地涉及，为了过继性细胞疗法的目的，改善免疫细胞(例如，免疫T细胞，例如，CAR-T细胞CAR-NK细胞或巨噬细胞-CAR细胞)的繁殖和/或活化(例如，体外和体内繁殖和/或活化)的方法。本文描述的一些实施方案提供了，通过与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和/或细胞系一起培养，来繁殖和/或活化免疫细胞。示例性的从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞系包括、但不限于REC-1、MINO、JEKO-1和GRANTA-519。在一个优选的实施方案中，所述免疫细胞(例如，T细胞)表达靶向在B和浆细胞谱系细胞上表达的抗原(例如，CD19、CD20、CD22和BCMA)的CAR，并且通过与REC-1细胞一起共培养而繁殖/活化。
本公开也涉及，通过干扰和/或阻断TRAIL(TNFSF10)的活性，来预防或改善由疗法造成的或归因于该疗法的毒性的方法，其中疗法例如为细胞疗法或免疫疗法，例如，CAR-T疗法或兰妥莫单抗疗法。在某些实施方案中，所述疗法涉及活化免疫细胞(例如，T细胞)的双特异性的或多特异性的衔接物。示例性的活化免疫细胞的双特异性的衔接物包括兰妥莫单抗、CD3 x CD123 DART和BCMA x CD3 BiTE。在某些实施方案中，所述疗法是细胞疗法，其中细胞通常表达重组受体诸如嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，或其它转基因受体诸如T细胞受体(TCR)。
在某些实施方案中，通过施用TRAIL/TNFSF10拮抗剂来干扰或阻断TRAIL的活性。在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是抗体、抗体片段、小分子、肽或核酸。在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是结合TRAIL(TNFSF10)或其受体，死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)或死亡受体4(DR4或TNFRSF10A)的药剂，诸如抗体、抗体片段或非免疫球蛋白抗原结合支架诸如DARPIN、艾菲体(affibody)、艾菲啉(affilin)、艾德结合素(adnectin)、艾菲廷(affitin)、欧体(obodies)、重复体(repebody)、菲诺梅尔(fynomer)、α体(alphabody)、艾维梅尔(avimer)、艾崔梅尔(atrimer)、森特仁(centyrin)、前结合素(pronectin)、抗运载蛋白(anticalin)、库尼兹(kunitz)结构域、犰狳重复蛋白或其片段。
在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是可溶性TRAIL受体(例如，DR5-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO：2428，DR4-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO：2441，DcR1-SP-ECD-hIgFc；SEQ IDNO：2448；或DcR2-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO；2455)。在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是靶向TRAIL(例如，靶向TRAIL的shRNA或靶向TRAIL的gRNA)或其受体DR5(例如，靶向DR5的shRNA或靶向DR5的gRNA)和DR4(例如，靶向DR4的shRNA或靶向DR4的gRNA)的核酸。在本公开中提供了靶向TRAIL(SEQ ID NO：2060-2109)、DR4(SEQ ID NO：2111-2160)和DR5(SEQ IDNO：2162-2211)的gRNA的靶序列。在本公开中提供了靶向TRAIL(SEQ ID NO：2213-2216)、DR4(SEQ ID NO：2217-2220)和DR5(SEQ ID NO：2221-2224)的shRNA的靶序列。在本公开中也提供了靶向TRAIL(SEQ ID NO：2226-2230)、DR4(SEQ ID NO：2231-2233)和DR5(SEQ IDNO：2234-2237)的shRNA构建体的序列。
在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是小分子化合物，其干扰通过TRAIL与其受体DR5或DR4结合而被活化的信号转导通路。在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是改变TRAIL或其受体的表达的药剂。在某些实施方案中，所述TRAIL拮抗剂是下调TRAIL或其受体DR5和/或DR4的表达的药剂。作为一个例子，TRAIL拮抗剂可以在转录、转录后、翻译或翻译后水平上，干扰TRAIL、DR5和/或DR4的表达。在某些实施方案中，在细胞疗法产品的制造中包括所述TRAIL拮抗剂。在其它实施方案中，所述细胞疗法产品在施用给受试者之前暴露于TRAIL拮抗剂。在其它实施方案中，将所述TRAIL拮抗剂掺入细胞疗法产品中。在示例性实施方案中，可以将细胞疗法产品(例如，CAR-T细胞产品、TCR-T产品或TIL)遗传基因改造成表达a)可溶性TRAIL受体(例如，DR5-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO：2428，DR4-SP-ECD-hIgFc；SEQID NO：2441，DcR1-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO：2448；或DcR2-SP-ECD-hIgFc；SEQ ID NO；2455)；b)靶向TRAIL、DR5和/或DR5的scFV；c)靶向TRAIL、DR5或DR4的shRNA；d)靶向TRAIL、DR5或DR4的gRNA；e)异位过表达DcR1或DcR2；f)异位过表达DR5(例如，SEQ ID NO：2370、2391)或DR4(例如，SEQ ID NO：2275和2385)的显性负性突变体；或g)异位过表达融合蛋白，其含有与CD27、CD28、41BB、OX40、GITR或BCMA的跨膜和细胞溶质结构域融合的细胞外TRAIL-结合结构域(例如，SEQ ID NO：2429-2440)。
可以在施用细胞和/或免疫疗法产品(例如，CAR-T细胞或兰妥莫单抗)之前、同时或之后，将TRAIL拮抗剂施用给受试者。
在某些实施方案中，施用TRAIL拮抗剂，来预防细胞或免疫疗法产品的毒性。在其它实施方案中，在出现细胞或免疫疗法产品的毒性的早期征象时，先发制人地施用TRAIL拮抗剂。在其它实施方案中，在出现细胞疗法或免疫疗法产品的毒性的征象和症状以后，施用TRAIL拮抗剂。在其它实施方案中，施用TRAIL拮抗剂，来治疗细胞或免疫疗法产品的毒性的征象和症状。在其它实施方案中，除了预防和治疗细胞或免疫疗法产品的毒性以外，使用TRAIL拮抗剂来改善它们的效力，例如，改善细胞疗法产品的存活、增殖和繁殖，预防衰竭，和改善它们在体内的长期持久性和抗肿瘤活性。
本公开也涉及通过给受试者施用TRAIL拮抗剂(例如，本文描述的TRAIL拮抗剂，例如，干扰和/或阻断TRAIL(TNFSF10)或其受体DR5的活性的药剂)，来预防和治疗免疫障碍诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病的方法。具体地，本公开涉及，预防和治疗由巨噬细胞活化造成的免疫障碍的方法。在某些实施方案中，本公开涉及，预防和治疗由T细胞诱导的巨噬细胞活化造成的免疫障碍的方法。
本公开也提供了，导致来自CD27(TNFRSF7，基因ID：939；SEQ ID NO：2254)、CD28(基因ID：940；SEQ ID NO：2255)、41BB(TNFRSF9、CD137；基因ID：3604；SEQ ID NO：2256)、OX40(TNFRSF4，基因ID：7293；SEQ ID NO：2257)、DcR2(TNFRSF10D，基因ID：8793；SEQ IDNO：2251)、DcR1(TNFRSF10C，基因ID：8794；SEQ ID NO：2250)、BCMA(TNFRSF17，基因ID：608；SEQ ID NO：2259)和GITR(TNFRSF18；基因ID：8784；SEQ ID NO：2258)的集合的一个或多个基因的野生型或突变体形式的异位和/或过表达的组合物和方法，以及这样的组合物和方法用于修饰免疫效应细胞(例如，基因修饰的抗原特异性的T细胞，诸如CART细胞、TCR修饰的T细胞和SIR-T细胞)的表型、分化状态和功能活性的用途。
本公开提供了，破坏或下调来自BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的集合的一个或多个基因的表达，或者抑制其活性的组合物和方法，以及这样的组合物和方法用于修饰免疫效应细胞(例如，基因修饰的抗原特异性的T细胞，诸如CART细胞)的表型、分化状态、功能活性和毒性的用途。
本公开也提供了，导致来自BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、TRAIL(TNFSF10)、死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)或死亡受体4(DR4或TNFRSF10A)的集合的一个或多个基因的突变体形式的表达的组合物和方法，以及这样的组合物和方法用于修饰免疫效应细胞(例如，基因修饰的抗原特异性的T细胞，诸如CAR-T细胞、TCR修饰的T细胞和SIR-T细胞)的表型、分化状态、功能活性和毒性的用途。
具体地，本公开提供了用于支持细胞疗法产品(例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞和TCR修饰的T细胞)的治疗效果的方法和组合物。尽管不受理论约束，BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)基因中的一个或多个的一个或两个等位基因的活性抑制或破坏，会导致免疫细胞(例如，基因修饰的抗原特异性的T细胞，诸如CART细胞、TCR修饰的T细胞和SIR-T细胞)表型、分化、增殖、功能和/或毒性的变化。
具体地，本公开提供了，当单独或组合使用时，用EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、BRD9、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的化学抑制剂处理，来支持基因修饰的抗原特异性的T细胞(例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞和TCR修饰的T细胞和SIR-T细胞等)的治疗效果的方法和组合物。
因此，本公开提供了，经基因改造成表达抗原特异性受体诸如嵌合抗原受体(CAR)、TCR受体融合蛋白(TFP)、合成的免疫受体(SIR)、抗体-TCR、天然TCR或人工TCR的细胞(例如，细胞群体，诸如免疫效应细胞群体)，其中所述抗原特异性受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和任选的细胞内信号传导结构域，且其中所述细胞中的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2、JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、TRAIL和/或DR5中的一个或多个的表达和/或功能已经被减少、消除或改变。
在某些实施方案中，从在收集免疫细胞之前已经单独地或组合地施用了CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福)、细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim)、β2激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如环磷酰胺、多柔比星等)的供体，收集免疫细胞。
在某些实施方案中，所述供体是自体供体，而在其它实施方案中，所述供体是同种异体的供体。在一个方面，本公开的细胞是人细胞。在一个方面，本公开的细胞(例如，经基因改造的免疫效应细胞，例如，CART细胞)包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的抑制剂。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是：(1)基因编辑系统，其靶向编码EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、BRD9、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或其调节元件(例如，BRD9或其调节元件)的基因内的一个或多个位点；(2)基因编辑系统，其靶向编码EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、BRD9、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或其调节元件(例如，BRD9或它的5’或3’非翻译区或它的启动子)的RNA(例如，mRNA)内的一个或多个位点；3)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(4)其组合。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是基因编辑系统，其靶向编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或其调节元件(例如，BRD9或其调节元件)的基因或RNA内的一个或多个位点，且其中所述基因编辑系统选自：CRISPR/Cas9系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统和大范围核酸酶系统。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是基因编辑系统，其靶向编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或其调节元件(例如，BRD9或其调节元件)的基因/RNA内的一个或多个位点，且其中所述基因编辑系统是包含gRNA分子的CRISPR/Cas系统，所述gRNA分子包含与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的靶序列杂交的靶向序列。在某些实施方案中，所述靶向序列是在表4a和4b中列出的靶向序列。在某些实施方案中，所述gRNA分子具有在表8中列出的序列。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5特异性的siRNA或shRNA，或编码所述siRNA或shRNA的核酸。在某些实施方案中，所述siRNA或shRNA包含与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的mRNA序列互补的序列，例如包含在表5中列出的shRNA的靶序列。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是小分子。在某些实施方案中，所述小分子是在表6中列出的分子。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是蛋白，例如，是BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的显性失活的结合配偶体，或编码所述BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的显性失活的结合配偶体的核酸。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，其中所述抑制剂是蛋白，例如，是显性失活的(例如，催化上无活性的)BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，或编码所述显性失活的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的核酸。在SEQ ID NO：2260和2318-2330中提供了示例性的DR5的显性负性突变体。
在一个方面，本公开提供了一种改变免疫细胞(例如，表达免疫受体的细胞，例如，前述权利要求中的任一项的细胞，例如，表达CAR19的细胞)的表型、分化状态和/或治疗效果的方法，所述方法包括降低所述细胞中的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的水平或活性的步骤。在某些实施方案中，所述步骤包括，使所述细胞与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂接触。在某些实施方案中，本公开的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂选自：(1)基因编辑系统，其靶向编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或它的对应调节元件的基因/RNA内的一个或多个位点；(2)核酸(例如，siRNA或shRNA)，其抑制BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达；(3)蛋白(例如，显性失活的，例如，催化上无活性的)BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，或BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的结合配偶体；(4)小分子，其抑制BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达和/或功能；(5)编码(1)-(3)中的任一种的核酸；和，(6)(1)-(5)的任意组合。
在一个方面，本公开提供了一种改变免疫细胞(例如，表达免疫受体的细胞，例如，前述权利要求中的任一项的细胞，例如，表达CAR19的细胞)的表型、分化状态和/或治疗效果的方法，所述方法包括降低所述细胞中BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的水平或活性的步骤。在某些实施方案中，所述步骤包括，使所述细胞与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂接触。在某些实施方案中，所述接触离体发生。在某些实施方案中，所述接触在体内发生。在某些实施方案中，在将编码免疫受体的核酸递送进细胞中之前，所述接触在体内发生。在某些实施方案中，在已经将所述细胞施用给有此需要的受试者之后，所述接触在体内发生。
在一个方面，本公开提供了一种增加免疫细胞(例如，表达免疫受体的细胞，例如，前述权利要求中的任一项的细胞，例如，表达CAR19的细胞)的多样性的方法，所述方法包括降低所述细胞中BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的水平或活性的步骤。在某些实施方案中，所述步骤包括使所述细胞与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂接触。在某些实施方案中，所述接触离体发生。在某些实施方案中，所述接触在体内发生。在某些实施方案中，在将编码免疫受体的核酸递送进细胞中之前，所述接触在体内发生。在某些实施方案中，在已经将所述细胞施用给有此需要的受试者之后，所述接触在体内发生。
在一个方面，本公开提供了一种处理有此需要的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的如本文中所述的细胞，例如，包含免疫受体的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，和任选地，给所述受试者施用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。在某些实施方案中，在免疫或细胞疗法开始之前，所述受试者接受使用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的预处理。在某些实施方案中，所述受试者接受BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，和免疫和/或细胞疗法的同时处理。在某些实施方案中，在施用免疫和/或细胞疗法以后，所述受试者接受使用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的处理。
在某些实施方案中，所述受试者患有与肿瘤抗原表达有关的疾病，例如，增殖性疾病、癌变前病症、癌症和与肿瘤抗原表达有关的非癌症相关适应症。
本公开提供了本文所述的组合物和/或方法用于治疗癌症的用途。
本公开提供了用于治疗受试者的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，以及JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的突变体，以及CD28(基因ID：940)、41BB(TNFRSF9、CD137；基因ID：3604)、OX40(TNFRSF4，基因ID：7293)、DcR2(TNFRSF10D，基因ID：8793)、DcR1(TNFRSF10C，基因ID：8794)、BCMA(TNFRSF17，基因ID：608)和GITR(TNFRSF18；基因ID：8784)的野生型和突变体，其中所述受试者已经接受、正在接受或将要接受免疫和/或细胞疗法。
本公开进一步提供了一种制造免疫细胞(例如，免疫效应细胞)的方法，所述方法包括将编码免疫受体的核酸引入免疫效应细胞，使得所述核酸(或其编码免疫受体的部分)整合进细胞的基因组中的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因内(例如，在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因的内含子或外显子内)，使得BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达和/或功能减少或消除。
本公开进一步提供了一种制造免疫细胞(例如，用于过继性细胞疗法的免疫效应细胞)的方法，所述方法包括离体使所述免疫细胞单独地或组合地与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂接触。在某些实施方案中，所述抑制剂是BRD9抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂是TRAIL抑制剂。
本公开进一步提供了一种制造免疫细胞(例如，免疫效应细胞，例如，用于过继性细胞疗法)的方法，所述方法包括，在收集(即白细胞单采术)免疫细胞用于制造之前，给从其收获免疫细胞的供体单独地或组合地施用CXCR拮抗剂诸如Mozibil(普乐沙福)、细胞因子(例如，G-CSF或GM-CSF)、β2激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，Src激酶抑制剂，例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如，环磷酰胺、多柔比星等)。本公开进一步提供了一种制造用于过继性细胞疗法的免疫细胞的方法，所述方法包括，使从其收获免疫细胞的供体进行锻炼，从而使心率增加至比供体在静止时的心率高约30％(例如，40％、50％、60％、80％、100％、125％、150％)。
本公开进一步提供了一种载体，其包含编码免疫受体的序列，和编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的序列。在某些实施方案中，BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂是：(1)基因编辑系统，其靶向编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或它的对应调节元件的基因/RNA内的一个或多个位点；(2)核酸(例如，siRNA或shRNA)，其抑制BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达；(3)蛋白(例如，显性失活的，例如，催化上无活性的)BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，或BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的结合配偶体；和(4)编码(1)-(3)中的任一种的核酸，或它们的组合。在某些实施方案中，编码免疫受体的序列和编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的序列被2A位点隔开。
本公开进一步提供了一种基因编辑系统，其对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件(例如，BRD9、BCOR、PRDM1、TRAIL基因或其调节元件)的序列是特异性的。在某些实施方案中，所述基因编辑系统对BRD9基因或它的RNA的序列具有特异性。在某些实施方案中，所述基因编辑系统是：(1)CRISPR/Cas基因编辑系统，(2)锌指核酸酶系统，TALEN系统和大范围核酸酶系统。在某些实施方案中，所述基因编辑系统是CRISPR/Cas基因编辑系统。在某些实施方案中，所述基因编辑系统包含：含有对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件具有特异性的靶向序列的gRNA分子，和Cas9蛋白；含有对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件具有特异性的靶向序列的gRNA分子，和编码Cas9蛋白的核酸；编码gRNA分子和Cas9蛋白的核酸，所述gRNA分子含有对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件具有特异性的靶向序列；或编码gRNA分子的核酸和编码Cas9蛋白的核酸，所述gRNA分子含有对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件具有特异性的靶向序列。在某些实施方案中，所述基因编辑系统进一步包含模板DNA。在某些实施方案中，所述模板DNA包含编码免疫受体(例如，如本文中所述的免疫受体)的核酸序列。
在某些实施方案中，本公开也提供了一种用免疫细胞疗法治疗或预防受试者中的疾病的方法，所述方法包括下述步骤：i)检查造成疾病的细胞或与疾病相关的细胞(例如，癌细胞或基质细胞)中的共刺激性受体的配体的表达；ii)鉴定在造成疾病的细胞或与疾病相关的细胞(例如，癌细胞或基质细胞)中表达的共刺激性受体的配体；iii)增强一种或多种共刺激性受体在免疫细胞的表达，其中共刺激性受体的配体在造成疾病的细胞或与疾病相关的细胞中表达；iv)给所述受试者施用来自步骤(iii)的免疫细胞以预防或治疗疾病。在某些实施方案中，在mRNA水平，检查造成疾病的或与疾病相关的细胞或组织中的配体的表达。在mRNA水平检查基因表达的方法是本领域已知的，并且包括，但不限于，RT-PCR、RNA印迹、RNA-Seq和基因表达微阵列等。在某些实施方案中，在蛋白水平检查造成疾病的或与疾病相关的细胞或组织中的配体的表达。检查蛋白的表达的方法是本领域已知的，并且包括，但不限于，免疫组织化学、流式细胞计量术、组织微阵列、免疫印迹法和质谱法等。在某些实施方案中，所述配体由TRAIL、CD70、CD80、CD86、41BBL、OX40L、GITRL和TNFSF13B/TALL-1/BAFF中的一种或多种组成，但不限此。在某些实施方案中，所述共刺激性受体由以下项中的一种或多种组成或者包含以下项中的一种或多种，但不限此：含有DcR1、DcR2、DR4、DR5、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA的细胞外配体结合结构域的受体。在某些实施方案中，所述共刺激性受体由以下项中的一种或多种组成或者包含以下项中的一种或多种，但不限此：DcR1、DcR2、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA。在某些实施方案中，所述共刺激性受体由以下项中的一种或多种组成或者包含以下项中的一种或多种，但不限此：含有DcR1、DcR2、DR4、DR5、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA的细胞外配体结合结构域的受体，所述细胞外配体结合结构域经由跨膜结构域与共刺激性受体(例如，CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA)的细胞溶质结构域融合。表1提供了几种示例性融合蛋白的SEQ ID NO，所述融合蛋白含有与CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA的细胞溶质结构域融合的DR5、DR4、DcR1和DcR2的细胞外结构域。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL。在一个示例性实施方案中，所述CAR-T细胞表达靶向CD19的CAR并共表达CD27，其中造成疾病的和/或与疾病相关的细胞表达CD19和CD70。在另一个示例性实施方案中，CAR-T细胞表达靶向间皮素的CAR并共表达DcR1，其中造成疾病的和/或与疾病相关的细胞表达间皮素和TRAIL。在另一个示例性实施方案中，CAR-T细胞表达靶向Her2的CAR并共表达41BB，其中造成疾病的和/或与疾病相关的细胞表达Her2和41BBL。在另一个示例性实施方案中，T细胞表达靶向NYESO-1/HLA-A2复合物的TCR并共表达OX40，其中造成疾病的和/或与疾病相关的细胞表达NYESO-1/HLA-A2和OX40L。在一个示例性实施方案中，所述NK-T细胞表达靶向CD19的CAR并共表达CD27，其中造成疾病的和/或与疾病相关的细胞表达CD19和CD70。
本公开进一步提供了一种用于离体制备免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如表达免疫受体的细胞，例如，CAR-T、SIR-T、TCR-T细胞等)的组合物，其包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，例如，BRD9、CBFb和/或YY1抑制剂。所述抑制剂可以单独地或组合地使用。
本公开进一步提供了一种用于离体制备免疫效应细胞，诸如表达免疫受体的细胞(例如，CAR-T、SIR-T、TCR-T细胞等)的不同库的组合物，其包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，例如，BRD9、CBFb和/或YY1抑制剂。所述抑制剂可以单独地或组合地使用。
表6呈现了可以用在本公开的方法中的、靶向不同基因的各种示例性化学抑制剂的靶标、名称和Cas编号。
本公开进一步提供了包含本文描述的一种或多种细胞的细胞群体，其中，与不包含其中BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5在所述细胞中的表达和/或功能已经减少或消除的一种或多种细胞的细胞群体相比，所述细胞群体包含更高百分比的干样T细胞或Tscm细胞(例如，CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞)。
本公开也至少部分地涉及，为了过继性细胞疗法的目的，改善免疫细胞(例如，免疫效应T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL)的繁殖和/或活化(例如，体外和体内繁殖和/或活化)的方法。本文描述的一些实施方案提供了，通过将免疫细胞暴露于双特异性的或多特异性的衔接物来繁殖和/或活化免疫细胞，所述衔接物含有能够衔接免疫细胞的至少一个抗原结合结构域(例如，第一抗原结合结构域)，和能够衔接抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)(例如抗原缀合的珠子)的至少一个抗原结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)。在某些实施方案中，所述APC是造血细胞。在某些实施方案中，所述双特异性的衔接物是双特异性抗体，例如，兰妥莫单抗。在某些实施方案中，所述方法进一步包括将所述免疫细胞暴露于能够活化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)上的共刺激性受体(例如，CD28、41BB、CD27等)的激动剂，诸如抗体(例如，Utomilumab)或配体(例如，41BBL)。
在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含能够结合和活化T细胞的T细胞受体(TCR)复合物的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化TCR复合物的CD3亚基的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化TCR复合物的CD3-ε亚基的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化在T细胞上提供共刺激的受体(即，共刺激性受体)的至少一个结合结构域。所述双特异性衔接物可以结合的示例性共刺激性受体包括CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物，在APC或APS存在下，活化通过TCR复合物的信号传导。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物，在APC或APS存在下，经由通过共刺激性受体的信号传导活化T细胞。
在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含能够结合造血细胞的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含能够结合淋巴样谱系造血细胞的至少一个结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含能够结合B-淋巴样谱系造血细胞的至少一个结合结构域。所述双特异性的或多特异性的衔接物结合的示例性B-谱系淋巴样细胞包括未成熟的B细胞、成熟的B细胞和浆细胞，和它们的组合。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含能够结合在B-淋巴样谱系造血细胞上表达的抗原的至少一个结合结构域，例如，第二结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD19。在某些实施方案中，所述双特异性的衔接物是兰妥莫单抗。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD22。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD20/MS4A1。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD23。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合BCMA。在某些实施方案中，所述双特异性的衔接物是BI 836909(AMG 420)。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CS1/SLAMF7。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD138。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合CD123。在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个结合结构域(例如，第二抗原结合结构域)结合MPL。
在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含：能够结合T细胞上的活化受体(例如，CD3)和/或共刺激性受体(例如，CD28、41BB等)的至少一个结合结构域，和能够结合非造血细胞(例如，乳房细胞、肺细胞、结肠细胞、皮肤细胞等)或细胞系(例如，MCF7、H460、SW480等)的至少一个结合结构域。
在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化NK细胞受体的至少一个结合结构域，和能够结合在APC或APS上表达的抗原的至少一个结合结构域。
在某些实施方案中，T细胞的活化和繁殖包括，在表达同源配体(例如抗原)的细胞存在下，将它们暴露于结合T细胞活化或共刺激性受体(例如，TCR或CD28)的双特异性的或多特异性的衔接物(例如，抗体)，其中同源配体被双特异性的或多特异性的衔接物(例如，抗体)的第二抗原结合结构域结合。
在某些实施方案中，T细胞的活化和繁殖包括，在表达同源配体(例如抗原或抗-独特型抗体)的固体底物存在下，将它们暴露于结合T细胞活化或共刺激性受体(例如，TCR或CD28)的双特异性的或多特异性的衔接物(例如，抗体)，其中同源配体被双特异性的或多特异性的衔接物(例如，抗体)的第二抗原结合结构域结合。
在某些实施方案中，所述方法包括，通过将它们暴露于两种不同的双特异性的或多特异性的衔接物，来活化/繁殖免疫细胞(例如，T细胞)，其中第一种双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个抗原结合结构域结合和活化活化性细胞受体(例如，T细胞受体或CD3受体复合物)，且第二种双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个抗原结合结构域结合和活化共刺激性受体(例如，41BB或CD28)，且两种双特异性的或多特异性的衔接物中的至少一个抗原结合结构域结合在APC例如造血细胞(例如，B细胞、浆细胞或淋巴瘤细胞系等)或非造血细胞(例如，乳房细胞、肺癌细胞系等)或APS(例如，CD19-胞外结构域包被的珠子或CD19抗-个体基因型抗体包被的珠子)上表达的至少一种抗原(例如，CD19、CD22、CD20/MS4A1和/或BCMA等)。
在某些实施方案中，从来自受试者(例如，癌症患者)的血液样品，获得(例如，得到)在本文所述的方法中使用的免疫细胞群体。在一个实施方案中，通过血液成分分离术获得免疫细胞群体。在一个实施方案中，通过血液成分分离术从受试者获得免疫细胞群体，所述受试者在收集免疫细胞之前已经进行了锻炼或施用了CXCR拮抗剂(例如，Mozibil或普乐沙福)、细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim)、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如，环磷酰胺、多柔比星)或以上药剂的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括免疫效应细胞，例如，如本文中所述的免疫效应细胞。示例性的免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、天然杀伤T(NKT)细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括外周血单核细胞(PBMC)或脐带血细胞、组织驻留的淋巴细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、骨髓驻留的单核细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括原代T细胞或淋巴细胞子集，包括，例如，无能T细胞、原初T细胞、T-调节性细胞、Th-17细胞、T干细胞、组织驻留的T细胞、肿瘤浸润性T细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括，已经被基因改造成表达靶向特定抗原的天然或合成受体的T细胞。一种示例性的天然受体包括靶向NY-ESO1或WT1的T细胞受体(TCR)。示例性的合成受体包括CAR或下一代CAR(例如，K13-CAR、SIR、zSIR、Ab-TCR、TFP等)或重组TCR(rTCR)。
本公开进一步涉及新颖的核酸构建体和它们整合进入免疫细胞中。具体地，本公开涉及以下发现：任选地被基因改造成表达至少一种免疫受体(例如，CAR、SIR、AbTCR、TFP、TCR等)和一种或多种信号传导分子(例如，JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF)或其突变形式的免疫细胞(优选T细胞，例如，原代人T细胞)，具有使这些细胞非常适合用于人或动物疗法中的性能。在某些实施方案中，编码免疫受体和信号传导分子或其变体的一个核酸构建体或多个构建体，可以是在相同的或不同的载体上。在某些实施方案中，在表达内源性免疫受体(例如，TCR)的免疫效应细胞中，表达所述信号传导分子或其变体。在某些实施方案中，在表达外源(或经基因改造的)免疫受体(例如，CAR、SIR、AbTCR、TFP或cTCR等)的免疫效应细胞中，表达所述信号传导分子或其变体。在某些实施方案中，在免疫效应细胞中，瞬时表达所述信号传导分子或其变体。在某些实施方案中，在免疫效应细胞中稳定地表达所述信号传导分子或其变体。
表1
Figure BDA0002987268390000151
Figure BDA0002987268390000161
Figure BDA0002987268390000171
表2
Figure BDA0002987268390000172
附图说明
图1描绘了使用不同的CD19 CAR-T细胞产品对稳定表达LucPPe的RAJI细胞进行的斗牛士(Matador)细胞毒性测定，其中不同的CD19 CAR-T细胞产品使用普乐沙福(Perixafor)动员的血细胞产生。
图2描绘了使用不同的CD19 CAR-T细胞产品对稳定表达LucPPe的Nalm6细胞进行的Matador细胞毒性测定，其中不同的CD19 CAR-T细胞产品使用Perixafor动员的血细胞产生。
图3描绘了TRAIL抗体对PMA诱导的IL1α产生的影响。
图4描绘了，在表达CD19的BV173细胞存在下与CD19 CAR-T细胞一起共培养时，TRAIL抗体阻断THP1细胞的IL1α产生。
图5描绘了，在表达CD19的BV173细胞存在下与CD19 CAR-T细胞一起共培养时，TRAIL抗体阻断PMA分化的THP1细胞的IL1α产生。
具体实施方式
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
术语“一个”、“一种”和“该/所述”表示一个/种或超过一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法对象。作为例子，“一个要素”是指一个要素或超过一个要素。
当涉及诸如量、持续时间之类的可测量值时，术语“约”意在涵盖指定值的±20％的变化，或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％，或在某些情况下±0.1％，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可替换地“CAR”表示一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种，其当在免疫效应细胞中时，给细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性和细胞内信号的产生。
在某些实施方案中，CAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(在本文中也被称作“细胞内信号传导结构域”)，所述细胞质信号传导结构域包含从如下定义的刺激性分子和/或共刺激分子衍生出的功能性信号传导结构域。在某些方面，多肽的集合彼此邻接。在某些实施方案中，多肽的集合包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包含，从至少一种如下定义的共刺激分子衍生出的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自本文描述的共刺激分子，例如，4lBB或4-1BB(即，CD137)、CD27、GITR、OX40、BCMA和/或CD28。在一个方面，CAR包括含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白，所述细胞内信号传导结构域包含从刺激性分子衍生出的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包括含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白，所述细胞内信号传导结构域包含从共刺激分子衍生出的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生出的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含含有细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白，所述细胞内信号传导结构域包含从一种或多种共刺激分子衍生出的两个功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生出的一个功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包括含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白，所述细胞内信号传导结构域包含从一种或多种共刺激分子衍生出的至少两个功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生出的一个功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基端(N-端)的任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原结合结构域的N-端的前导序列，其中所述前导序列任选地在CAR的细胞加工和向细胞膜的定位过程中，从抗原结合结构域(例如，scFv)切割下来。本文中使用的术语“CAR”或“CARs”也涵盖给细胞赋予抗原特异性的较新方案，包括、但不限于抗体-TCR嵌合分子或AbTCR(WO 2017/070608 A1)、TCR受体融合蛋白或TFP(WO 2016/187349A1)、嵌合T细胞受体或cTCR和合成的免疫受体(PCT/US17/64379)。
包含靶向特定肿瘤标记(maker)X(诸如本文描述的那些)的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR，也被称作XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR被称作CD19CAR。
术语“信号传导结构域”表示如下起作用的蛋白的功能部分：通过产生第二信使或通过对此类信使做出响应而作为效应子起作用，在细胞内传递信息以经由限定的信号传导通路调节细胞活性。
术语“共刺激配体”或“共刺激性受体的配体”表示与共刺激性受体(例如，本文表达的共刺激性受体，例如，DcR1、DcR2、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR、BCMA)结合的蛋白或多肽。示例性的共刺激配体包括CD70、CD80、CD86、41BBL、OX40L、GITRL、BAFF和TRAIL。共刺激配体与其在免疫细胞上的相应受体的结合，可导致信号转导通路的启动，该信号转导通路促进免疫细胞的增殖、活化、细胞因子分泌和/或分化。一些共刺激配体(诸如TRAIL)可能结合超过一种受体。因此，TRAIL结合至少4种受体DcR1、DcR2、DR4和DR5。已知TRAIL与DcR2的结合会活化NF-κB通路，而不诱导细胞死亡。相反，已知TRAIL与DR4和DR5的结合会活化NF-κB以及细胞死亡(取决于细胞背景)。
本文中使用的术语“抗体”表示，从特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子衍生出的蛋白或多肽序列。抗体可以是多克隆的或单克隆的、多链的或单链的或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”表示抗体的至少一个部分，其保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的例子包括，但不限于：Fab、Fab'、F(ab'h、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、直链抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、从抗体片段(诸如包含通过在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体，和分离的CDR或抗体的其它表位结合片段。
术语“scFv”表示融合蛋白，其包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段，其中所述轻链可变区和重链可变区是连续连接的，例如经由合成的接头，例如短的柔性多肽接头连续连接，并且能够被表达为单链多肽，并且其中scFv保留了衍生出它的完整抗体的特异性。除非详细说明，否则本文中使用的scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，关于多肽的N-端和C-端末端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
本文中使用的术语“结合结构域”或“抗体分子”表示，包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一个免疫球蛋白可变结构域序列具有对第一表位的结合特异性，且所述多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二个免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体具有对不超过两种抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于，具有对第一表位的结合特异性的第一个免疫球蛋白可变结构域序列，和具有对第二表位的结合特异性的第二个免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”表示，以它们天然存在的构象，存在于抗体分子中的两种多肽链中较大的一条，且其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”表示，以它们天然存在的构象，存在于抗体分子中的两种多肽链中较小的一条。κ(K)和λ(A)轻链表示两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”表示使用重组DNA技术产生的抗体，例如，由细菌噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。
术语“抗原”或“Ag”表示引起免疫应答的分子。
术语“抗癌作用”表示可以通过多种方式表现出的生物学效应，包括、但不限于，例如，肿瘤体积的减小，癌细胞数量的减少，转移灶数量的减少，预期寿命的增加，癌细胞增殖的减少，癌细胞存活期的减少，或与癌性病症相关的各种生理学症状的改善。“抗癌作用”也可以表现为肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防癌症在第一个位置发生的能力。术语“抗肿瘤作用”表示可以通过多种方式表现出的生物学效应，包括、但不限于，例如，肿瘤体积的减小，肿瘤细胞数量的减少，肿瘤细胞增殖的减少，或肿瘤细胞存活期的减少。
术语“自体”表示源自同一个体的任何物质，它在以后将其重新引入该个体。
术语“同种异体的”表示源自与要引入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。
术语“癌症”表示特征在于异常细胞的失控生长的疾病。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换地使用，例如，两个术语都包括实体和液体肿瘤，例如，弥散的或循环的肿瘤。本文中使用的术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前的，以及恶性癌症和肿瘤。
如本文所使用的术语“源自”指示第一分子与第二分子之间的关系。它通常表示第一分子和第二分子之间的结构相似性，且不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在源自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，从而具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它不暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它不意味着，为了提供细胞内信号传导结构域，必须以CD3ζ序列开始并删除不希望的序列，或施加突变，以达到细胞内信号传导结构域。
短语“如本文中所述的与肿瘤抗原表达有关的疾病”包括、但不限于，如本文中所述的与肿瘤抗原表达有关的疾病，或如本文中所述的与表达肿瘤抗原的细胞有关的病症，包括、例如，增殖性疾病诸如癌症或恶性肿瘤，或癌变前病症诸如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或如本文中所述的与表达肿瘤抗原的细胞有关的非癌症相关适应症。如本文中所述的与肿瘤抗原表达有关的非癌症相关适应症包括、但不限于，例如自身免疫病(例如，狼疮)、炎症性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在某些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，随后产生基本上不可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“保守的序列修饰”表示不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特性的氨基酸修饰。
术语“刺激”表示通过刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR的情况下为肿瘤抗原)的结合而诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，例如，但不限于，经由TCR/CD3复合物的信号转导，或经由适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变。
术语“刺激性分子”表示由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供对于免疫细胞信号传导通路的至少一些方面，以刺激性方式调节免疫细胞活化的细胞质信号传导序列。在一个方面，该信号是初级信号，其例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而起始，并且其导致介导T细胞应答，包括、但不限于，增殖、活化、分化等。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也被称作“初级信号传导结构域”)可以含有被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM的信号传导基序。在本公开的一种具体CAR中，本公开的任意一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如，CD3-ζ的初级信号传导序列。在本公开的一种具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO(DNA)：431和SEQ ID NO(蛋白)：1858提供的序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。在本公开的一种具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO(DNA)：432和SEQ ID NO(蛋白)：1859中提供的序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”表示呈递可以被免疫细胞识别的抗原的任何细胞，诸如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)或细胞系(例如，癌细胞系，例如，乳腺癌细胞系、例如，MCF7细胞系)。APC可能会在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)形成复合物的外来抗原。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将其呈递给T细胞。APC可独立于MHC呈递抗原。作为一个例子，表达CD19的B淋巴细胞或B细胞系(例如，REC-1)可以充当表达CAR，例如针对CD19的FMC63-BBz CAR(SEQ ID NO：2822)的T细胞的APC。APC可以呈递，在双特异性的或多特异性的衔接物存在下，被免疫细胞识别的抗原。作为一个例子，表达CD19的B淋巴细胞或B细胞系(例如，REC-1)可以在CD3 xCD19双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗)存在下，充当T细胞的APC。APC可以是正常细胞、永生化的细胞或癌细胞。APC可以是细胞系。在表7D中显示了几种抗原的SEQ ID NO，所述抗原可以在细胞的表面上表达，以充当用于本公开的方法的抗原呈递细胞。
术语“抗原呈递底物”或“APS”表示，呈递可被免疫细胞识别的抗原的任何底物诸如珠子、微珠、琼脂糖珠子、磁珠、膜、平板、气泡、纳米颗粒。APS可能会在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)形成复合物的外来抗原。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APS可独立于MHC呈递抗原。作为一个例子，用CD19胞外结构域包被的珠子或平板可以充当表达CAR，例如针对CD19的FMC63-BBz CAR(SEQ ID NO：2822)的T细胞的APS。APS可能呈递，在双特异性的或多特异性的衔接物存在下，被免疫细胞识别的抗原。作为一个例子，用CD19胞外结构域(ECD)包被的珠子或平板可以在CD3 x CD19双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗)存在下，充当T细胞的APS。在表7D中显示了几种抗原的SEQ ID NO，所述抗原可以缀合至底物(例如珠子或膜)以充当用于本公开的方法的抗原呈递底物。
本文中使用的术语“细胞内信号传导结构域”表示分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号，促进含CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能。
术语“共刺激分子”表示在T细胞上的相应结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，例如，但不限于，增殖。
“共刺激细胞内信号传导结构域”可以是共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包含其来源分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。
“CXCR4信号传导抑制剂”是外源因子，诸如药物化合物或分子，其抑制或阻止CXCR4通过其配体C-X-C基序配体12(CXCL12)的活化，从而阻断或抑制细胞中的CXCR4信号传导。
使用标准的在体外或离体CXCL12/CXCR4测定法(诸如趋化性或增加的游离细胞内Ca2+)，可以鉴定合适的CXCR4信号传导抑制剂。例如，当细胞表面上的CXCR4暴露于CXCL12时，缺乏细胞内游离Ca2+的快速、短暂增加可能指示CXCR4信号传导抑制剂的存在。
CXCR4信号传导抑制剂的优选例子包括、但不限于CXCR4拮抗剂和/或CXCL12拮抗剂。
在本公开中，将“CXCR4拮抗剂”定义为这样的分子：其通过与CXCR4结合或相互作用而抑制CXCR4信号传导，以防止或抑制CXCL12对CXCR4的结合和/或活化，从而抑制CXCR4信号传导。CXCR4拮抗剂的优选例子包括、但不限于抗-CXCR4抗体，其例子是本领域众所周知的。例如，优选的抗-CXCR4抗体包括、但不限于BMS-936564/MDX-1338(Kuhne等人(2013)Clin Cancer Res 19(2)357-366)。
另外，CXCR4拮抗剂包括肽，诸如LY2510924(Eli Lilly)或小有机化合物，诸如1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷](AMD3100；普乐沙福)、N,N-二丙基-N-[4-({[(1H-咪唑-2-基)甲基)苄基][(1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲基]氨基]甲基)苄基]-N-甲基丁烷-1,4-二胺三(2R,3R)-酒石酸盐(KRH-3955)、([5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-({甲基[(8S)-5,6,7,8-四氢-8-喹啉基]氨基}甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基]甲醇)(GSK812397；Jenkinson等人,Antimicrob.Agents Chemother.2010,54(2)：817)和N′-(1H-苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢喹啉-8-基)丁烷-1,4-二胺(AMD11070；Moyle等人Clin.Infect.Dis.48：798-805))。
在本公开中，将“CXCL12拮抗剂”定义为这样的分子：其通过结合CXCL12或抑制CXCL12对CXCR4的结合和/或活化，来抑制CXCR4信号传导，从而抑制CXCR4信号传导。CXCL12可以例如由表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)的癌性肿瘤中的基质细胞产生。CXCL12拮抗剂的优选例子包括、但不限于本领域众所周知的抗-CXCL12抗体。这样的抗-CXCL12抗体的例子包括、但不限于来自R&D Systems的抗-CXCL12抗体(MAB310)或SDF-1抗体。CXCL12拮抗剂的其它例子包括、但不限于NOX-A12。
其它合适的CXCR4和CXCL12拮抗剂包括非抗体的特异性结合分子，诸如adnectins、艾菲体(affibodies)、avimers、anticalins、四连接素、DARPins、mTCRs、经基因改造的Kunitz-型抑制剂、核酸适体和spiegelmers、肽适体和环肽和二环肽(Ruigrok等人Biochem.J.(2011)436,1-13；Gebauer等人Curr Opin Chem Biol.(2009)(3)：245-55)。使用标准技术可以产生用作CXCR4和CXCL12拮抗剂的合适的特异性结合分子。
CXCR4信号传导由磷酸肌醇磷脂3-激酶的活化来介导。其它合适的CXCR4信号传导抑制剂包括PI 3-激酶抑制剂，例如PI3K的p110δ或p110γ异构体的抑制剂。
术语“4-lBB”表示具有作为GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基；且将“4-lBB共刺激结构域”定义为GenBank Acc.No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。在一个方面，“4-lBB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO：1857提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等价残基。
如本文所用的术语“免疫细胞”表示参与免疫应答的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。
如本文所用的术语“免疫效应细胞”表示参与免疫应答，例如促进免疫效应物应答的细胞。免疫效应细胞的例子包括包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。
如本文所用的术语“免疫效应子功能或免疫效应应答或免疫应答”表示例如免疫效应细胞的功能或应答，其增强或促进靶细胞的免疫攻击。例如，免疫效应子功能或应答表示T或NK细胞促进靶细胞的杀伤或对其生长或增殖的抑制的特性。对于T细胞，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。
如本文所用的术语“免疫疗法”表示，涉及使用免疫细胞或免疫细胞产物的疗法形式。免疫疗法的例子包括，双特异性的T细胞衔接物(例如，兰妥莫单抗)、DART、PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CAR-T、CAR-NK、巨噬细胞-CAR、TCR-T和TIL疗法，以及疫苗接种方案。
如本文所用的术语“细胞疗法”、“过继性细胞疗法”、“细胞性疗法”或“免疫细胞疗法”表示，在疾病的预防和/或治疗中涉及使用细胞(例如，免疫细胞)的疗法形式。细胞疗法的例子包括同种异体干细胞移植、CAR-T、CAR-NK、巨噬细胞-CAR、TCR-T和TIL疗法，以及T细胞疫苗接种方案。细胞疗法的一种形式是免疫细胞疗法，例如，CAR-T细胞疗法。由于双特异性的T细胞衔接物也衔接T细胞，因此它们也被视为免疫细胞疗法的一种形式。
本文中使用的术语“细胞疗法产品”、“细胞性疗法产品”或“免疫细胞疗法产品”表示用于细胞疗法目的的产品。
术语“编码”表示，多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性，其中其它聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列。除非另外指出，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并表示有效地实现特定生物学结果的如本文中所述的化合物、制剂、物质或组合物的量。
术语“内源性的”表示来自生物体、细胞、组织或系统的任何物质，或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源的”表示从生物体、细胞、组织或系统引入的任何物质，或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
术语“表达”表示由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”表示这样的物质组合物：其包含分离的核酸，并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。病毒转移载体的例子包括、但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”表示包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地与待表达的核苷酸序列连接的表达控制序列。
术语“慢病毒”表示逆转录病毒科的一个属。
术语“慢病毒载体”表示从慢病毒基因组的至少一部分衍生出的载体，尤其包括自灭活的慢病毒载体。
术语“同源的”或“同一性”表示两个聚合分子之间(例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。
“全人”表示免疫球蛋白，诸如抗体或抗体片段，其中整个分子是人来源的，或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”是指从天然状态改变或去除。
术语“可操作地连接”或“转录控制”表示调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，从而导致后者的表达。
术语免疫原性组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“动员的”细胞(例如，动员的免疫细胞、动员的免疫效应细胞或动员的T细胞)表示已经从其正常位置动员的细胞。例如，CXCR拮抗剂的施用可用于将来自骨髓、淋巴器官、组织和肿瘤的免疫细胞动员到外周循环中，从那里可以通过白细胞去除术收集它们并用于免疫细胞疗法应用，例如，在本公开中描述的CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL的制造。可用于动员细胞的其它示例性动员剂包括细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim等)、化学疗法药物(例如环磷酰胺)。酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)和锻炼。
术语“动员剂”表示可用于从其正常位置动员细胞的药剂。可用于动员细胞的示例性动员剂包括细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim等)、化学疗法药物(例如环磷酰胺)。酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)和锻炼。
术语“核酸”或“多核苷酸”表示呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。
术语“启动子”表示一DNA序列，其被细胞的合成机制或引入的合成机制所识别，其为启动多核苷酸序列的特异性转录所需。
术语“启动子/调节序列”表示可操作地连接至该启动子/调节序列的基因产物表达所需要的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，且在其它情况下，该序列也可以包括基因产物表达所需要的增强子序列和其它调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
术语“组成型”启动子表示这样的核苷酸序列：当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，其导致在细胞的大多数或全部生理条件下，在细胞中产生所述基因产物。
术语“可诱导的”启动子表示这样的核苷酸序列：当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才导致在细胞中产生所述基因产物。
术语“组织特异性的”启动子表示这样的核苷酸序列：当与由基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，其基本上仅当该细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时，才导致在细胞中产生基因产物。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地表示，在癌细胞的表面上完整地或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常是蛋白、碳水化合物或脂质)，且其可用于使药理学试剂优先靶向癌细胞。
术语“肿瘤支持抗原”或“癌症支持抗原”可互换地表示，在细胞的表面上表达的分子(通常是蛋白、碳水化合物或脂质)，也就是说，其本身不是癌性的，但是支持癌细胞，例如，通过促进癌细胞的生长或存活(例如对免疫细胞的抗性)来支持癌细胞。
在scFv的上下文中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”表示，由氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其单独地或组合地使用，以将可变重链和可变轻链区域连接在一起。在一个实施方案中，所述柔性多肽接头是Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝l，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5和n＝6，n＝7，n＝8，n＝9和n＝l0。在一个实施方案中，所述柔性多肽接头包括、但不限于或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO(DNA)：411和SEQ ID NO(蛋白)：1838)。在另一个实施方案中，所述接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在WO2012/138475(通过引用并入本文)中描述的接头也被包括在本公开的范围内。
本文中使用的5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久已被添加至真核信使RNA的“前方”或5'端。
本文中使用的“体外转录的RNA”表示已经在体外合成的RNA，优选mRNA。
本文中使用的“聚腺苷酸(poly(A))”是通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polyA是在50-5000之间(SEQ ID NO：341-343)，优选地大于64，更优选地大于100，最优选地大于300或400。可以对poly(A)序列进行化学或酶修饰以调节mRNA功能，诸如定位、稳定性或翻译效率。
本文中使用的术语“预防”是指对疾病或疾病状态的预防性或保护性处理。
本文中使用的“聚腺苷酸化”表示聚腺苷酰基部分或其修饰的变体，与信使RNA分子的共价连接。
术语“信号转导通路”表示，在信号从细胞的一部分到细胞的另一部分传递中，起作用的多种信号转导分子之间的生化关联。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传输信号的分子和分子的复合物。
术语“受试者”意图包括在其中可引起免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物，人)。
术语“基本上纯化的”细胞表示基本上不含其它细胞类型的细胞。
本文中使用的“暂时”表示非整合的转基因表达数小时、数天或数周的时间段，其中表达的时间段小于如果整合进基因组中或被包含在宿主细胞的稳定质粒复制子中该基因的表达时间段。
本文中使用的术语“治疗”表示，通过施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂诸如本公开的CAR)，减轻或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增殖性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。
本文中使用的术语“治疗性的”是指治疗。通过疾病状态的减少、抑制、减轻或根除获得治疗效果。
本文中使用的术语“调节性T细胞”或“TREG”表示，在免疫系统中具有调节或抑制其它细胞的作用的T细胞。Treg控制对自身和异物(抗原)的免疫应答，并帮助预防自身免疫病。
在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖障碍抗原”或“与过度增殖障碍有关的抗原”表示特定过度增殖障碍所共有的抗原。在某些方面，本公开的过度增殖障碍抗原源自癌症，包括、但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染”或“转化”或“转导”表示将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者的细胞和它的后代。
术语“特异性(地)结合”表示这样的抗体或配体：其识别在样品中存在的结合配偶体(例如，肿瘤抗原)蛋白并与其结合，但是所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其它分子。
如本文所用的术语“膜锚”或“膜连接结构域”表示足以将细胞外或细胞内结构域锚定至质膜的多肽或部分，例如肉豆蔻酰基。
如本文所用的术语“开关结构域”，例如，当提及RCAR时，表示在有二聚化分子存在下，与另一个开关结构域关联的实体，通常是基于多肽的实体。如本文所用的术语“二聚化分子”，例如，当提及RCAR时，表示促进第一开关结构域与第二开关结构域关联的分子。
本文中使用的“难治的”表示对治疗无应答的疾病，例如癌症。
范围：在本公开中，可以以范围格式来呈现本公开的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，不应解释为对本公开的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应当视作已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应当视作已经具体地公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的各个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，范围诸如95-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的事物，且包括子范围诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。不管范围的宽度，这均适用。
如本文所用的术语“Tet”表示10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶家族的基因家族，以及由所述基因编码的蛋白。Tet包括例如Tetl、Tet2和Tet3。
如本文所用的术语“Tet2”表示基因，tet甲基胞嘧啶双加氧酶2，以及由所述基因编码的蛋白tet2甲基胞嘧啶双加氧酶，该酶催化甲基胞嘧啶向5-羟基甲基胞嘧啶的转化。
表3：本公开的示例性基因的核酸参考SEQ.
Figure BDA0002987268390000261
Figure BDA0002987268390000271
Figure BDA0002987268390000281
Figure BDA0002987268390000291
如本文所用的术语“X抑制剂”或“抑制剂X”表示，减少或消除相应的“X”基因和/或蛋白的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)，其中“X”代表BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL或DR5。在实施方案中，“X”抑制剂是抑制“X”的表达、例如减少或消除“X”的表达的分子。在实施方案中，“X”抑制剂是抑制“X”的功能的分子。抑制“X”的表达的“X”抑制剂的一个例子是基因编辑系统，例如，如本文中所述，其靶向在“X”基因内的核酸或其调节元件，从而修饰在基因编辑系统结合位点处或附近的核酸，以减少或消除“X”的表达。抑制“X”的表达的“X”抑制剂的另一个例子是核酸分子，例如，RNA分子，例如，短发夹RNA(shRNA)或短干扰RNA(siRNA)，其能够与“X”的mRNA杂交并导致“X”翻译的减少或消除。“X”抑制剂还包括编码抑制“X”表达的分子的核酸(例如，编码抗-”X”shRNA或siRNA的核酸，或编码抗-”X”基因编辑系统的一种或多种例如全部组分的核酸)。抑制“X”的功能的分子的一个例子是抑制“X”的一种或多种活性的分子，例如，蛋白或小分子。一个例子是“X”的小分子抑制剂。另一个例子是显性失活的“X”蛋白。另一个例子是“X”结合配偶体的显性失活形式。另一个例子是抑制“X”结合配偶体的分子，例如小分子。“X”抑制剂还包括编码“X”功能抑制剂的核酸。
如本文所用的术语“BRD9抑制剂”表示，减少或消除BRD9的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。在实施方案中，BRD9抑制剂是抑制BRD9的表达例如减少或消除BRD9的表达的分子。在实施方案中，BRD9抑制剂是抑制BRD9的功能的分子。抑制BRD9表达的BRD9抑制剂的一个例子是基因编辑系统，例如，如本文所述，其靶向在BRD9基因内的核酸或其调节元件，从而修饰在基因编辑系统结合位点处或附近的核酸，以减少或消除BRD9的表达。抑制BRD9表达的BRD9抑制剂的另一个例子是核酸分子，例如，RNA分子，例如，短发夹RNA(shRNA)或短干扰RNA (siRNA)，其能够与BRD9的mRNA杂交并引起BRD9翻译的减少或消除。BRD9抑制剂还包括编码抑制BRD9表达的分子的核酸(例如，编码抗-BRD9shRNA或siRNA的核酸，或编码抗-BRD9基因编辑系统的一种或多种例如所有组分的核酸)。抑制BRD9功能的分子的一个例子是抑制BRD9的一种或多种活性的分子，例如，蛋白或小分子。一个例子是BRD9的小分子抑制剂。另一个例子是显性失活的BRD9蛋白。另一个例子是BRD9结合配偶体的显性失活形式。另一个例子是抑制BRD9结合配偶体的分子，例如，小分子。BRD9抑制剂还包括编码BRD9功能抑制剂的核酸。
如本文所用的术语“Tet抑制剂”或“Tet[x]抑制剂”(例如，“Tetl抑制剂”、“Tet2抑制剂”或“Tet3抑制剂”)表示，减少或消除对应的Tet(例如，Tetl、Tet2和/或Tet3，例如，Tet2)的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。
如本文所用的术语“MLL2抑制剂”表示，减少或消除MLL2的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。如本文所用的术语“MLL3抑制剂”表示，减少或消除MLL3的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。如本文所用的术语“MLL4抑制剂”表示，减少或消除MLL4的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。如本文所用的术语“EZH2抑制剂”表示，减少或消除EZH2的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。
如本文所用的术语“TRAIL抑制剂”或“TRAIL拮抗剂”表示，减少或消除TRAIL和/或其受体DR5和/或DR4的功能和/或表达的分子或分子集合(例如，系统)。在实施方案中，TRAIL抑制剂是抑制TRAIL和DR5的表达(例如，减少或消除TRAIL和/或DR5的表达)的分子。在实施方案中，TRAIL抑制剂是抑制TRAIL和/或DR5的功能的分子。抑制TRAIL表达的TRAIL抑制剂的一个例子是基因编辑系统，例如，如本文所述，其靶向在TRAIL基因内的核酸或其调节元件，从而修饰在基因编辑系统结合位点处或附近的核酸，以减少或消除TRAIL的表达。抑制TRAIL表达的TRAIL抑制剂的另一个例子是核酸分子，例如，RNA分子，例如，短发夹RNA(shRNA)或短干扰RNA(siRNA)，其能够与TRAIL的mRNA杂交并引起TRAIL翻译的减少或消除。TRAIL抑制剂还包括编码抑制TRAIL表达的分子的核酸(例如，编码抗-TRAIL的核酸，例如，TRAIL shRNA或siRNA，或编码抗-TRAIL的一种或多种例如所有组分的核酸，例如，TRAIL基因编辑系统)。抑制TRAIL功能的分子的一个例子是抑制TRAIL的一种或多种活性的分子，例如，蛋白或小分子。一个例子是TRAIL的小分子抑制剂。另一个例子是抗体、抗体片段、非免疫球蛋白结合支架，其结合TRAIL和/或DR5并阻止通过DR5的信号传导。另一个例子是显性失活的TRAIL蛋白。另一个例子是TRAIL受体DR5的显性负性突变体。另一个例子是TRAIL受体DR4(例如，SEQ ID NO：2441)、DR5(SEQ ID NO：2428)、DcR1(SEQ ID NO：2448)和DcR2(SEQ ID NO：2455)的可溶性或诱饵形式。另一个例子是DR5的突变体形式，其缺少它的细胞质信号传导结构域，或其中DR5的信号传导结构域被共刺激性受体(例如CD27、CD28、41BB、GITR、BCMA或OX40)的信号传导结构域替代(例如，SEQ ID NO：2429-2440)。另外的示例性TRAIL拮抗剂包括DcR1(SEQ ID NO：2360)、DcR2(SEQ ID NO：2361)和含有DcR1、DcR2、DR4和DR5的TRAIL-结合胞外结构域的融合受体(SEQ ID NO：2429-2461)。TRAIL抑制剂的另一个例子是抑制TRAIL结合配偶体(例如，TRAIL受体，例如，DR5)的分子，例如，小分子。TRAIL抑制剂的另一个例子是抑制TRAIL受体(例如，DR5)的下游信号转导的分子，例如，小分子。抑制TRAIL受体的下游信号传导的一种示例性小分子是NF-κB抑制剂，例如，IKK-2抑制剂IV(CAS 507475-17-4)、IKK2抑制剂VI(CAS 354811-10-2)、LY2409881或硼替佐米。其它TRAIL抑制剂(包括NF-κB抑制剂)是本领域已知的且可以用在本公开的替代实施方案中。已知TRAIL信号传导会激活许多其它的信号传导通路，例如，JNK通路，并且这些通路的抑制剂可用在本公开的替代实施方案中以改善免疫效应细胞疗法的效力和安全性。TRAIL抑制剂的其它例子包括FADD的显性负性突变体(例如，FADD死亡结构域；SEQ ID NO(DNA)：2453，SEQID NO(蛋白)：2463)和Caspase 8(例如，Caspase 8D73A[SEQ ID NO(DNA)：2354，SEQ ID NO(蛋白)：2464]，Caspase 8D73A/L74A；SEQ ID NO(DNA)：2355和SEQ ID NO(蛋白)：2365；Caspase 8D73A/L74A/L75A；SEQ ID NO(DNA)：2356和SEQ ID NO(蛋白)：2366。TRAIL抑制剂还包括编码TRAIL功能(例如，TRAIL与其受体例如DR5的结合和/或TRAIL受体的下游信号转导)的抑制剂的核酸。TRAIL抑制剂还包括编码抑制TRAIL信号传导的分子的核酸(例如，编码抗-FADD或抗-Caspase 8的核酸，例如，FADD shRNA或siRNA，或Caspase 8shRNA或siRNA，或编码抗-FADD或Caspase 8的一种或多种例如所有组分的核酸，例如，FADD基因编辑系统或Caspase8基因编辑系统)。
可以类似地描述本公开的其它分子的抑制剂/拮抗剂。
本文中与基因编辑结合使用的术语“系统”表示一组分子，例如一种或多种分子，它们一起起作用以实现期望的功能。
如本文所用的术语“基因编辑系统”表示一个系统，例如，一种或多种分子，其指导和实现在被所述系统靶向的基因组DNA的位点处或附近的一种或多种核酸的改变，例如，缺失。基因编辑系统是本领域已知的，并且在下面更充分地描述。
在本文中，在“X”(例如，Tetl、Tet2和/或Tet3，例如，Tet2)结合配偶体的上下文中所用的术语“结合配偶体”表示与“X”(例如，Tet，例如，Tetl、Tet2和/或Tet3，例如，Tet2蛋白)相互作用(例如，结合)的分子，例如蛋白。不受理论的约束，据信，Tet，例如，Tetl、Tet2和/或Tet3，例如，Tet2，与一种或多种HDAC蛋白结合。这样的HDAC蛋白被认为是Tet，例如，Tetl、Tet2和/或Tet3，例如，Tet2结合配偶体的例子。本公开的其它蛋白的结合配偶体是本领域已知的。
“显性失活的”基因产物或蛋白，是干扰另一种基因产物或蛋白功能的基因产物或蛋白。在一个实施方案中，显性失活的DR5是DR5的突变体，其不能传输信号，例如死亡诱导信号。
制造细胞疗法产品(例如，CAR-T或TCR-T或细胞疫苗)通常开始于通过白细胞去除术和T-细胞选择从受试者收集淋巴细胞，然后活化，修饰，繁殖，并冷冻保存最终产品。尽管此过程在概念验证(proof-of-concept)临床试验中较好地工作，但仍存在几个挑战，它们阻碍了活细胞疗法的放大和扩展。术语”受试者”意图包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的例子包括人类、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、组织驻留的淋巴细胞、肿瘤驻留的淋巴细胞、胸腺组织，来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
本公开涉及一种改善细胞疗法产品(例如，免疫细胞疗法产品，例如，CAR-T、SIR-T、TFP-T、Ab-TCR-T和TCR-T产品等)的收率、繁殖、活化、增殖、繁殖、多样性、组织(例如，肿瘤)穿透性、持久性、效力和安全性的方法。在一个实施方案中，本公开涉及，通过使用动员的免疫细胞用于制造细胞疗法产品，来改善免疫细胞疗法(诸如经基因改造的CAR-T、TCR-T、SIR-T、Ab-TCR-T细胞疗法或NK细胞疗法)的收率、繁殖、活化、增殖、繁殖、多样性、组织(例如，肿瘤)穿透性、持久性和效力。在不同的实施方案中，通过在收集细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)之前，给从其收获细胞的供体施用CXCR拮抗剂(例如，Mozibil或普乐沙福)、细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或沙格司亭、Neulasta或Pegfilgastrim)、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如，环磷酰胺、多柔比星)或以上药剂的组合来动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞或巨噬细胞/单核细胞或树突细胞)。在不同的实施方案中，通过使受试者(即供体)锻炼来动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞或巨噬细胞/单核细胞或树突细胞)。
在一个方面，使用白细胞去除术从受试者得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，使用骨髓收获，从受试者得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从作为接受细胞疗法产品的候选人的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从作为健康供体的受试者，得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从患疾病(例如，癌症、感染或自身免疫疾病)的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从已经接受了先前化学疗法(例如，抗癌药物)的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前具有不足数目的循环(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞或巨噬细胞/单核细胞或树突细胞)细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约1000x106/L(例如，小于600x106/L、400x106/L、200x106/L或100x106/L)CD3+细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约800x106/L(例如，小于400x106/L、200x106/L、100x106/L、50x106/L)CD4+细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约500x106/L(例如，小于400x106/L、200x106/L、100x106/L或50x106/L)CD8+细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约50x106/L(例如，小于40x106/L、20x106/L、10x106/L或5x106/L)CD3+/CD16+细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约50x106/L(例如，小于40x106/L、20x106/L、10x106/L或5x106/L)CD3+/CD56+细胞的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞等)质量差的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)多样性差的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)多功能性(例如，抗原诱导的IL2、TNFα和IFNγ等的产生)差的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在不施用动员剂的情况下，具有或预期具有差的白细胞分离产品收率的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在不施用动员剂的情况下，在白细胞分离产品中具有或预期具有小于约50x109(例如，小于40x109、20x109、10x109等)白血细胞(WBC)的受试者，得到经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个实施方案中，所述方法包括，从在收集细胞之前已经接受了动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)的受试者(即自体或同种异体的供体)，得到用于制造和使用细胞疗法产品的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在本公开的另一个方面，所述方法包括，从已经接受了动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)以辅助动员免疫细胞(例如，T细胞)进入周围循环中的受试者(即自体或同种异体的供体)，得到用于制造和使用细胞疗法产品的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在本公开的另一个方面，所述方法包括，从已经接受了动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)以辅助动员免疫细胞的特定子集进入周围循环中的受试者(即自体或同种异体的供体)，得到用于制造和使用细胞疗法产品的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从作为接受细胞疗法产品的候选人的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从作为健康供体的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从患有疾病(例如，癌症、感染或自身免疫疾病)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在先已经接受了疾病(例如，癌症、免疫或感染疾病)治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了癌症治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在先已经接受了血液癌症(例如，浆细胞障碍、骨髓瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、MDS等)治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了实体瘤(例如，肺癌、乳腺癌、胃肠癌、肝癌等)治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了免疫障碍治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了感染(例如，HIV-1/AIDS)治疗的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在先已经接受了化学疗法药物(例如，抗癌药物，例如，烷化剂，例如，美法仑、环磷酰胺等)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。其它抗癌药物是本领域已知的且包括依托泊苷、多柔比星、阿糖胞苷、氟达拉滨、长春新碱、长春碱等。在一个方面，从在先已经接受了免疫调节药物(IMiDs；例如，来那度胺)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了类固醇(例如，地塞米松)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了抗体(例如，利妥昔单抗、阿仑单抗(CAMPATH)等)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了抗体药物缀合物(例如，ADCETRIS)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了靶向疗法(例如酪氨酸激酶抑制剂，例如，依鲁替尼)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了辐射疗法的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在先已经接受了放射性标记的抗体的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，具有不足数目的循环细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的受试者，得到已经用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂，例如，普乐沙福)动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约1000x106/L(例如，小于600x106/L、400x106/L、200x106/L或100x106/L)CD3+细胞的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约800x106/L(例如，小于400x106/L、200x106/L、100x106/L、50x106/L)CD4+细胞的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约500x106/L(例如，小于400x106/L、200x106/L、100x106/L或50x106/L)CD8+细胞的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约50x106/L(例如，小于40x106/L、20x106/L、10x106/L或5x106/L)CD3+/CD16+细胞的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，在外周血中具有小于约50x106/L(例如，小于40x106/L、20x106/L、10x106/L或5x106/L)CD3+/CD56+细胞的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞等)质量差的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)多样性差的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。通过下一代测序和/或通过多色流式细胞计量术测量克隆形成能力(clonality)，可以测量血细胞的多样性。
在一个方面，从在施用动员剂之前，周围血细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)多功能性(例如，抗原诱导的IL2、TNFα和IFNγ等的产生)差的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个方面，从在不施用动员剂的情况下，具有或预期具有白细胞分离产品收率差的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，从在不施用动员剂的情况下，在白细胞分离产品中具有或预期具有小于约50x 109(例如，小于40x109，20x109，10x109等)白血细胞(WBC)的受试者，得到CXCR4拮抗剂动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在一个实施方案中，在收集(例如，白细胞去除术)细胞之前和任选地在当天，每天将CXCR4拮抗剂以0.24mg/kg的剂量皮下地施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前和任选地在当天，例如，皮下地，以约0.20mg/kg至5mg/kg(例如，0.01mg/kg/、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg)的剂量，将CXCR4拮抗剂施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，通过替代施用途径(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、透皮和口服等)，将CXCR4拮抗剂施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前，每天将CXCR4拮抗剂施用给受试者(即，供体)，持续约1-10天(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天)。在某些实施方案中，在施用最后一剂CXCR4拮抗剂以后约15min至96h(例如，15min、2h、6h、12h、24h、36h或48h)，从受试者(即，供体)收集细胞(例如，免疫细胞)。
在一个实施方案中，所述CXCR4拮抗剂是Mozibil或普乐沙福。在一个实施方案中，在收集(例如，白细胞去除术)细胞之前和任选地在当天，每天将Perixafor以0.24mg/kg的剂量皮下地施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前和任选地在当天，例如皮下地，以约0.20mg/kg至5mg/kg(例如，0.01mg/kg/、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg)的剂量，将Perixafor施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前和任选地在当天，例如静脉内地，以约0.20mg/kg至5mg/kg(例如，0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg)的剂量，将Perixafor施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前和任选地在当天，例如肌肉内地，以约0.20mg/kg至5mg/kg(例如，0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg或5mg/kg)的剂量，将Perixafor施用给受试者(即，供体)。在某些实施方案中，在收集细胞之前，每天将Perixafor施用给受试者(即，供体)，持续约1-10天(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天)。在某些实施方案中，在施用最后一剂Perixafor以后约15min至96h(例如，15min、1h、2h、6h、12h、24h、36h、48h或96h)，从受试者(即，供体)收集细胞(例如，免疫细胞)。
在其它实施方案中，所述CXCR4拮抗剂是BMS-936564/MDX-1338、LY2510924、1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷](AMD3100；普乐沙福)、N,N-二丙基-N-[4-({[(1H-咪唑-2-基)甲基)苄基][(1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲基]氨基]甲基)苄基]-N-甲基丁烷-1,4-二胺三(2R,3R)-酒石酸盐(KRH-3955)、([5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-({甲基[(8S)-5,6,7,8-四氢-8-喹啉基]氨基}甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基]甲醇)(GSK812397)或N-(1H-苯并咪唑-2-基甲基)-N′-(5,6,7,8-四氢喹啉-8-基)丁烷-1,4-二胺(AMD11070)。在一个实施方案中，CXCR4拮抗剂是BL-8040。另外的CXCR4拮抗剂是本领域已知的，诸如T140类似物、NUCC-388和CXCR4拮抗剂III(Calbiochem)，且可以用在本公开的替代实施方案中。
在其它实施方案中，所述CXCR4拮抗剂是CXCL12拮抗剂。在进一步优选的实施方案中，所述CXCL12拮抗剂是抗-CXCL12抗体。抗-CXCL12抗体的一个例子包括、但不限于抗-SDF-1抗体。这样的CXCL12拮抗剂的例子可以是、但不限于RNA寡核苷酸NOX-A12或鞣酸，或阻断CXCL12与CXCR4相互作用的任何其它化学品。
如本文中所述的CXCR4拮抗剂可以通过连续静脉内输注以特定量施用，所述特定量足以将血清浓度维持在造成抑制>90％的CXCR4对CXCL12结合的水平(参见例如Hendrix等人JAcquir Immune Defic Syndr.2004年10月.1；37(2)：1253-62)。本文描述的其它CXCR4信号抑制剂也可以以该相同方式使用。
可以在一个剂量连续地或间歇地(例如，在适当的间隔以分份剂量)完成体内施用(例如，以适当的间隔分批施用)。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且将根据用于治疗的制剂、治疗的目的、所治疗的靶细胞和所治疗的受试者而变化。可以在医师选择的剂量水平和方式下进行单次或多次施用。例如，医师可以基于外周血淋巴细胞计数，来调整用本公开的CXCR4拮抗剂和其它动员剂治疗的剂量和持续时间。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从已经接受细胞因子以辅助动员免疫细胞的特定子集进入周围循环中的受试者(即自体或同种异体的供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个实施方案中，所述细胞因子是G-CSF(非格司亭，Amgen)。在某些实施方案中，每天以约1-30μg/kg(例如，1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg或30μg/kg)的剂量，皮下施用G-CSF持续约1-10天。在某些实施方案中，每天以约1-30μg/kg(例如，1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg或30μg/kg)的剂量，静脉内施用G-CSF持续约1-10天。在某些实施方案中，在施用最后一剂的G-CSF以后约2h至96h从受试者(即，供体)收集细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从已经接受了细胞因子以辅助动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的特定子集进入周围循环中的受试者(即自体或同种异体的供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个实施方案中，所述细胞因子是培非司亭(Neulasta，Amgen)。在某些实施方案中，通过皮下注射以约6mg(例如，6mg、8mg、10mg、12mg或16mg)的剂量施用培非司亭。在某些实施方案中，在施用培非司亭的剂量以后约4天，从受试者(即，供体)收集细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从已经接受了GM-CSF以辅助动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的特定子集进入周围循环中的受试者(即自体或同种异体的供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在某些实施方案中，每天以约250μg/m2/天(IV经24小时或皮下地)的剂量施用GM-CSF(Leukine)持续约1-10天。在某些实施方案中，在施用最后一剂的GM-CSF以后约2h至96h，从受试者(即，供体)收集细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从已经接受了CXCR4拮抗剂(例如，Perixafor)和细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF或培非司亭)的组合以辅助动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的特定子集进入周围循环中的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个示例性实施方案中，所述受试者皮下接受每天10μg/kg剂量的G-CSF持续5天，随后在第5天皮下接受0.25mg/kg剂量的Perixafor。在Perixafor的剂量以后大约2小时，使用CS3000-Plus血细胞分离器(Baxter Healthcare)收集白细胞去除术产品。在一个示例性实施方案中，所述受试者通过皮下注射接受12mg剂量的Pegfilgastrim，在4天后皮下接受0.25mg/kg剂量的Perixafor。在Perixafor的剂量以后大约2小时使用CS3000-Plus血细胞分离器(Baxter Healthcare)收集白细胞去除术产品，并用于制造细胞疗法产品(例如，CAR-T细胞的制备)。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从化学动员以后的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)，例如，从这样的受试者得到细胞：其已经接受了化学疗法，随后在从化学疗法恢复期间接受CXCR4拮抗剂(例如，Perixafor)和/或细胞因子(例如，G-CSF或GM-CSF)以辅助动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的特定子集进入周围循环中。许多化学动员方案是本领域已知的且可以用在本公开的方法中。示例性的化学动员方案包括高剂量环磷酰胺(HDC，4gm/m2)或环磷酰胺(4gm/m2)+依托泊苷(600mg/m2)(HDCE)。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从已经接受了β2肾上腺素能受体激动剂以辅助动员细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的特定子集进入周围循环中的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个示例性实施方案中，所述β2肾上腺素能激动剂是肾上腺素。在一个示例性实施方案中，所述受试者通过静脉内输注，接受约0.005mg/kg/min至0.02mg/kg/min剂量的肾上腺素约30分钟至2小时。在肾上腺素输注30min至2小时以后，收集白细胞去除术产品。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从锻炼后的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个示例性实施方案中，所述受试者在跑台上进行中等至剧烈锻炼约10分钟至1小时，并在中等至剧烈锻炼10min至1小时以后，收集白细胞去除术产品。在一个示例性实施方案中，通过白细胞单采术，从锻炼后的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)，所述锻炼导致心率比静止时的心率高了超过50-100％。
在本公开的另一个方面，通过白细胞单采术，从施用Src激酶抑制剂后的受试者(即供体)得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。一种示例性的Src激酶抑制剂是达沙替尼。在一个示例性实施方案中，所述受试者以约40-140mg的剂量口服接受达沙替尼，并在施用达沙替尼以后约1-5小时，通过白细胞单采术从所述受试者得到细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)。在一个实施方案中，在白细胞去除术之前，将达沙替尼施用给受试者持续约7天(例如，6天、4天、2天等)。
在一个实施方案中，从已经接受低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者，得到免疫效应细胞。在一个实施方案中，在足够的时间以后，或在充分施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂以后，收获要经基因改造成表达CAR/TCR的免疫效应细胞群体(例如，T细胞)，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平，或PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PDl阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率至少短暂地增加。
本公开的经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)可以用于许多细胞疗法用途。在一个实施方案中，在没有操作或遗传修饰的情况下，将经动员的细胞施用给受试者。在一个实施方案中，通过除去CD25-阳性的T细胞，从经动员的细胞除去T调节性细胞(CD3+，CD4+，CD25高，CD127低，FoxP3+)。在一个实施方案中，使用本领域已知的方法，诸如用CD25抗体标记的磁珠进行免疫磁性标记和磁体辅助的细胞分选，通过除去表达CD25hi的T细胞，将经动员的细胞除去调节性T细胞(TREG)。
在一个实施方案中，将所述经动员的细胞(除去或未除去TREG)在施用给受试者之前进行遗传修饰。在一个实施方案中，将所述经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞或巨噬细胞/单核细胞或树突细胞)进行遗传修饰，以表达天然的或非天然的(例如，合成的)免疫受体。可以在本公开的经动员的细胞中表达的示例性免疫受体包括，天然TCR、重组TCR、嵌合抗原受体(CAR)(包括下一代CAR(例如，SIR、TFP、Ab-TCR、超CAR、TAC等))、合成的凹口(Notch)受体等。在一个实施方案中，将所述经动员的细胞(除去或未除去TREG)用于制备细胞疫苗。
在一个实施方案中，将所述经动员的细胞进行遗传修饰以表达免疫受体，其识别选自以下的一种或多种抗原：CD5，CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白(Testisin)或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Lewis)(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20/MS4A1；叶酸盐受体α(FRa或FR1)；叶酸盐受体β(FRb)；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(前体(Prosome)，巨蛋白因子(Macropain))亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和艾贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；唾液酸基路易斯(Lewis)粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白(uroplakin)2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白(pannexin)3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活素；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物的受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；豆荚蛋白(legumain)；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1 TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基路易斯抗原)；岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，Tn ag，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，，Lews Ag，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，促性腺素激素受体(CGHR或GR)，CCR4，GD3，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，KSHV K8.1，KSHV-gH，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC)，自身抗体-桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)，自身抗体-桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IgE，CD99，RasG12V，组织因子1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)，CLDN6，P-糖蛋白，STEAP1，Liv1，连接素-4，Cripto，MPL，gpA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，STEAP1，WISP1，SLC34A2和被TNT抗体识别的抗原。
表达免疫受体(例如，TCR、CAR、SIR、TFP、Ab-TCR等)以产生细胞疗法产品的方法描述在本公开中，且也是本领域已知的。
在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)进行遗传修饰，从而修饰一个或多个基因的表达。在一个示例性实施方案中，将本公开的经动员的细胞进行遗传修饰，以减少或消除Tet2基因的表达。在一个示例性实施方案中，将本公开的经动员的细胞进行遗传修饰，以减少或消除TCR和HLA I类基因的表达。在一个示例性实施方案中，将本公开的经动员的细胞进行遗传修饰，以减少或消除TCR-α(TRAC)基因和/或β2巨球蛋白基因的表达。在一个示例性实施方案中，将本公开的经动员的细胞进行遗传修饰，以改变BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的表达。在一个示例性实施方案中，将本公开的经动员的细胞进行遗传修饰，以增加基因(例如，vFLIP-K13、NEMO、cJun、JAK3、STAT5等)的表达。改变基因的表达以产生细胞疗法产品的方法描述在本公开中且是本领域已知的。
在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生免疫应答的目的。在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生T细胞免疫应答的目的。
在一个实施方案中，在产生细胞疗法产品之前，将本公开的经动员的细胞进一步加工和纯化成不同的亚型。在一个实施方案中，在产生细胞疗法产品(例如，CAR-T或TCR-T细胞)之前，通过除去CD25hi细胞，将本公开的经动员的细胞除去TREG(调节性T细胞)。为产生细胞疗法产品而收集、加工、选择和除去不同细胞子集的方法描述在本公开中且也是本领域已知的。
在一个实施方案中，为了产生细胞疗法产品，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个实施方案中，为了产生细胞疗法产品，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖约21天(例如，1天、2天、3天、5天、7天、9天、12天、14天、21天等)。在某些实施方案中，为了产生细胞疗法产品，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖超过1天(例如，超过1天、2天、3天、5天、7天、9天、12天、14天、21天等)。在一个实施方案中，在施用给受试者之前，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个实施方案中，在施用给患者之前，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖约21天(例如，1天、2天、3天、5天、7天、9天、12天、14天、21天等)。在某些实施方案中，在施用给患者之前，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖超过1天(例如，超过1天、2天、3天、5天、7天、9天、12天、14天、21天等)。在一个实施方案中，在施用给受试者之前，将本公开的经动员的细胞冷冻保存。为了产生细胞疗法产品而活化和繁殖细胞的方法，描述在本公开中且也是本领域已知的。冷冻保存和施用细胞疗法产品的方法，也描述在本公开中且是本领域已知的。
在一个实施方案中，在包括CD3抗体、CD28抗体和IL2的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个示例性实施方案中，在补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和30-100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中培养经动员的T细胞。在一个示例性实施方案中，可以使用CD3/CD28珠子和100IU重组人-IL2。在一个示例性实施方案中，在5％CO2保湿培养箱中，在37℃培养细胞。在一个实施方案中，在包括细胞因子诸如IL-7、IL-15、IL-21、IL12F或它们的组合的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。
在一个实施方案中，在促进中央记忆T细胞产生的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。
在一个实施方案中，在抑制TREG产生的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个实施方案中，在促进TREG产生的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个实施方案中，在抑制抑制性T细胞产生的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。在一个实施方案中，在促进抑制性T细胞产生的培养条件下，将本公开的经动员的细胞在体外活化和/或繁殖。活化和/或繁殖T细胞以促进或抑制TREG和抑制性T细胞产生的方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生表达天然或合成的T细胞受体的细胞疗法产品。在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生表达嵌合抗原受体(包括下一代CAR(例如，SIR、TFP、Ab-TCR、TAC、超CAR等))的细胞疗法产品。在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生表达天然或合成的NK细胞受体的细胞疗法产品。在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生表达天然或合成的巨噬细胞受体的细胞疗法产品。在一个实施方案中，将本公开的经动员的细胞用于产生疫苗，例如，T细胞疫苗。产生表达不同受体的细胞疗法产品的方法，描述在本公开中且也是本领域已知的。
在一个实施方案中，从本公开的经动员的细胞产生的细胞疗法产品用于自体施用；即，将细胞疗法产品施用给从其收获经动员的细胞的相同受试者。在一个实施方案中，从本公开的经动员的细胞产生的细胞疗法产品用于同种异体施用；即，将细胞疗法产品施用给与从其收获经动员的细胞的人不同的受试者。使用细胞疗法产品用于自体或同种异体使用的方法，描述在本公开中且也是本领域已知的。
在一个实施方案中，从本公开的经动员的细胞产生的细胞疗法产品，用于预防和治疗多种疾病(例如，癌症、免疫、退行性和感染性疾病)。在一个实施方案中，从本公开的经动员的细胞产生的细胞疗法产品，用于与其它药剂(例如，化学疗法药物；抗体，细胞因子等)联合地预防和治疗多种疾病。
在某些实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)的更高收率。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品中的细胞(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T细胞)相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致在制造的细胞疗法产品中细胞数目高了约20％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的制造时间更短。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品的制造时间相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品制造时间短了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的制造失败更少。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品的制造失败相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的制造失败减少了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的制造成本更低。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品制造的细胞疗法产品的制造失败相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的制造成本减少了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的多样性得到改善。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的多样性高了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。通过本领域已知的方法诸如克隆分析、多色流式细胞计量术等，可以测量细胞疗法产品的多样性。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)产生的细胞疗法产品，没有表现出细胞毒性活性的显著损失，或表现出改善的对其靶细胞的细胞毒性。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用，导致细胞疗法产品的细胞毒性的损失不超过50％(例如，20％、25％、45％等)。使用本领域已知的方法，诸如Matador细胞毒性测定或放射性铬释放测定，可以测量细胞疗法产品的细胞毒性。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品表现出改善的靶抗原诱导的细胞因子产生(TNFα、IL2、IFNγ)，或没有表现出靶抗原诱导的细胞因子产生(TNFα、IL2、IFNγ)的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的靶抗原诱导的细胞因子产生损失不超过50％(例如，20％、25％、50％等)。使用本领域已知的方法，诸如ELISA和流式细胞计量术等，测量细胞疗法产品的细胞因子产生。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品，表现出改善的体内效力或没有表现出体内效力的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的体内效力损失不超过50％(例如，20％、25％、50％等)。使用本领域已知的方法，诸如在免疫缺陷小鼠中的异种移植物研究，测量细胞疗法产品的体内效力。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品表现出改善的干样T细胞或没有表现出干样T细胞的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品中的干样T细胞损失不超过50％(例如，不超过20％、25％、50％等)。使用本领域已知的标志物(例如，CD62L+、CD7+、Pgp+)，通过流式细胞计量术测量细胞疗法产品中的干样T细胞群体。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品表现出改善的原初T细胞或没有表现出原初T细胞的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品中的原初T细胞损失不超过50％(例如，不超过20％、25％、50％等)。使用本领域已知的标志物，通过流式细胞计量术测量细胞疗法产品中的原初T细胞群体。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品表现出改善的中央记忆T细胞或没有表现出中央记忆T细胞的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品中的中央记忆T细胞损失不超过50％(例如，不超过20％、25％、50％等)。使用本领域已知的标志物，通过流式细胞计量术测量细胞疗法产品中的中央记忆T细胞群体。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品表现出改善的效应T细胞或没有表现出效应T细胞的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品中的效应T细胞损失不超过50％(例如，不超过20％、25％、50％等)。使用本领域已知的标志物，通过流式细胞计量术测量细胞疗法产品中的效应T细胞群体。
在一个实施方案中，与在不施用动员剂的情况下收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品相比，在施用动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼等)以后收集的细胞群体(例如血液成分分离术产品)所产生的细胞疗法产品没有表现出调节性T细胞(例如TREG)的较多富集。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致在细胞疗法产品中调节性T细胞(TREG)群体的增加不超过50％(例如，不超过20％、25％、50％等)。使用本领域已知的标志物，通过流式细胞计量术测量细胞疗法产品中的TREG群体。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用没有导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的多功能性(例如，抗原诱导的IL2、TNFα、IFNγ产生)的显著损失，和/或导致改善的多功能性(例如，抗原诱导的IL2、TNFα、IFNγ产生)。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品的多功能性高了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用没有导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的体内繁殖的显著损失，和/或导致改善的体内繁殖。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用，导致细胞疗法产品在施用给受试者以后的繁殖高了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用没有导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的持久性的显著损失，和/或导致改善的持久性。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法产品在施用给受试者以后的持久性大了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的组织(例如肿瘤)穿透性得到改善，或没有导致组织(例如肿瘤)穿透性的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品所制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用，导致细胞疗法产品在施用给受试者以后的组织(例如肿瘤)穿透性大了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的抗肿瘤效力得到改善，或没有导致抗肿瘤效力的显著损失。在一个实施方案中，与在不使用动员剂的情况下收集的血液成分分离术产品制造的细胞疗法产品相比，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用，导致细胞疗法产品在施用给受试者以后的抗肿瘤效力大了约10％(例如，20％、50％、75％、100％等)。
在一个实施方案中，动员剂(例如，CXCR4拮抗剂、G-CSF、GM-CSF或达沙替尼)的应用没有导致细胞疗法(例如，CAR-T、SIR-T或TCR-T)产品的毒性(例如，细胞因子释放综合征、神经毒性等)显著增加。
在本公开的某些方面，使用熟练的技术人员已知的任意数目的技术，诸如FicollTM分离，可以从由受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞，例如，T细胞。在一个优选的方面，通过血液成分分离术获得来自个体的循环的血液细胞。血液成分分离术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核的白血细胞、红血细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过血液成分分离术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地，将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中以用于随后的处理步骤。在一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。
在一个方面，通过裂解红血细胞并除去单核细胞，例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过反向流离心淘洗，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一个实施方案中，使经动员的细胞进一步富集表达P-糖蛋白((P-gp或Pgp；MDR1，ABCB1，CD243)的细胞。在一个实施方案中，如申请号PCT/US2017/042248(其通过引用并入本文)中所述，使经动员的细胞富集难用(dull)染料染色的细胞，所述染料是P-糖蛋白介导的外流的底物。在某些实施方案中，将缺乏p-gp或p-gp活性表达的细胞从群体中除去。
本文所述的方法可以包括超过一个选择步骤，例如，超过一个除去步骤。
本文所述的方法还可以包括，从群体中除去表达肿瘤抗原(例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20/MS4A1、CD14或CDl lb)的细胞。还提供了，包括从群体中除去表达检查点抑制剂的细胞的方法。
本文所述的方法还可以包括，从经动员的细胞中除去调节性T细胞(TREG)。除去TREG的方法是本领域已知的，且包括除去表达CD25的T细胞。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNFa、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒蛋白酶B和穿孔蛋白，或其它适当的分子(例如，其它细胞因子)中的一种或多种的T细胞群体。可以确定筛选细胞表达的方法，例如通过在PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法。
也可以在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。
在本公开的上下文中还考虑了，在可能需要如本文中所述的繁殖的细胞之前的时间段，从受试者收集血液样品或血液成分分离术产品。在一个方面，从总体上健康的受试者采集血液样品或血液成分分离术。在某些方面，从具有发生疾病的风险但尚未发生疾病的、总体上健康的受试者，采集血液样品或血液成分分离术，并且将目标细胞分离并冷冻备用。
在某些方面，可以将T细胞繁殖，冷冻，并在以后的时间使用。在某些方面，在诊断出如本文所述的特定疾病之后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。
本公开也提供了BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂及其使用方法。具体地，本公开提供了免疫效应细胞，例如，表达CAR和TCR的T细胞，其包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂，以及与免疫效应细胞疗法产品(例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞)联合的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂的用途。在下面更详细地描述本公开的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂，以及它们的使用方法。
在一个实施方案中，所述免疫效应细胞疗法产品是CAR-T细胞或TCR-T细胞或BiTE，其中所述CAR-T/TCR-T或BiTE靶向、但不限于选自以下项中的一种或多种抗原：CD5，CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319,和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20/MS4A1；叶酸盐受体α(FRa或FR1)；叶酸盐受体β(FRb)；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活素；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物的受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1 TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基路易斯抗原)；岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，Tn ag，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，Lews Ag，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，促性腺素激素受体(CGHR或GR)，CCR4，GD3，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，KSHVK8.1，KSHV-gH，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC)，针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体，针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IgE，CD99，Ras G12V，组织因子1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2)，CLDN6，P-糖蛋白，STEAP1，Liv1，连接素-4，Cripto，MPL，gpA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，STEAP1，WISP1，SLC34A2，和被TNT抗体识别的抗原。
本公开提供了BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的抑制剂，以及通过使用这样的组合物和/或如本文中所述的其它方式增强免疫效应细胞功能(例如，表达CAR的细胞功能)的方法。本领域已知的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的任何抑制剂，都可以用作根据本公开的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂。在某些实施方案中，TRAIL和DR5的抑制剂也被用于预防、改善或治疗免疫疗法(例如，兰妥莫单抗)和免疫效应细胞疗法产品(例如，CAR-T)的副作用(例如，CRS和神经毒性)。在下面描述了BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的抑制剂的例子。
根据本公开，基因编辑系统可以用作BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的抑制剂。本公开也涵盖了编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5基因编辑系统的一种或多种组分的核酸的用途。许多基因编辑系统诸如CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、Talons等是本领域已知的且可以用在本公开的方法中。
CRISPR/Cas系统可以用于修饰，例如删除基因的一个或多个核酸或基因调节元件，或引入提前终止，从而减少功能基因(例如，BRD9)的表达。CRISPR/Cas系统可替换地可以像RNA干扰一样使用，以可逆方式关闭基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至BRD9启动子，从而在空间上阻断RNA聚合酶。
本公开的一种示例性gRNA分子包含第一核酸和第二核酸序列，例如，由第一核酸和第二核酸序列组成，所述第一核酸具有序列(其中“n'”表示靶向序列的残基(例如，如本文中所述，例如，在表8中)，且可以由15-25个核苷酸组成，例如，由20个核苷酸组成)：nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2041)；所述第二核酸序列具有序列：AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC，任选地具有1、2、3、4、5、6或7个(例如，4或7个，例如，7个)在3'末端的额外U核苷酸(SEQ ID NO：2042)。
第二核酸分子可以可替换地由以上序列的片段组成，其中这样的片段能够与第一核酸杂交。这样的第二核酸分子的一个例子是：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAG UGGCACCGAGUCGGUGC，任选地具有1、2、3、4、5、6或7个(例如，4或7个，例如，7个)在3'末端的额外U核苷酸(SEQ ID NO：2054)。
本公开的另一种示例性gRNA分子包含第一核酸，例如，由第一核酸组成，所述第一核酸具有序列(其中“n'”表示靶向序列的残基(例如，如本文中所述，例如，在表8中)，且可以由15-25个核苷酸组成，例如，由20个核苷酸组成)：nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUA GAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2055)，任选地具有1、2、3、4、5、6或7个(例如，4或7，例如，4个)在3'末端的额外U核苷酸。
可替换地，可以从商业卖方诸如Integrated DNA Technologies(IDT)获得gRNA，其中gRNA含有靶标特异性序列，用于将Cas9蛋白引导至基因的基因组位置。在IDT网站(www.idtdna.com)，使用用户定义的前间区序列设计，可以定购、预先设计或定制设计与tracrRNA或sgRNA形成gRNA双链体的crRNA或crRNA XT，它们是由crRNA和tracrRNA序列构成的单个RNA分子。使用生产商的说明书和/或本领域已知的方法，crRNA或sgRNA可以用于编辑基因。
在实施方案中，所述gRNA包含靶向序列，该序列与被靶向的基因(例如，BRD9)的15-25个核苷酸(例如，20个核苷酸)具有完全互补性。在实施方案中，被靶向的基因的15-25个核苷酸(例如，20个核苷酸)，位于紧邻被CRISPR/Cas系统的Cas蛋白识别的前间区序列邻接基序(PAM)序列的5'侧处(例如，在该系统包含化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的情况下，PAM序列包含NGG，其中N可以是A、T、G或C中的任一个)。在本公开的各种实施方案中用于抑制靶标BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的gRNA靶向序列(包括PAM序列)的例子提供在下面表4b中。
在实施方案中，gRNA的靶向序列包含与在表4a中列出的序列互补的RNA序列，例如，由其组成。在实施方案中，所述gRNA包含在表8中列出的序列。
在一个实施方案中，可以将外源DNA与CRISPR/Cas系统一起引入细胞，例如，编码CAR(例如，如本文中所述)的DNA；取决于外源DNA序列和染色体序列，该过程可以用于将编码CAR(例如，如本文中所述)的DNA整合在被CRISPR/Cas系统靶向的位点处或附近。如本文证实的，在实施例中，但是不受理论的约束，这样的整合可以导致CAR的表达以及BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因的破坏。这样的外源DNA分子在本文中被称作“模板DNA”。在实施方案中，所述模板DNA进一步包含在模板DNA的核酸的5'侧、3'侧、或5'和3'侧的同源性臂，其编码一种或多种目标分子(例如，其编码本文描述的CAR)，其中所述同源性臂与靶序列相接的基因组DNA序列互补。
在一个实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统包含Cas9(例如，化脓链球菌Cas9)和包含靶向序列的gRNA，所述靶向序列与靶基因(例如BRD9基因)的序列杂交。在一个实施方案中，所述CRISPR/Cas系统包含编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的gRNA的核酸，以及编码Cas蛋白(例如，Cas9，例如，化脓链球菌Cas9)的核酸。在一个实施方案中，所述CRISPR/Cas系统包含针对靶基因的gRNA和编码Cas蛋白(例如，Cas9，例如，化脓链球菌Cas9)的核酸。
基因组靶序列的例子列出在下面表4a中，可以为其产生用在本公开中的包含互补靶向序列的gRNA。在实施方案中，抑制剂是编码对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL、DR4和DR5具有特异性的gRNA分子的核酸，其中所述核酸包含来自表4a的靶序列的序列，例如，在U6-或H1-启动子的控制下。例如，可以将来自表4a的靶序列克隆进可得自Addgene(质粒#52961)的pLenti-CRISPR-v2载体(SEQ ID NO：359)中，并遵循由分销商提供的说明书。根据分销商提供的说明书和在Sanjana NE,Shalem O,Zhang F.Nat Methods.2014年8月；11(8)：783-4中描述的方法，可以制备和使用编码gRNA的慢病毒载体。
pLenti-CRISPR-v2载体也共表达化脓链球菌Cas9和嘌呤霉素抗性基因。可替换地，这些gRNA从一种载体表达，并且化脓链球菌Cas9从另一种载体表达。从相同载体表达超过一种gRNA的方法是本领域已知的(Kabadi AM等人,Nucleic Acids Research,2014,第42卷,第19e147期,2014)且可以用在本公开的替代实施方案中。
表4a：在指定的被靶向的基因内的gRNA靶序列.
Figure BDA0002987268390000491
Figure BDA0002987268390000501
表4b：靶向不同基因的不同gRNA的靶序列和PAM序列
Figure BDA0002987268390000502
除了Cas9/CRISP以外，其它基因编辑方法(诸如TALEN和锌指核酸酶)可以用在本公开的替代实施方案中。
BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5 TALEN可以用在细胞内，以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不适当地修复断裂，则可以将突变引入在断裂位点处。
使用本领域已知的任意方法，包括使用模块组件的各种方案，可以构建对基因(例如，BRD9)的序列特异性的TALEN。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29：149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6：el9509；US 8,420,782；US 8,470,973，其内容整体通过引用并入本文。
像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不适当地修复，其可以产生移码突变，从而导致基因(例如，BRD9)在细胞中的表达和量的减少。ZFN也可以与同源重组一起使用，以突变基因或在被靶向的序列处或附近的位点引入编码CAR的核酸。如以上所讨论的，可以将编码CAR的核酸作为模板DNA的一部分引入。在实施方案中，模板DNA进一步包含在模板DNA的核酸的5'侧、3'侧、或5'和3'侧的同源性臂，其编码一种或多种目标分子(例如，其编码本文描述的CAR)，其中所述同源性臂与靶序列相接的基因组DNA序列互补。
使用本领域已知的任意方法，可以构建对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因中的序列具有特异性的ZFN。不受理论的约束，据信，使用靶向基因的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas基因编辑系统)可以允许抑制被靶向的基因的一种或多种功能，例如，造成编辑事件，该事件导致截短的基因的表达。再次不受理论的约束，这样的截短的基因/蛋白可以保留被靶向的基因/蛋白的一种或多种功能，同时抑制一种或多种其它功能。在这点上，靶向基因的晚期外显子或内含子的基因编辑系统可以是特别优选的。在一个方面，本公开的基因编辑系统靶向被靶向的基因(例如，BRD9)的晚期(late)外显子或内含子。在一个方面，在适用时，本公开的基因编辑系统抑制剂靶向在外显子8下游的外显子或内含子。
不受理论的约束，在其它实施方案中也可能优选的是，靶向被靶向的基因(例如，BRD9基因)的早期外显子或内含子，例如，在被靶向的基因中引入未成熟终止密码子，其导致基因产物不表达或表达完全无功能的基因产物。在这点上，靶向被靶向的基因(例如，BRD9基因)的早期外显子或内含子的基因编辑系统可以是特别优选的。在一个方面，基因编辑系统BRD9抑制剂，例如，本公开的BRD9抑制剂，靶向BRD9基因的早期外显子或内含子。在一个方面，本公开的基因编辑系统靶向在被靶向的基因的外显子4上游的外显子或内含子。在实施方案中，基因编辑系统抑制剂，例如，BRD9抑制剂，靶向被靶向的基因(例如，BRD9基因)的外显子1、外显子2或外显子3，例如，外显子3。
不受理论的约束，在其它实施方案中也可能优选的是，靶向对以上基因的一种或多种异构体特异性的基因序列，但是不影响以上基因的一种或多种其它异构体。在实施方案中，可能优选的是，特异性地靶向以上含有催化和/或信号传导结构域的基因的异构体。
根据本公开，双链RNA(“dsRNA”)(例如，siRNA或shRNA)可以用作BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。本公开也涵盖了编码所述dsRNA BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂的核酸的用途。
编码shRNA序列的核酸序列的例子提供在表5中。靶序列表示在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因组DNA(或周围DNA)内的序列。在实施方案中，所述BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂是对下面列出的靶序列具有特异性的，或对其mRNA补体具体特异性的siRNA或shRNA。在实施方案中，抑制剂是由编码表5的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的shRNA的核酸编码的shRNA。
在实施方案中，抑制剂是包含下面表5的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的shRNA的核酸，例如，其在U6或Hl启动子的控制下，使得产生BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的shRNA。在实施方案中，本公开提供了包含一序列的siRNA或shRNA，该序列是shRNA的靶序列(例如，表5的任意shRNA的shRNA的靶序列)的RNA类似物(即，所有T核酸残基被替换成U核酸残基)。
表5：靶向不同基因的shRNA的序列
Figure BDA0002987268390000521
使用本领域已知的和如本文中所述的方法，可以设计和试验以上基因的另外dsRNA抑制剂，例如，shRNA和siRNA分子。
在实施方案中，可能优选的是，特异性地靶向基因(例如，BRD9)的异构体，其含有活性结构域，例如催化结构域或信号传导结构域。
表6提供了几种其它化学抑制剂靶向的名称和Cas#，其可以在本公开中使用以产生多种免疫效应细胞群体，以用于细胞疗法的目的和改变BiTE和其它免疫疗法药剂的作用。
表6.可以用在本公开的方法中的不同基因/蛋白的化学抑制剂.
Figure BDA0002987268390000522
Figure BDA0002987268390000531
根据本公开，显性负性突变体可以用作BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。在实施方案中，以上基因的显性负性突变体缺乏催化或信号传导功能。显性失活的BRD9的一个例子是，根据SEQ ID NO：1822的编号，包含具有突变Q479H的SEQ ID NO：1823或由其组成的蛋白。显性失活的BRD9的一个例子是，根据SEQ ID NO：1821的编号，包含具有突变Q479H的SEQ ID NO：1823或由其组成的蛋白。显性失活的BRD9的一个例子是，根据SEQ IDNO：1822的编号，包含具有突变N216A的SEQ ID NO：1820或由其组成的蛋白。在实施方案中，所述显性失活的BRD9可以包括任何前述突变的组合。显性失活的BCOR的例子是，根据SEQID NO：1828的编号，包含具有突变V896L和A165P的SEQ ID NO：1829和1830或由其组成的蛋白。在实施方案中，所述显性失活的BCOR可以包括任何前述突变的组合。显性失活的FBXW10的一个例子是，根据SEQ ID NO：1825的编号，包含具有突变FBXW10-D318N的SEQ ID NO：1826或由其组成的蛋白。显性失活的DR5的一个例子是由SEQ ID NO：2370表示的DR5-L363N。
在实施方案中，本公开的抑制剂是显性失活的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的结合配偶体，例如，显性失活的BRD9结合配偶体或显性失活的DR5结合配偶体。在其它实施方案中，本公开的抑制剂包含编码显性失活的结合配偶体(例如，显性失活的BRD9-结合蛋白或显性失活的DR5-结合蛋白)的核酸。可以以显性失活的方式起作用的DR5结合蛋白的一个例子是，含有其氨基酸80-208(其编码FADD的死亡结构域)，但是缺少其死亡效应物结构域(SEQ ID NO：2463)的FADD(Fas相关的死亡结构域)的缺失突变体。其它例子是Caspase 8的显性负性突变体，例如，Caspase 8D73A(SEQ ID NO：2464)。
如本文中所述的，本公开提供了载体，例如，如本文中所述的载体，其编码抑制剂，诸如基因编辑系统，shRNA或siRNA抑制剂，或BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，例如BRD9(例如，如本文中所述)的显性失活的抑制剂。
在进一步包含例如CAR或TCR的实施方案中，核酸可以进一步包含编码CAR或TCR的序列，例如，如本文中所述。在某些实施方案中，本公开提供了一种载体，其包含编码本文描述的抑制剂的核酸序列，且包含编码本文描述的CAR或TCR分子的核酸序列。在实施方案中，将核酸序列设置在独立的载体上。在其它实施方案中，两个或更多个核酸序列由相同框内的单个核酸分子编码，并且编码为单个多肽链。在该方面，两个或更多个CAR可以例如被一个或多个肽切割位点(例如，自切割位点或细胞内蛋白酶的底物)分隔开。肽切割位点的例子包括F2A(SEQ ID NO：1845)、T2A(SEQ ID NO：1846和1847)和P2A(SEQ ID NO：1848)。这些肽切割位点在本文中被共同地称作“2A位点”。
在实施方案中，所述载体包含编码本文描述的CAR的核酸序列和编码本文描述的shRNA的核酸序列。在实施方案中，所述载体包含编码本文描述的CAR或TCR的核酸序列，和编码本文描述的基因组编辑系统的核酸序列。
本公开提供了增加表达CAR或TCR的细胞(例如，表达如本文中所述的CAR或TCR的细胞，例如，表达CAR19的细胞(例如，CTL019))的治疗效果的方法，所述方法包括减少或消除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的功能或表达的步骤。在实施方案中，所述方法包括，使所述细胞，与如本文中所述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂接触。
本公开提供了增加表达CAR或TCR的细胞(例如，表达如本文中所述的CAR或TCR的细胞，例如，表达CAR19的细胞(例如，CTL019))的安全性的方法，所述方法包括减少或消除TRAIL和/或DR5的功能或表达的步骤。在实施方案中，所述方法包括，使所述细胞，与如本文中所述的TRAIL和/或DR5抑制剂接触。
本公开进一步提供了制造表达CAR和/或TCR的细胞(例如，具有改善的功能(例如，具有改善的效力，例如，肿瘤靶向或增殖)的表达CAR和/或TCR的细胞)的方法，所述方法包括减少或消除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5在所述细胞中的表达或功能的步骤。在实施方案中，所述方法包括，使所述细胞，与如本文中所述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂接触。在实施方案中，所述接触离体完成。在实施方案中，所述接触在体内完成。在实施方案中，在修饰所述细胞以表达CAR或TCR(例如，如本文中所述的CAR或TCR)的同时或以后完成所述接触。
本公开进一步提供了制造表达CAR和/或TCR的细胞(例如，具有改善的安全性(例如，具有更少的造成细胞因子释放综合征或神经毒性的倾向)的表达CAR和/或TCR的细胞)的方法，所述方法包括减少或消除如本文中所述的TRAIL和/或DR5的表达或功能的步骤。在实施方案中，所述方法包括使所述细胞与如本文中所述的TRAIL和/或DR5抑制剂接触。在实施方案中，所述接触离体完成。在实施方案中，所述接触在体内完成。在实施方案中，在修饰所述细胞以表达CAR或TCR(例如，如本文中所述的CAR或TCR)的同时或以后完成所述接触。
在实施方案中，本公开提供了一种抑制BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5在表达CAR/TCR的细胞(例如，表达如本文中所述的CAR/TCR的细胞，例如，表达CAR19的细胞)中的功能或表达的方法，所述方法包括减少或消除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的功能或表达的步骤。在实施方案中，所述方法包括使所述细胞与如本文中所述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂接触。
在一个实施方案中，本公开提供了一种方法，例如，上述的方法，其包括将编码CAR和/或TCR的核酸引入细胞(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞)，在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因内的位点处，或在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因的调节元件处，使得BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达被破坏。例如，使用如上所述的靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因的基因编辑系统，可以完成在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因内的位点处的整合。
在一个实施方案中，本公开提供了一种方法，例如，上述的方法，其包括以下步骤：向细胞中引入基因编辑系统，例如，靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的CRISPR/Cas基因编辑系统，例如，包含gRNA的CRISPR/Cas系统，所述gRNA具有与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因的靶序列互补的靶向序列。在实施方案中，将CRISPR/Cas系统作为gRNA和Cas酶的核糖核蛋白复合物引入所述细胞中，例如，通过电穿孔引入。在一个实施方案中，所述方法包括向所述细胞中引入编码CRISPR/Cas系统的一个或多个组分的核酸。在一个实施方案中，所述核酸设置在编码CAR和/或TCR(例如，如本文中所述的CAR和/或TCR)的载体上。
在一个实施方案中，本公开提供了一种方法，例如，上述的方法，其包括以下步骤：向细胞中引入抑制性dsRNA，例如shRNA或siRNA，其靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，例如，BRD9。在一个实施方案中，所述方法包括向所述细胞中引入核酸，所述核酸编码抑制性dsRNA，例如shRNA或siRNA，其靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，例如，BRD9。在一个实施方案中，所述核酸设置在编码CAR和/或TCR(例如，如本文中所述的CAR和/或TCR)的载体上。
在其它实施方案中，通过接触一定量的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)抑制剂，可以离体处理已经或将要经基因改造成表达CAR/TCR的免疫效应细胞群体(例如，T细胞)，当施用给受试者时，所述抑制剂改善它们的效力和减少它们的副作用(例如，CRS)。
在一个实施方案中，T细胞群体缺乏BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)中的一种或多种。缺乏BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的T细胞，包括不表达BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的RNA或蛋白的细胞，或具有减少的或受抑制的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的活性的细胞。通过遗传方案，例如，施用RNA干扰剂，例如siRNA、shRNA、miRNA，以减少或阻止BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的表达，可以产生BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)-缺陷型细胞。可替换地，通过用本文描述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)抑制剂处理，可以产生BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)-缺陷型细胞。
本公开进一步提供了信号传导分子，诸如JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF以及它们的突变体，及其在免疫和细胞疗法中的使用方法。具体地，本公开提供了免疫效应细胞疗法产品，例如，表达CAR和TCR的T细胞，其包含JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF和它们的突变体，以及与免疫效应细胞疗法产品(例如，CAR-T和TCR-T细胞)联合的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF以及它们的突变体的用途。在下面更详细地描述本公开的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF以及它们的突变体，以及它们的使用方法。在下面进一步描述了CAR、CAR T和TCR-T细胞以及使用方法。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以在含有所述一种或多种构建体的免疫细胞中引起下述效应中的一种或多种：
a)增强这样的免疫效应细胞的增殖
b)调节(增加或减少)免疫效应细胞的细胞因子分泌
c)减少存活和增殖对外源细胞因子的依赖性
d)增强免疫效应细胞的细胞毒性
e)增强免疫效应细胞的存活
f)阻断免疫细胞的细胞凋亡
g)延迟免疫细胞的衰老
h)延迟免疫细胞的衰竭
i)当施用给患者时，增强免疫细胞在体内的持久性
j)当施用给患者时，增强免疫细胞在体内的效力
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以选自JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD27(TNFRSF7，基因ID：939)，CD28(基因ID：940)、41BB(TNFRSF9、CD137；基因ID：3604)、OX40(TNFRSF4，基因ID：7293)、DcR2(TNFRSF10D，基因ID：8793)、DcR1(TNFRSF10C，基因ID：8794)、BCMA(TNFRSF17，基因ID：608)和GITR(TNFRSF18；基因ID：8784)或前述任一种的突变形式。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以包含TRAIL结合结构域，例如，DR5的胞外结构域(细胞外结构域)(SEQ ID NO：2392)；DR4的胞外结构域(SEQ ID NO；2386)、DcR1的胞外结构域(SEQ ID NO：2375)或DcR1的胞外结构域(SEQ ID NO：2380)。在某些实施方案中，包含TRAIL结合结构域的蛋白可以经由跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含CD27、CD28、41BB、BCMA、GITR和OX40的信号传导结构域。表1列出了几种示例性的细胞质(CP)信号传导结构域，和几种示例性的含有细胞外TRAIL结合结构域和细胞质信号传导结构域的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是JAK1(SEQ ID NO：374和SEQ ID NO：1804)或其同系物或直系同源物。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是JAK1的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变：
i)导致与野生型JAK1相比被改变的信号传导(例如，STAT的磷酸化)
ii)导致组成活性信号传导
在JAK1中可以突变的示例性氨基酸包括氨基酸V658和/或S703中的一个或多个
在JAK1中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括V658F(SEQ ID NO：375)和S703I(SEQ ID NO：376)
iii)导致核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1804、1805或1806的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是JAK3的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变
i)导致与野生型JAK3相比被改变的信号传导(例如，STAT的磷酸化)
ii)导致组成活性信号传导
在JAK3(DNA SEQ ID NO：360和蛋白SEQ ID NO：1790)中可以突变以导致改变的信号传导的示例性氨基酸包括M511、A573、R657、Q507、G491、V674和V678中的一个或多个。
在JAK3(DNA SEQ ID NO：360和蛋白SEQ ID NO：1790)中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括M511、A573、R657、Q507、G491、V674、V678M511I、A573V、R657W、Q507P、G491S、V674A、V678L中的一个或多个
iii)核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1790-1797的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是Stat5b(NM_012448.3；SEQ ID NO：368)或其同系物或直系同源物。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是Stat5b的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变：
i)导致与野生型Stat5b相比改变的信号传导
ii)导致组成活性信号传导
在Stat5b(DNA SEQ ID NO：368和蛋白SEQ ID NO：1798)中可以突变以导致改变的信号传导的示例性氨基酸包括T628、N642、Y665、Q706、R659、I704、E579中的一个或多个。
在Stat5b(DNA SEQ ID NO：368和蛋白SEQ ID NO：1798)中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括T628S(SEQ ID NO：1799)、N642H(SEQ ID NO：1800)、Y665F(SEQ IDNO：1801)、Q706L(SEQ ID NO：1802)、R659C(SEQ ID NO：1803)、I704L和E579K中的一个或多个。
iii)核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1798-1803的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是Stat3或其同系物或直系同源物。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是Stat3的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变：
i)导致与野生型Stat3相比被改变的信号传导
ii)导致组成活性信号传导
在Stat3(DNA SEQ ID NO：380和蛋白SEQ ID NO：1810)中可以突变以导致改变的信号传导的示例性氨基酸包括D661、Y640、A702、S614和G618中的一个或多个。
在Stat3(DNA SEQ ID NO：380和蛋白SEQ ID NO：1810)中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括D661Y(SEQ ID NO：1811)、Y640F(SEQ ID NO：1812)、A702T(SEQ IDNO：1813)、S614R(SEQ ID NO：1814)和G618R(SEQ ID NO：1815)中的一个或多个。
iii)核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1810-1815的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是BRAF(例如，NM_004333.4)或其同系物或直系同源物。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是BRAF的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变：
i)导致与野生型BRAF(提供实施例)相比被改变的信号传导
ii)导致组成活性信号传导
在BRAF(DNA SEQ ID NO：388和蛋白SEQ ID NO：1818)中可以突变以导致改变的信号传导的示例性氨基酸包括V600、K601和E586中的一个或多个。
在BRAF(DNA SEQ ID NO：388)和蛋白SEQ ID NO：1818)中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括V600E(SEQ ID NO：1819)、V600D、V600K、V600R、V600any、K601E、K601any、E586K中的一个或多个。
iii)核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1818-1819的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是CARD11(例如，)或其同系物或直系同源物。
在某些实施方案中，所述信号传导分子可以是CARD11的突变形式或其同系物或直系同源物，任选地其中所述突变：
i)导致与野生型CARD11相比被改变的信号传导
ii)导致组成活性信号传导
在CARD11(DNA SEQ ID NO：377和蛋白SEQ ID NO：1807)中可以突变以导致改变的信号传导的示例性氨基酸包括S615和E626中的一个或多个。
在CARD11(DNA SEQ ID NO：377和蛋白SEQ ID NO：1807)中导致改变的信号传导的示例性氨基酸置换包括S615F(SEQ ID NO：1808)和E626K(SEQ ID NO：1809)中的一个或多个。
iii)核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1807-1809的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性，或所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1807-1809的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
其中前述突变关于人序列来指示，但是意图进一步包括与同源或直系同源的残基对应或类似的突变或者同系物或直系同源物的结构域，例如，小鼠JAK1、JAK3、STAT5b、BRAF或CARD11。
在某些实施方案中，所述T细胞异位表达或过表达选自以下的一个或多个基因的野生型或突变体形式：JAK1(SEQ ID NO：371-374)，JAK3(SEQ ID NO：360-367)，STAT5b(SEQID NO：368-373)，STAT3(SEQ ID NO：380-385)，IL2RG(SEQ ID NO：386-387)，CARD11(SEQID NO：377-379)，BRAF(SEQ ID NO：388-389)，CD27(TNFRSF7，基因ID：939)，CD28(基因ID：940)、41BB(TNFRSF9、CD137；基因ID：3604)、OX40(TNFRSF4，基因ID：7293)、DcR2(TNFRSF10D，基因ID：8793)、DcR1(TNFRSF10C，基因ID：8794)、BCMA(TNFRSF17，基因ID：608)和GITR(TNFRSF18；基因ID：8784)。使用本文描述的方法，例如，使用慢病毒介导的基因转移，或编码对应基因的DNA或RNA的转染，可以产生异位表达以上基因的野生型和突变体形式的T细胞。
本公开进一步提供了一种载体，其包含编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的序列。
在某些实施方案中，编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的核酸的表达，可以由组成型或诱导型启动子调节。
本公开进一步提供了一种载体，其包含编码免疫受体的序列，和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的野生型或组成活性突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR基因的野生型和/或突变体的序列。
在一个实施方案中，编码免疫受体的序列，和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的野生型或组成活性突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR基因的野生型和/或突变体的序列，被2A序列分隔开。几种示例性的编码CAR/TCR、2A序列以及JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体的核酸序列由SEQ ID NO：484-499表示。
可以将这些核酸序列克隆进合适的载体(例如，本文描述的载体)中，用于在免疫细胞中表达。可以类似地构建编码其它CAR/TCR和JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的野生型和突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR基因的野生型和/或突变体的载体。
本公开进一步提供了一种载体，其包含编码免疫受体的序列和编码TRAIL拮抗剂的序列。几种示例性的编码CAR/TCR、2A序列和TRAIL拮抗剂的核酸序列由SEQ ID NO；2853-2863、2865-2875、2877-2887、2889-2899、2901-2911、2913-2923、2925-2935表示。本公开进一步提供了一种包含编码TRAIL拮抗剂的序列的载体，其可以用于遗传修饰免疫细胞，例如，免疫效应细胞。
本公开进一步提供了一种载体，其包含编码免疫受体的序列和编码TRAIL受体DR5、DR4、DcR1和DcR2的突变体形式的序列。本公开进一步提供了一种载体，其包含编码TRAIL受体DR5(SEQ ID NO：2318-2330)、DR4(SEQ ID NO：2331-2337)、DcR1(SEQ ID NO：2338-2344)和DcR2(SEQ ID NO：2345-2351)的融合蛋白的序列，该载体可以用于遗传修饰免疫细胞，例如，效应细胞，从而阻断或改变生理学TRAIL受体的活性。
在某些实施方案中，编码CAR/TCR的核酸和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的核酸可以是在相同载体上。
在某些实施方案中，编码CAR/TCR的核酸和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的核酸可以是在不同载体上。
在某些实施方案中，编码CAR/TCR的核酸和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的核酸的表达可以由不同的组成型或诱导型启动子调节。
在某些实施方案中，编码CAR/TCR的核酸和编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和/或GITR基因或TRAIL拮抗剂的野生型或组成活性突变体形式的核酸的表达可以由相同的组成型或诱导型启动子调节。
在某些实施方案中，本公开提供了细胞，其表达免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，且异位表达或过表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF中的一个或多个基因的野生型或突变体形式和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或突变体。
在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，以及JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF中的一个或多个基因的突变体形式。在某些实施方案中，本公开的细胞包含免疫受体(例如，CAR、SIR、TFP、Ab-TCR或TCR)，且异位表达或过表达CD27、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR中的一个或多个基因。在某些实施方案中，免疫细胞(例如，免疫效应细胞)也共表达BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。
在一个方面，本公开提供了一种改变免疫细胞(例如，表达免疫受体的细胞，例如，前述权利要求中的任一项的细胞，例如，表达CAR19的细胞)的表型、分化状态和/或治疗效果的方法，所述方法包括增加JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD27、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR在所述细胞中的表达和/或活性的步骤。在某些实施方案中，所述步骤包括在所述细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的野生型或组成活性突变体。在某些实施方案中，所述步骤包括在所述细胞中表达CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型或突变体。
在某些实施方案中，如下在细胞中异位表达本公开的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或组成活性突变体：1)通过引入编码它们的野生型或组成活性突变体的核酸序列(DNA或mRNA)；2)通过在基因组基因座处使用同源重组，改变一个或多个内源性等位基因。在某些实施方案中，免疫细胞(例如，免疫效应细胞)也共表达BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。
在一个方面，本公开提供了一种增加表达免疫受体的细胞(例如，前述权利要求中的任一项的细胞，例如，表达CAR19的细胞)的多样性的方法，所述方法包括改变JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD27、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR在所述细胞中的表达和/或活性的步骤。在某些实施方案中，所述步骤包括在所述细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的野生型或组成活性突变体。在某些实施方案中，所述步骤包括在所述细胞中表达CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型或突变体。
在某些实施方案中，如下在细胞中异位表达本公开的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或组成活性突变体：1)通过引入编码它们的野生型或组成活性突变体的核酸序列(DNA或mRNA)；2)通过在基因组基因座处使用同源重组，改变一个或多个内源性等位基因。在某些实施方案中，免疫效应细胞也共表达BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。
在某些实施方案中，BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的基因和/或化学抑制剂，和/或信号传导分子JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF，和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或突变体，可能在免疫细胞中引起下述效应中的一种或多种：
1.增强这样的免疫效应细胞的增殖
2.改变免疫效应细胞的细胞因子分泌
3.减少存活和增殖对外源细胞因子的依赖性
4.增强免疫效应细胞的细胞毒性
5.增强免疫效应细胞的存活
6.阻断免疫细胞的细胞凋亡
7.延迟免疫细胞的衰老
8.延迟免疫细胞的衰竭
9.当施用给患者时，增强免疫细胞在体内的持久性
10.当施用给患者时，增强免疫细胞在体内的效力
11.增强免疫细胞向患病的器官或组织(例如，肿瘤)中的穿透
12.预防或改善由免疫细胞的施用造成的毒性(例如，CRS和神经毒性)
在一个方面，本公开提供了一种处理有此需要的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的如本文中所述的细胞，例如，免疫细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述细胞包含免疫受体，并共表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或突变体。
在一个方面，本公开提供了一种处理有此需要的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的如本文中所述的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述细胞包含免疫受体，并共表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或突变体，和任选地，给所述受试者施用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。
在某些实施方案中，在包含JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体和/或CD28、41BB、OX40、DcR2、DcR1、BCMA和GITR的野生型和/或突变体的免疫疗法和/或细胞疗法开始之前，所述受试者接受使用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的预处理。在某些实施方案中，所述受试者接受BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂，和免疫和/或细胞疗法的同时处理。在某些实施方案中，在施用免疫和/或细胞疗法以后，所述受试者接受使用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂的处理。
本文提供了物质的组合物和使用方法，其用于使用经嵌合抗原受体(CAR)基因改造的细胞疗法产品(例如，T细胞、NK细胞)，或自然或天然TCR，来治疗疾病诸如癌症和免疫障碍。在某些实施方案中，所述细胞经基因改造成表达CAR。本公开不受CAR类型限制。如本文中所述的CAR涵盖在PCT/US2017/024843、WO 2014/160030 A2、WO 2016/187349 A1、PCT/US2016/058305和PCT/US17/64379中描述的第2代CAR和下一代CAR(例如，SIR、zSIR、Ab-TCR和TFP)，它们通过引用整体并入本文。应当指出，类似的物质组合物和使用方法可以用于，使用其它免疫效应细胞(例如，T细胞)，诸如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或经重组TCR基因改造的T细胞，来治疗疾病诸如癌症和免疫障碍。
本发明公开内容的CAR(常规和下一代CAR)的各种组分的一些例子的序列列出在表7a中。表7a也列出了几种示例性的常规CAR和下一代CAR的DNA和蛋白的SEQ ID NO。最后，表7a列出了几种示例性的常规CAR、下一代CAR和TCR的DNA和蛋白的SEQ ID NO，它们也编码包含信号传导蛋白的附属模块。例如，分别由SEQ ID NO(DNA)：484和SEQ ID NO(蛋白)：1911表示的构建体CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-JAK3-M511I是第二代CAR，其包含CD8信号肽、从靶向CD19的FMC63单克隆抗体衍生出的scFv片段、Myc表位标签、41BB共刺激结构域、CD3z信号传导结构域、T2A切割位点和JAK3-M511I突变体。分别由DNA SEQ ID NO：485-490和蛋白SEQ ID NO：1912-1917表示的构建体具有类似的设计，例外地是，JAK3-M511I模块分别被替换成JAK3-A573V、STAT5b-T658F、JAK1-V658F、CARD11-S615F、STAT3-Y640F和BRAF-V600E。构建体CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-JAK3-M511I(SEQ ID NO：491和1918)是靶向CD19并共表达JAK-M511I的双链SIR(合成的免疫受体)。构建体CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-z-P2A-JAK3-M511I(SEQ ID NO：492和1919)是共表达JAK3-M511I的第一代CAR。由SEQ ID NO：493-496表示的构建体是靶向CD19并共表达JAK3-M511I的TFP。构建体CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRb-IAH-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRa-SDVP-6MD]-F-F2A-JAK3-M511I(SEQ ID NO：497和1924)和CD8SP-FMC63-vL-[IgCL-TCRg-6MD]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[IgG1-CH1-TCRd-6MD]-F-F2A-JA K3-M511I(SEQ ID NO：498和1925)是两种靶向CD19并共表达JAK3-M511I的抗体-TCR(Ab-TCR)。构建体NY-ESO-TCRa-F-P2A-NYESO-[hTCRb]-F-F2A-JAK3-M511I(SEQID NO：499和1926)是靶向NY-ESO/HLA-A2复合物并共表达M511I的重组TCR。表7a也列出了几种示例性的CAR、下一代CAR和表达不同TRAIL拮抗剂(例如，DR5-Fc和DR5-融合蛋白)的TCR的SEQ ID NO。以上构建体代表示例性的构建体。通过本领域已知的方法，可以用在表1中列出的本公开的其它附属模块替换附属模块M511I。类似地，通过本领域已知的方法，可以用靶向其它抗原的抗原结合结构域替换CD19抗原结合结构域(例如，FMC63 scFv)。专利申请PCT/US2017/024843、WO 2014/160030 A2、WO 2016/187349 A1、PCT/US2016/058305和PCT/US17/64379描述了靶向几种抗原的常规和下一代CAR。
表7a.常规和下一代CAR的核酸和蛋白的SEQ ID以及CAR组分
Figure BDA0002987268390000641
Figure BDA0002987268390000651
Figure BDA0002987268390000661
Figure BDA0002987268390000671
Figure BDA0002987268390000681
Figure BDA0002987268390000691
Figure BDA0002987268390000701
表7B：核酸载体和组分
Figure BDA0002987268390000702
Figure BDA0002987268390000711
表7C：示例性的CAR/TCR构建体
靶抗原 CAR/TCR构建体的名称 SEQ ID NO
CD19 CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz 2822
BCMA CD8SP-BCMA-J6M0-(vL-vH)-Myc-BBz 2823
CD20 CD8SP-CD20-2F2-(vL-vH)-Myc-BBz 2824
CD123 CD8SP-CD123-1172-(vL-vH)-Myc-BBz 2825
CS1 CD8SP-CS1-HuLuc64-(vL-vH)-Myc-BBz 2826
叶酸盐受体1 CD8SP-FR1-huMov19-(vL-vH)-Myc-BBz 2827
GM1 CD8SP-GM1-5B2-(vL-vH)-Myc-BBz 2828
IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-hu107-(vL-vH)-Myc-BBz 2829
IL13Ra2 CD8SP-IL13Ra2-Hu108-(vL-vH)-Myc-BBz 2830
Her2 CD8SP-Her2-Hu4D5-(vL-vH)-Myc-BBz 2831
间皮素 CD8SP-间皮素-m912-(vH-vL)-Myc-BBz 2832
MPL CD8SP-MPL-161-(vL-vH)-Myc-BBz 2833
WT1/MHC I CD8SP-WT1-Ab1-(vL-vH)-Myc-BBz 2834
AFP/MHC复合物 CD8SP-AFP-76-(vL-vH)-Myc-BBz 2835
NY-ESO/MHC复合物 NY-ESO-[TCRa]-F-P2A-NYESO-[hTCRb] 2836
表7D：可以在APC(抗原呈递细胞)上表达或缀合至抗原呈递底物(APS)的蛋白的细胞外结构域的SEQ ID NO
Figure BDA0002987268390000712
Figure BDA0002987268390000721
本公开提供了细胞疗法产品(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞、NK细胞、CAR-T细胞、TCR-T细胞)，其被基因改造成含有一种或多种靶向造成疾病的或与疾病相关的细胞(诸如癌细胞)的CAR(或TCR)。这通过在CAR或TCR上的对癌症相关抗原具有特异性的抗原结合结构域来实现。存在两类可以被CAR和/或TCR靶向的癌症相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞的表面上表达的癌症相关抗原；和(2)其本身在细胞内的癌症相关抗原，但是，这样的抗原(肽)的片段被MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
因此，表达本公开的CAR的细胞疗法产品(例如，免疫细胞)可以靶向下述癌症相关抗原(肿瘤抗原)中的一种或多种：CD5，CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319,和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20/MS4A1；叶酸盐受体α；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活素(surviving)；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基Lewis抗原)岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，ALK TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，CSPG4-HMW-MAA，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，VEGFR2/KDR，LewsAg，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，绒毛膜促性腺激素激素受体(CGHR)，CCR4，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC)，KSHV-K8.1蛋白，KSHV-gH蛋白，针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体，针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IGE，CD99，RAS G12V，组织因子1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))，P-糖蛋白，STEAP1，LIV1，连接素-4，CRIPTO，MPL，GPA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，整联蛋白B7，Muc17，C16ORF54，VISTA，Muc5Ac，FCRH5，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，WISP1和SLC34A2。
几种示例性的CAR/TCR的SEQ ID NO列出在表7C中。
CAR可以包含结合肿瘤支持抗原(例如，如本文中所述的肿瘤支持抗原)的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)。在某些实施方案中，所述肿瘤支持抗原是在基质细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)上呈递的抗原。
本公开涵盖重组DNA构建体，其包含编码天然的(例如，TCR)或合成的免疫受体(例如，第2代CAR或SIR)的序列。
在具体方面，CAR可以包含scFv结构域，其中所述scFv可以在前面具有任选的前导序列(诸如在SEQ ID NO(蛋白)：1834和1835中提供的)，并在后面具有任选的铰链序列和跨膜区域(诸如在SEQ ID NO：1854中提供的)，包括SEQ ID NO：1857的细胞内信号传导结构域，和包括SEQ ID NO：1857或SEQ ID NO：1858的CD3ζ序列，例如，其中前述结构域邻接并在相同的读码框中以形成单个融合蛋白。
一种示例性的前导序列提供为SEQ ID NO：1834。
一种示例性的铰链和跨膜结构域序列提供为SEQ ID NO：1854。4-lBB蛋白的细胞内信号传导结构域的一种示例性序列提供为SEQ ID NO：1857。一种示例性的CD3ζ结构域序列提供为SEQ ID NO：1858或SEQ ID NO：1859。
靶向CD19的示例性第二代CAR呈现在SEQ ID NO：1903和1904中。这些CAR构建体也编码嘌呤霉素抗性基因(PAC)，其通过T2A切割序列与CAR多肽分隔开。靶向CD19并共表达JAK3(SEQ ID NO：1911和1912)、STAT5b(SEQ ID NO：1913)、JAK1(SEQ ID NO：1914)、CARD11(SEQ ID NO：1915)、STAT3(SEQ ID NO：1916)和BRAF(SEQ ID NO：1917)的组成活性突变体的示例性第二代CAR的名称和SEQ ID显示在表7a中。
本公开也涵盖表达下一代CAR构建体(包括K13(vFLIP)-CAR、SIR(合成的免疫受体)、Ab-TCR和TFP)的免疫效应细胞。共表达CAR构建体的示例性K13由SEQ ID NO：1908和1909表示。这些CAR构建体也共表达嘌呤霉素抗性基因(PAC)，其是任选的且可以被删除。共表达任选的PAC基因的示例性SIR构建体由SEQ ID NO：1906和1907表示。
靶向CD19并共表达JAK3-M511I突变体的组成活性突变体的示例性SIR(SEQ IDNO：1918)、K13-CAR(SEQ ID NO：1919)、Ab-TCR(SEQ ID NO：1924-1925)和TFP(SEQ ID NO：1920-1922)的名称和SEQ ID显示在表7a中。通过用对应于其它组成活性突变体的cDNA替换编码JAK3-M511I的cDNA，可以构建共表达其它组成活性突变体的构建体。本公开包括可以用在本公开的各种实施方案中的逆转录病毒和慢病毒载体构建体(SEQ ID NO：337和338)。
本公开还包括可以直接转染进细胞中的RNA构建体。一种用于产生转染所用的mRNA的方法包括，用特别设计的引物在体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文描述的3'和/或5'UTR)、5'帽(例如，本文描述的5'帽)和/或内核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)、要表达的核酸和聚腺苷酸尾巴(通常50-2000个碱基长度)的构建体(SEQ ID NO：341)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，所述模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导进细胞，例如，T细胞或NK细胞。
CAR/TCR包含靶标特异性结合元件，它另外被称作抗原结合结构域。在本领域中描述了针对许多抗原的常规和下一代CAR(例如，SIR、Ab-TCR、TFP等)，包括在专利申请PCT/US2017/024843和PCT/US17/64379中，它们通过引用整体并入本文。在这些申请中描述的CAR可以与本公开的方法组合使用，以靶向不同的抗原用于预防和治疗多种疾病状况，其中与疾病相关的或造成疾病的细胞表达被CAR靶向的特定抗原。类似地，靶向不同抗原和新抗原的TCR是本领域已知的且可以与本公开的方法组合使用。最后，通过使用本公开的方法，可以改善在用新抗原肽接种后产生的肿瘤浸润性淋巴细胞和T细胞的效力和安全性。
在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含来自上面列出的抗体的一种、两种、三种(例如，所有三种)重链CDR、HC CDRl、HC CDR2和HC CDR3和/或来自在PCT/US2017/024843和PCT/US17/64379中描述的抗体或单链可变片段的一种、两种、三种(例如，所有三种)轻链CDR、LC CDRl、LC CDR2和LC CDR3。在另一个方面，所述抗原结合结构域是细胞因子、受体、centryn、非免疫球蛋白抗原结合结构域。
在另一个方面，本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR-T细胞)可以进一步表达另一种药剂，例如，增强细胞疗法产品(例如表达CAR的细胞)的活性的药剂。例如，在一个实施方案中，所述药剂可以是JAK3(SEQ ID NO：1911和1912)、STAT5b(SEQ ID NO：1913)、JAK1(SEQID NO：1914)、CARD11(SEQ ID NO：1915)、STAT3(SEQ ID NO：1916)和BRAF(SEQ ID NO：1917)的组成活性突变体。在另一个实施方案中，所述药剂可以是BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的抑制剂。
在另一个方面，本公开提供了一种细胞群体疗法产品，例如，CAR-T和/或TCR-T细胞。在某些实施方案中，所述细胞疗法产品包含表达不同CAR的细胞的混合物。
在另一个方面，本公开提供了一种细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达CAR，所述CAR具有对本文描述的癌症相关抗原的抗原结合结构域，且第二种细胞表达另一种药剂，例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂。在一个方面，本公开提供了方法，其包括与另一种药剂(例如，激酶抑制剂，诸如本文描述的激酶抑制剂)组合地施用表达CAR的细胞(例如，CART细胞)群体，例如，表达不同CAR的细胞的混合物。在另一个方面，本公开提供了方法，其包括与另一种药剂(例如，激酶抑制剂，诸如本文描述的激酶抑制剂)组合地施用细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达CAR，所述CAR具有本文描述的癌症相关抗原的抗原结合结构域，且第二种细胞表达另一种药剂，例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂。
可以使用本领域已知的方法，向细胞递送编码本公开的不同构建体(例如，CAR，SIR，TCR，JAK3、STAT5等的组成活性和显性负性突变体)的核酸。一种用于产生转染所用mRNA的方法可以包括，用特别设计的引物在体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内核糖体进入位点(IRES)、要表达的核酸和聚腺苷酸尾巴(通常50-2000个碱基长度)的构建体(SEQ ID NO：32)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，所述模板包括CAR的序列。
在某些方面，非病毒方法可以用于将编码本文描述的不同构建体的核酸递送进细胞或组织或受试者中。在某些实施方案中，所述非病毒方法包括转座子(也称为转座元件)的应用。使用转座子的示例性核酸递送方法包括睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统(SETS)和piggyBac(PB)转座子系统。
构建和递送具有不同CAR配置(包括下一代CAR)的载体的方法是本领域已知的且描述在专利申请PCT/US2017/024843、WO 2014/160030 A2、WO 2016/187349 A1、PCT/US2016/058305和PCT/US17/64379(它们通过引用整体并入本文)中。
本公开也提供了在其中插入了本公开的DNA的载体。从逆转录病毒诸如慢病毒衍生出的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定地整合及其在子代细胞中的繁殖。
在细胞疗法产品的制造过程中，通常可以使用本领域已知的方法活化和繁殖免疫效应细胞(例如，T细胞)。通常，免疫效应细胞群体(例如，普乐沙福动员的细胞)通过与一表面接触进行繁殖，该表面具有附着其上的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。
在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每种信号的试剂可以是在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，试剂可偶联至同一表面(即，以“顺式”形式)或偶联至单独表面(即，以“反式”形式)。可替换地，可以将一种试剂偶联至表面，并使另一种试剂在溶液中。
本公开提供了新颖的抗原呈递细胞，用于在细胞疗法产品的制造过程中活化和繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，通过与抗原呈递细胞共培养，繁殖用编码CAR(例如，CAR，例如，SIR)的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，通过与表达被CAR靶向的抗原的细胞共培养，繁殖用编码CAR(例如，本文描述的CAR)的核酸转导的T细胞。在一个实施方案中，将T细胞用编码CAR的核酸转导，并通过将它们与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和/或细胞系共培养进行繁殖。在一个实施方案中，将T细胞用编码CD19 CAR(例如，本文描述的CD19 CAR，例如，由SEQ ID NO：2822、479、484-498表示的CAR)的核酸转导，并通过将它们与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和细胞系共培养进行繁殖。在一个实施方案中，将T细胞用编码CD20CAR(例如，本文描述的CD20 CAR，例如，由SEQ ID NO：2824、480或482表示的CAR)的核酸转导，并通过将它们与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和细胞系共培养进行繁殖。在一个实施方案中，将T细胞用编码CD22 CAR(例如，本文描述的CD22 CAR)的核酸转导，并通过将它们与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和细胞系共培养进行繁殖。在一个实施方案中，将T细胞用编码BCMA CAR(例如，本文描述的BCMA CAR，例如，由SEQ ID NO：2823表示的CAR)的核酸转导，并通过将它们与从套细胞淋巴瘤衍生出的细胞和细胞系共培养进行繁殖。可以用于繁殖和/或活化靶向CD19、CD20、CD22和BCMA的CAR-T细胞的从套细胞淋巴瘤衍生出的示例性细胞系包括REC-1、GRANTA-519、MINO和JEKO。在一个优选的实施方案中，所述套细胞淋巴瘤细胞系是REC-1。
在一个实施方案中，将T细胞用编码CAR的核酸转导，并通过将它们与已经用药物(例如，丝裂霉素)或辐照处理过以使它们不能复制的细胞和细胞系共培养进行繁殖。使细胞和细胞系不能复制的方法是本领域已知的和/或可以使用本领域已知的方法确定。
在一个实施方案中，将T细胞在培养物中繁殖几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的时间段。在一个实施方案中，将细胞繁殖4-9天的时间段。在一个实施方案中，将细胞繁殖8天或更少的时间段，例如，7、6或5天。
在一个实施方案中，将细胞(例如，本文描述的CD19 CAR-T细胞)在培养物中繁殖5天，得到的细胞比在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞更有效。在一个实施方案中，将CAR-T细胞(例如，本文描述的CD19 CAR-T细胞)与套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)一起在培养物中繁殖14天，得到的细胞比在相同培养条件下但是没有套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)在培养物中繁殖的相同CAR-T细胞(例如，本文描述的CD19 CAR-T细胞)更有效。在一个实施方案中，将CAR-T细胞(例如，本文描述的CD20 CAR-T细胞)与套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)一起在培养物中繁殖14天，得到的细胞比在相同培养条件下但是没有套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)在培养物中繁殖的相同CAR-T细胞(例如，本文描述的CD20 CAR-T细胞)更有效。在一个实施方案中，将CAR-T细胞(例如，本文描述的CD22 CAR-T细胞)与套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)一起在培养物中繁殖14天，得到的细胞比在相同培养条件下但是没有套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)在培养物中繁殖的相同CAR-T细胞(例如，本文描述的CD22 CAR-T细胞)更有效。在一个实施方案中，将CAR-T细胞(例如，本文描述的BCMA CAR-T细胞)与套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)一起在培养物中繁殖14天，得到的细胞比在相同培养条件下但是没有套细胞淋巴瘤细胞(例如，REC-1细胞)在培养物中繁殖的相同CAR-T细胞(例如，本文描述的BCMA CAR-T细胞)更有效。
例如，可以通过各种T细胞功能，例如增殖、靶细胞杀死、细胞因子产生、活化、迁移或它们的组合，来定义效能。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比，繁殖5天的细胞(例如，本文描述的CD19 CAR-T细胞)在抗原刺激后表现出细胞加倍的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文描述的表达CD19CAR的细胞)在培养物中繁殖5天，得到的细胞表现出与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比更高的促炎性细胞因子产生，例如，IFN-y和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比，繁殖5天的细胞(例如，本文描述的CD19 CAR-T细胞)表现出促炎性细胞因子产生(例如，IFN-y和/或GM-CSF水平)的至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加(pg/ml)。
可能还需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640，或X-vivo 15(Lonza))，其可能含有增殖和生存力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF和TNF-α或熟练的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括、但不限于表面活性剂、血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，并添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充了适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足够T细胞生长和繁殖的量的细胞因子。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅被包括在实验培养物中，而不被包括在要输入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气+5％CO2)。
在一个实施方案中，在适当的培养基(例如，本文描述的培养基)中繁殖细胞，所述培养基包括一种或多种白介素，其导致例如通过本文描述的方法(诸如流式细胞计量术)所测量的，在14天繁殖阶段中细胞的至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)增加。在一个实施方案中，在有IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下繁殖细胞。
在本公开的一个实施方案中，在适当的培养基(例如，本文描述的培养基)中繁殖细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)，例如，免疫效应细胞，例如，T细胞，例如，CART-T细胞、TCR-T细胞或TIL，所述培养基包括一种或多种BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的抑制剂，其导致例如通过本文描述的方法(诸如流式细胞计量术)测量，在14天繁殖阶段中T干细胞或T干记忆细胞的至少1.5倍(例如，2倍、5倍、10倍、50倍)增加。在一个实施方案中，在有IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL和/或DR5的抑制剂存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，所述TRAIL抑制剂是TRAIL抗体，其阻断或中和TRAIL对其受体DR5和/或DR4的结合作用或活性。在一个示例性实施方案中，在有针对TRAIL的中和抗体存在下繁殖细胞。一种示例性的针对TRAIL的中和抗体由可从R&D Systems得到的TRAIL抗体MAB375-SP代表。在一个实施方案中，在有至少1ng/ml(例如，2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的TRAIL抗体(例如，MAB375-SP)存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL抗体(例如，MAB375-SP)存在下繁殖细胞至少1天(例如，2天、5天、10天、15天、20天)。在一个实施方案中，所述TRAIL抑制剂是TRAIL受体的可溶形式。示例性的可溶性TRAIL受体包括：DR5-Fc融合蛋白(Sigma-Aldrich；D9563)，DR5-SP-ECD-hIgFc(SEQ ID NO：2428)，重组人TRAILR1/TNFRSF10A Fc嵌合体蛋白，CF(R&D Systems)，DR4-Fc融合蛋白(Sigma-Aldrich；D9438)，DR4-SP-ECD-hIgFc(SEQ ID NO：2441)，重组人TRAIL R3/TNFRSF10C Fc嵌合体蛋白(R&D Systems)；DcR1-SP-ECD-hIgFc(SEQ ID NO：2448)；重组人TRAIL R3/TNFRSF10C Fc嵌合体蛋白(R&D Systems)和DcR2-ECD-hIgFc(SEQ ID NO：2455)。在一个实施方案中，在有至少1ng/ml(例如，2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)的纯化的可溶性TRAIL受体例如DR5-Fc融合蛋白(Sigma-Aldrich；D9563)或DR4-Fc融合蛋白(Sigma-Aldrich；D9438)存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有可溶性TRAIL受体(例如，DR5-Fc、DR4-Fc、DcR1-Fc或DcR2-Fc)存在下繁殖细胞至少1天(例如，2天、5天、10天、15天、20天)。在某些实施方案中，在有中和性TRAIL抗体(例如，MAB375-SP)和可溶性TRAIL受体(例如，DR5-Fc、DR4-Fc、DcR1-Fc或DcR2-Fc)二者存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL和/或DR5的核酸抑制剂(例如，shRNA、siRNA或gRNA)存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL抑制剂以及BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2和AKT中的一种或多种的抑制剂存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL抑制剂以及CD3抗体、CD28抗体、41BB抗体(Utomilumab)、双特异性的/多特异性的T细胞衔接物(例如，本文描述的双特异性的或多特异性的衔接物，例如，兰妥莫单抗)中的一种或多种存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有TRAIL抑制剂和双特异性的/多特异性的T细胞衔接物(例如，本文描述的双特异性的或多特异性的衔接物)存在下，在有抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)(例如，本文描述的APC或APS，例如，REC-1细胞或CD19-胞外结构域(氨基酸残基61-867)包被的珠子)存在下，繁殖细胞。
本公开也至少部分地涉及，为了过继性细胞疗法的目的而改善细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞，例如，免疫效应细胞，例如，免疫效应T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL)的繁殖和/或活化(例如，体外和体内繁殖和/或活化)的方法。通过本公开的方法可以活化和/或繁殖的细胞(例如，免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞)的非限制性例子包括T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、NKT细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞等。在一个实施方案中，所述细胞是动员的(例如，Plerixafor-动员的)细胞。在一个实施方案中，所述细胞表达BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2和AKT的抑制剂。
在某些实施方案中，所述方法包括，在导致免疫细胞的活化和/或繁殖的条件下，使免疫细胞(例如，免疫效应细胞，例如，本文描述的免疫效应细胞，例如，T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞)与双特异性的或多特异性的衔接物接触，所述衔接物具有两个或更多个抗原结合模块，其中至少一个抗原结合模块结合或衔接免疫细胞，且其中至少一个其它模块结合或衔接抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)。在某些实施方案中，双特异性的或多特异性的衔接物的一个或所有抗原结合模块包含以下物质或由以下物质组成：(1)抗体；(2)抗体片段(例如Fv、Fab、(Fab')2)；(3)抗体的重链可变区(vH结构域)或其片段；(4)抗体的轻链可变区(vL结构域)或其片段；(5)单链可变片段(scFv)或其片段；(6)单结构域抗体(SDAB)或其片段；(7)骆驼科VHH结构域或其片段；(8)抗体的单体可变区；(9)非免疫球蛋白抗原结合支架诸如DARPIN、affibody、affilin、adnectin、affitin、obodies、重复体(repebody)、fynomer、α体(alphabody)、亲和体(avimer)、atrimer、centyrin、pronectin、anticalin、kunitz结构域、犰狳重复蛋白或其片段；(10)受体或其片段；(11)配体或其片段。在某些实施方案中，双特异性的或多特异性的衔接物的两个或更多个抗原结合模块属于相同类型，例如，scFV或vHH。在某些实施方案中，双特异性的或多特异性的衔接物的两个或更多个抗原结合模块属于不同类型，例如，scFV和vHH结构域；scFv和centyrin；vHH结构域和affibody；scFv、vHH结构域和centyrin。
在一个实施方案中，双特异性的或多特异性的衔接物是双特异性抗体分子，例如，兰妥莫单抗。双特异性抗体具有对不超过两种抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，所述第一表位和第二表位是在相同抗原例如相同蛋白(或多聚体蛋白的亚基)上。在一个实施方案中，所述第一表位和第二表位发生重叠。在一个实施方案中，所述第一表位和第二表位不发生重叠。在一个实施方案中，所述第一表位和第二表位是在不同抗原例如不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含，对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含，对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。
在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含，对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施方案中，所述衔接物是抗体分子，其为多特异性的(例如，双特异性的或三特异性的)分子。产生双特异性或异源二聚体抗体分子的方案是本领域已知的。
在双特异性抗体分子的各抗体或抗体片段(例如，scFv)内，VH可以是在VL的上游或下游。在某些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成它的VH(VH1)在它的VL(VL1)的上游，且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成它的VL(VL2)在它的VH(VH2)的上游，使得总双特异性抗体分子具有排列VH1-VL1-VL2-VH2。在其它实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成它的VL(VL1)在它的VH(VH1)的上游，且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)排列成它的VH(VH2)在它的VL(VL2)的上游，使得总双特异性抗体分子具有排列VL1-VH1-VH2-VL2。
在某些实施方案中，所述双特异性的或多特异性的衔接物靶向要活化和/或繁殖的免疫细胞所表达的至少一种抗原(例如，CD3、CD28、CD27、41BB等)，和除了要活化和/或繁殖的免疫细胞以外的细胞所表达的至少一种其它抗原(例如，CD19、间皮素、Her2、Her3、EGFR viii等)。在某些实施方案中，所述其它抗原由抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)(例如，CD19胞外结构域包被的珠子)表达或呈递。在某些实施方案中，由APC或APS表达的至少一种其它抗原(例如，CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、CD123、MPL、BCMA、CS1、CD138、CD38等)是在造血细胞(例如，B谱系细胞、骨髓谱系细胞或浆细胞或细胞系，例如，REC-1、NALM6、HL60、K562、BC-1、U266等)上表达。在某些实施方案中，由APC或APS表达的至少一种其它抗原(例如，Her2，Her3，EGFR，间皮素，CDH19，CDH6等)是在非造血细胞(例如，乳房细胞、肺细胞、结肠细胞、皮肤细胞等)或细胞系(例如，乳腺癌细胞系，例如，MCF7，肺癌细胞系，例如，H460，或结肠癌细胞系，例如，SW480等)上表达。
可以被本公开的双特异性的或多特异性的衔接物识别以活化和/或繁殖免疫细胞的、由APC或APS表达的抗原的非限制性例子包括以下项中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20/MS4A1；叶酸盐受体α；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；surviving；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基Lewis抗原)岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，ALK TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，CSPG4-HMW-MAA，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，VEGFR2/KDR，Lews Ag，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，绒毛膜促性腺激素激素受体(CGHR)，CCR4，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC)，KSHV-K8.1蛋白，KSHV-gH蛋白，针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体，针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IGE，CD99，RAS G12V，组织因子1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))，P-糖蛋白，STEAP1，LIV1，连接素-4，CRIPTO，MPL，GPA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，整联蛋白B7，Muc17，C16ORF54，VISTA，Muc5Ac，FCRH5，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，WISP1和SLC34A2。
本文描述的一些实施方案提供了，通过将它们暴露于双特异性的或多特异性的衔接物来繁殖和/或活化免疫T细胞，所述衔接物含有能够衔接T细胞的一个(或第一)抗原结合结构域以及能够衔接抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)的其它(或第二)抗原结合结构域。应当指出，可以在不影响其活性的情况下，反转双特异性衔接物的抗原结合结构域的顺序。因而，针对CD19的双特异性衔接物可以具有构型CD19 x CD3或CD3 x CD19。在某些实施方案中，所述APC是造血细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括将免疫T细胞暴露于能够活化T细胞上的共刺激性受体(例如，CD28、41BB、CD27等)的激动剂，诸如抗体(例如，Utomilumab)或配体(41BBL)。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物包含能够结合和活化T细胞的T细胞受体(TCR)复合物的至少一个(或第一)结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的包含能够结合和活化TCR复合物的CD3亚基的至少一个(或第一)结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的包含能够结合和活化TCR复合物的CD3-ε亚基的至少一个(或一个)结合结构域。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物包含能够结合和活化T细胞上提供共刺激的受体(即，共刺激性受体)的至少一个(或第一)结合结构域。被双特异性衔接物结合的示例性共刺激性受体包括CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物在有APC或APS存在下，通过TCR复合物活化信号传导。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物在有APC或APS存在下，经由通过共刺激性受体的信号传导活化T细胞。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物包含能够结合造血细胞的至少一个(或第二)结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物包含能够结合淋巴样谱系造血细胞的至少一个(或第二)结合结构域。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物包含能够结合B-淋巴样谱系造血细胞的至少一个(或第二)结合结构域。被双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)结合的示例性B-谱系淋巴样细胞包括未成熟的B细胞、成熟的B细胞和浆细胞和它们的组合。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)包含能够结合在B-淋巴样谱系造血细胞上表达的抗原的至少一个(或第二)结合结构域。被双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的第二结合结构域结合的抗原的非限制性例子包括CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和FCRH5。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD19。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)是兰妥莫单抗。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)是在Moore PA等人，Blood，2011；117(17)：4542-4551中描述的CD19 x CD3DART。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD22。在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD20/MS4A1。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD23。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合BCMA。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是BI 836909(AMG 420)。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CS1/SLAMF7。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD138。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合CD123。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个(第一)抗原结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且所述至少一个其它(或第二)抗原结合结构域结合MPL。表7E提供了几种双特异性抗体的SEQ ID NO，其第一(或之一)抗原结合结构域结合CD3e、CD28或41BB，且其第二(或其它)抗原结合结构域结合不同的抗原，诸如CD19、CD20/MS4A1、CD22、BCMA、CD33、CD123、MPL、叶酸盐受体1等。
在某些实施方案中，T细胞的活化和繁殖包括在有特定细胞存在下将它们暴露于所述双特异性的/多特异性的衔接物，所述特定细胞表达被所述衔接物的至少一个(第二)抗原结合结构域结合的同源配体(例如抗原)。
在某些实施方案中，T细胞的活化和繁殖包括在有固体底物存在下将它们暴露于所述双特异性的/多特异性的衔接物，所述固体底物表达被所述衔接物的至少一个(第二)抗原结合结构域结合的同源配体(例如抗原或抗-独特型抗体)。
在某些实施方案中，所述方法包括通过将它们暴露于两种不同的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)来活化/繁殖免疫T细胞，其中第一种双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个抗原结合结构域结合和活化T细胞受体(例如，通过结合CD3ε)，且第二种双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个抗原结合结构域结合和活化共刺激性受体(例如，41BB或CD28)，且两种双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个抗原结合结构域结合在造血细胞上表达的抗原(例如，CD19、CD22、CD20/MS4A1和/或BCMA等)。在一个示例性实施方案中，所述方法包括，通过在有REC-1细胞存在下将它们暴露于CD19 x CD3和CD19 x 41BB双特异性抗体，来活化/繁殖免疫T细胞。
在一个替代实施方案中，所述方法包括，通过在有REC-1细胞存在下将它们暴露于CD19x CD3和CD22 x CD28双特异性抗体，来活化/繁殖免疫T细胞。在另一个替代实施方案中，所述方法包括，通过在有REC-1细胞存在下将它们暴露于CD20 x CD3和CD22 x CD28双特异性抗体，来活化/繁殖免疫T细胞。在本公开的方法的不同实施方案中，可以用于活化免疫细胞(例如，T细胞)的双特异性衔接物、活化抗体(例如，CD3)、APC、APS和细胞因子的示例性组合呈现在表17中。
前述方法可以在体外、离体或在体内实现。
在某些实施方案中，从来自受试者(例如，癌症患者)的血液样品获得(例如，得到)在本文所述的方法中使用的免疫细胞群体。在一个实施方案中，通过血液成分分离术获得免疫细胞群体。在一个实施方案中，通过血液成分分离术从受试者获得免疫细胞群体，所述受试者已经锻炼或已经施用了CXCR4拮抗剂(例如，普乐沙福或Mozibil)、细胞因子(例如，G-CSF或GM-CSF)、β2肾上腺素能激动剂(例如，肾上腺素)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、化学疗法药物(例如，环磷酰胺、多柔比星)或以上药剂的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括免疫效应细胞，例如，如本文中所述。示例性的免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、骨髓驻留的单核细胞、组织驻留的单核细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括外周血单核细胞(PBMC)或脐带血细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括原代T细胞或淋巴细胞子集，包括、例如，无能T细胞、原初T细胞、T-调节性细胞、Th-17细胞、T干细胞、组织驻留的T细胞、肿瘤浸润性T细胞或它们的组合。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括已经被基因改造成表达靶向特定抗原的天然或合成受体的T细胞。一种示例性的天然受体包括靶向NY-ESO1或WT1的T细胞受体(TCR)。示例性的合成受体包括CAR或下一代CAR(例如，K13-CAR、SIR、zSIR、Ab-TCR、TFP等)或重组TCR(rTCR)。可以被通过本公开的方法活化/繁殖的T细胞靶向的非限制性的示例性靶抗原包括：间皮素，表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；叶酸盐受体α(FRa或FR1)；叶酸盐受体β(FRb)；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；\肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；CD19；CD20/MS4A1；CD123；CD22；CD23，CD30；CD33；CD171；CS-1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；CD319,和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；surviving；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物的受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1 TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基Lewis抗原)；岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，Tn ag，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，Lews Ag，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，绒毛膜促性腺激素激素受体(CGHR)，CCR4，GD3，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，KSHV K8.1，KSHV-gH，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC),针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体，MPL，针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IGE，CD99，RAS G12V，组织FAACTOR 1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))，P-糖蛋白，STEAP1，LIV1，连接素-4，CRIPTO，GPA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，VISTA，CD16ORF54，Muc5Ac，EMR2，Robo4，RNF43，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，STEAP1，WISP1，SLC34A2和被TNT抗体识别的抗原。
在优选的实施方案中，T细胞靶向在实体瘤中表达的抗原(例如，间皮素、EGFRviii、CHD6、CDH17、CDH19、DLL3、CLD18A2、ALK、CD276、CD324、B7H4、EGFR、EBNA3c、EpCam1、L1CAM、叶酸盐受体1、GFRa4、STEAP1、Liv1、连接素4、Cripto、gpA33、IL1RAP、GD2、GD3、gp100、ROR1、SLea、PTK7、催乳素受体、LHR、TSHR、Lewis Y、Her2、GCC、SSEA4、IL-13Ra2、PSMA、PSCA、NY-ESO1、WT1、MART1、MAGE1、AFP、TIM1、TROP2、hTERT、MMP16、UPK1B、BMPR1B、Ly6E、STEAP1、WISP1、SLC34A2、VEGFR3、Tn-Muc1和酪氨酸酶等)，且所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)靶向在B细胞(例如，CD19、CD22、CD20/MS4A1等)、浆细胞(例如，BCMA、CD138、SLAMF7等)和髓样细胞(例如，CD123、MPL、CD33)上表达的抗原。
在某些实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的靶抗原是在细胞(例如，在其表面上表达同源抗原的细胞)上表达。在一个实施方案中，所述同源抗原对于所述细胞而言是异源的，例如，是在细胞表面上表达的重组抗原。在另一个实施方案中，所述同源抗原在细胞(例如，肿瘤细胞)上内源性地表达。在前述实施方案中，可以在体外、离体或在体内繁殖免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，例如，通过皮下地、静脉内地或肿瘤内地施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，在体内繁殖T细胞。
在另一个实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的靶抗原存在于非细胞底物上。非细胞底物可以是选自例如平板(例如，微孔滴定板)、膜(例如，硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠子的固体支持物。在实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)分子的靶抗原存在于底物中(例如，在底物表面上)。可以将靶抗原共价地或非共价地固定、附着或结合(例如，交联)至底物。在一个实施方案中，将靶抗原附着(例如，共价地附着)至珠子。可以附着至底物的几种示例性靶抗原的SEQ ID NO提供在表7D中。
在一个方面，将超过一种靶抗原固定在珠子上，要么在相同珠子上，即，“顺式”，要么在单独的珠子上，即，“反式”。作为例子，在有CD19 x CD3双特异性抗体存在下，提供初级活化信号的试剂是CD19-细胞外结构域(CD19-ECD)或其片段，且提供共刺激信号的试剂是抗-CD28抗体；并且两种试剂以等价分子数量共同固定至相同珠子。在一个方面，使用1∶1比例的结合至用于CD4+T细胞繁殖和T细胞生长的珠子的每种试剂。在本公开的某些方面，使用的结合至珠子的两种试剂的比例使得，与使用1∶1的比例观察到的繁殖相比，在有CD19 xCD3双特异性抗体存在下观察到T细胞繁殖的增加。在一个特定方面，与使用1∶1的比例观察到的繁殖相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，结合至珠子的两种试剂的比例是在100∶1至1∶100的范围内和之间的所有整数值。在一个方面，比CD19-ECD更多的抗-CD28抗体结合至颗粒，即，CD19-ECD：CD28抗体的比例小于1。在某些方面，与珠子结合的抗CD28抗体与CD19-ECD的比例大于2∶1。在一个特定方面，使用1∶100的与珠子结合的试剂的CD19-ECD：CD28抗体比。
可以使用从1∶500至500∶1和之间的任何整数值的颗粒与细胞之比，来刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以容易地理解，颗粒与细胞之比可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。
例如，小尺寸的珠子仅结合几个细胞，而较大的珠子结合许多细胞。在某些方面，细胞与颗粒之比是在1∶100至100∶1范围内和之间的任何整数值，且在其它方面，所述比例包含1∶9至9∶1和之间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。在有示例性的CD19 x CD3双特异性抗体存在下，导致T细胞刺激的CD19-ECD-和抗-CD28偶联的颗粒与T细胞之比可以如上面所指出的变化，但是，某些优选的值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，其中一种优选的比例是每个T细胞至少1∶1颗粒。在一个方面，使用1∶1或更小的颗粒与细胞之比。在一个特定方面，优选的颗粒∶细胞比例是1∶5。在其它方面，颗粒与细胞之比可以随刺激的天数变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞之比在第一天为1∶1至10∶1，并且每天或以后每隔一天将另外的颗粒以1∶1至1∶10的最终比例(基于添加当天的细胞计数)添加给细胞，持续长达10天。在一个特定方面，颗粒与细胞之比在刺激的第一天为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1∶5。在一个方面，每天或每隔一天添加颗粒至在刺激的第一天的最终比例为1∶1，而在刺激的第三天和第五天为1∶5。在一个方面，颗粒与细胞之比在刺激的第一天为2∶1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1∶10。在一个方面，每天或每隔一天添加颗粒至在刺激的第一天的最终比例为1∶1，而在刺激的第三天和第五天为1∶10。本领域技术人员会明白，多种其它比例可能适用于本公开。具体地，比例将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。在一个方面，最典型的使用比例在第一天为1∶1、2∶1和3∶1的邻域。
在其它方面，将细胞(诸如T细胞)与试剂包被的珠子组合，随后分离珠子和细胞，然后培养细胞。在一个替代性的方面，在培养之前，没有分离试剂包被的珠子和细胞，而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(诸如磁力)来浓缩珠子和细胞，从而导致细胞表面标志物的连接增加，由此诱导细胞刺激。
作为例子，通过使附着有CD19-ECD和抗-CD28的顺磁珠子(CD19-ECDxCD28珠子)接触T细胞，可以连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104-109T细胞)和珠子(以1∶1的比例)在缓冲液例如PBS(不含二价阳离子，例如钙和镁)中组合。再次，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少，且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含目标靶细胞。因此，任何细胞数目都在本公开的上下文内。在某些方面，可能合乎需要的是，显著减小颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、50亿/ml或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在再一个方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其它方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞收率、细胞活化和细胞繁殖。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性的T细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值，并且在某些方面将是期望获得的。例如，使用高细胞浓度允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，例如，通过本文描述的方法，繁殖用编码CAR(例如，本文描述的CAR)的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，将所述细胞在培养物中繁殖几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的时间段。在一个实施方案中，将所述细胞繁殖4-9天的时间段。在一个实施方案中，将所述细胞繁殖8天或更少(例如，7、6或5天)的时间段。在一个实施方案中，将所述细胞(例如，本文描述的CD19 CAR细胞)在培养物中繁殖5天，并且得到的细胞比在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞更有效。例如，可以通过各种T细胞功能，例如增殖、靶细胞杀死、细胞因子产生、活化、迁移或它们的组合，来定义效能。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比，繁殖5天的细胞(例如，本文描述的CD19CAR细胞)在抗原刺激后表现出细胞倍增的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文描述的表达CD19 CAR的细胞)在培养物中繁殖5天，并且与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比，得到的细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生，例如，IFN-y和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在培养物中繁殖9天的相同细胞相比，繁殖5天的细胞(例如，本文描述的CD19 CAR细胞)表现出促炎性细胞因子产生(例如，IFN-y和/或GM-CSF水平)的至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加(按pg/ml)。
在前述实施方案中，可以在体外或离体繁殖所述免疫细胞群体。
在其它实施方案中，将免疫细胞体外刺激的强度定制至期望的水平，例如，通过调整以下项的一种或多种：双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的剂量，表达靶抗原的底物的剂量(例如，表达CD19抗原的珠子或细胞的数目)；在底物上的靶抗原的密度，T细胞暴露于双特异性的/多特异性的衔接物的持续时间，双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)对靶抗原的亲和力。
在一个实施方案中，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和表达双特异性抗体的同源配体(例如，抗原或抗-独特型抗体)的底物(例如，细胞或珠子)存在下，离体培养免疫细胞预定的时间段(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21、22、23或24小时)或(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天)。在一个实施方案中，将免疫细胞培养4-9天的时间段。在一个实施方案中，将免疫表达细胞培养8天或更少(例如，7、6或5天)的时间段。
在一个实施方案中，在有至少0.1pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml或5000ng/ml的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)存在下，离体活化/繁殖免疫T细胞。
在一个实施方案中，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和表达同源抗原的靶细胞存在下，效应物：靶标比例为约0.1∶1、0.5∶1、1∶1、5∶1、10∶1、20∶1或50∶1，离体活化/繁殖免疫效应T细胞。
在一个实施方案中，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和表达同源抗原的珠子存在下，效应物∶珠子比例为约0.1∶1、0.2∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1或50∶1，离体活化/繁殖免疫效应T细胞。
在某些实施方案中，当暴露于双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和表达它的靶抗原的底物(例如，细胞或珠子)时，所述免疫细胞群体显示出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更高的群体倍增。在一个实施方案中，所述免疫细胞群体显示出共8-10或约9的群体倍增。
在一个实施方案中，将免疫T细胞群体繁殖至共每个细胞10-、50-、100-、200-、300-、400-、450-、500-、550-、600-、750-倍或更高的繁殖。在一个实施方案中，将免疫T细胞群体繁殖约500倍。在一个实施方案中，平均细胞繁殖至超过400-600个或约500个细胞。在某些实施方案中，通过本文描述的方法，诸如流式细胞计量术，测量细胞繁殖。在一个实施方案中，在有双特异性抗体的靶抗原存在下，用双特异性抗体刺激以后约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天，测量细胞繁殖。在一个实施方案中，在用双特异性抗体和双特异性抗体的靶抗原刺激以后10-25天，测量细胞繁殖。在一个实施方案中，在用双特异性抗体和双特异性抗体的靶抗原刺激以后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，测量繁殖。
在一个实施方案中，通过施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)预定的时间段(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21、22、23或24小时)或(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、90、100、120天)，在体内活化/繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，将免疫T细胞在体内繁殖2-20天的时间段。在一个实施方案中，将免疫T细胞繁殖12天或更少的时间段，例如，10、7、6或5天。在一个实施方案中，在1-28天的多个循环中施用双特异性抗体，随后是1-14天的休息阶段。
在其它实施方案中，所述双特异性的/多特异性的抗体可以用于在体内活化和/或繁殖免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、TIL等)。将体内免疫细胞刺激的强度定制至期望的水平，例如，通过调整以下一种或多种：双特异性抗体的剂量，双特异性抗体的暴露的持续时间(例如，输注的持续时间)，双特异性抗体的施用频率，双特异性抗体的半衰期，双特异性抗体对靶抗原的亲和力。例如，增加双特异性抗体的剂量可能增加T细胞(包括经基因改造的T细胞)的刺激和繁殖。可替换地，预期中断双特异性抗体的施用会减少T细胞(包括经基因改造的T细胞)的刺激和繁殖。
在一个实施方案中，通过连续输注，来施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)。在一个实施方案中，通过静脉内、皮下、透皮和/或肌肉内注射，来施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)。
在一个实施方案中，在施用淋巴细胞耗竭性化学疗法以后，将免疫效应细胞和双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)施用给受试者。几种淋巴细胞耗竭性化疗方案是本领域已知的。一种示例性的淋巴细胞耗竭性化疗方案包括静脉内30mg/m2/天的氟达拉滨+静脉内500mg/m2/天的环磷酰胺x 3天。在一个示例性实施方案中，在完成淋巴细胞耗竭性化学疗法的施用以后1天，将免疫效应细胞施用给患者。在一个示例性实施方案中，在完成淋巴细胞耗竭性化学疗法的施用以后2天，将免疫效应细胞施用给患者。可以与免疫效应细胞的施用并行地、在免疫效应细胞的施用之前或在免疫效应细胞的施用之后，将双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)施用给受试者。在优选的实施方案中，在免疫效应细胞的施用之后，将双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)施用给受试者。
在一个示例性实施方案中，所述双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)是兰妥莫单抗(BLINCYTO)，且将兰妥莫单抗作为连续静脉内输注使用输液泵以恒定流速施用给受试者，所述输液泵是可编程的、可锁定的、非弹性的，且具有在其处方信息中描述的警告。在一个示例性实施方案中，通过连续输注，以1微克/天、2微克/天、5微克/天、10微克/天、20微克/天、25微克/天、28微克/天、30微克/天或50微克/天的剂量施用兰妥莫单抗。在优选的实施方案中，在每个周期中在第一剂BLINCYTO之前1小时，用静脉内100mg泼尼松或等效物(例如，16mg地塞米松)预先给药后，施用兰妥莫单抗。
通过不同方式，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用，可以实现双特异性抗体的合适组合物的体内施用。具体地，本公开提供了合适组合物的不间断施用。作为一个非限制性例子，不间断的，即连续的施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，所述小泵系统用于计量流入患者体内的治疗剂。通过使用所述泵系统，可以施用包含双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的药物组合物。这样的泵系统通常是本领域已知的，并且通常依赖于装有要输入的治疗剂的药筒的定期更换。当更换这种泵系统中的药筒时，可能发生治疗剂向患者体内的其他方面不间断流动的暂时中断。在这样的情况下，在本公开的药物装置和方法的意义内仍然要考虑在药筒更换之前的施用阶段和在药筒更换之后的施用阶段，并且它们一起构成这样的治疗剂的一个“不间断施用”。
本文描述的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的连续或不间断施用，可以是通过流体递送装置或小泵系统进行的静脉内或皮下施用，所述流体递送装置或小泵系统包括用于将流体驱出蓄池的流体驱动机构和用于致动所述驱动机构的致动机构。用于皮下施用的泵系统可以包括用于刺入患者的皮肤并将合适的组合物递送进患者体内的针头或插管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管而直接固定或附着到患者的皮肤，从而允许泵系统与患者的皮肤之间直接接触。泵系统可以在患者皮肤上附着24小时至几天。泵系统可以是小尺寸的，具有用于小体积的蓄池。作为一个非限制性例子，用于待施用的合适药物组合物的蓄池的体积可以是在0.1至50ml之间。
连续施用可以是通过贴在皮肤上并定期更换的贴剂实现的透皮施用。本领域技术人员知道适用于该目的的用于药物递送的贴剂系统。应当指出，透皮施用特别适合于不间断施用，因为第一耗竭贴剂的更换可以有利地与新的第二贴剂的放置同时进行，例如在紧邻第一耗竭贴剂的皮肤表面上并在即将除去第一耗竭贴剂之前放置新的第二贴剂。不会出现流动中断或电池故障的问题。
本发明的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。合适的药用载体的例子是本领域众所周知的，且包括溶液例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂、不同类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。通过众所周知的常规方法，可以配制包含这样的载体的组合物。制剂可以包含碳水化合物、缓冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原性糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇。一般而言，本文中使用的“药学上可接受的载体”是指与药物施用相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。这样的介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：额外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂诸如EDTA；金属络合物(例如，锌-蛋白复合物)；可生物降解的聚合物，诸如聚酯；成盐的抗衡离子，诸如钠，多元糖醇；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌醇糖(myoinisitose)、半乳糖、拉克替醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；和亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮。
这样的制剂可以用于连续施用，其可以是静脉内或皮下施用，使用和/或不使用泵系统。氨基酸可以是带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、赖氨酸乙酸盐、精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸。表面活性剂可以是去污剂，优选具有>1.2KD的分子量，和/或聚醚，优选具有>3KD的分子量。优选去污剂的非限制性例子是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85。优选的聚醚的非限制性例子是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。在本公开中使用的缓冲系统可以具有优选5-9的pH，并且可以包含柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和乙酸盐。
在单一或分开的制剂中包含双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的本公开的组合物，可以以合适的剂量施用给受试者，所述剂量可以例如通过如下的剂量递增研究确定：对非黑猩猩灵长类动物例如猕猴施用递增剂量的本文所述的多肽。所述组合物或这些组合物也可以与另外的其它蛋白性和非蛋白性药物和细胞疗法产品组合施用。这些药物可以与包含如本文所定义的本文所述的双特异性的/多特异性的衔接物的组合物同时施用，或者以在时间上确定的间隔和剂量在施用所述双特异性的/多特异性的衔接物之前或之后分别施用。剂量方案将取决于主治医师和临床因素。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄，要施用的具体化合物，性别，给药时间和途径，一般健康情况，和并行施用的其它药物。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、混悬液和乳剂。非水性溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、含乳酸盐的林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。另外，本公开的组合物，例如，双特异性的/多特异性的衔接物，可能包含蛋白性载体，如例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。预见到，本公开的组合物除本文所述的多肽外还可能包含其它生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。这样的药剂可能是作用于胃肠系统的药物，充当细胞生长抑制剂的药物，预防高尿酸血症的药物，抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)，调节炎症应答的药物，作用于循环系统的药物和/或本领域已知的试剂诸如细胞因子。还预见到，在单一或分开的制剂中包含双特异性的/多特异性的衔接物的本公开的组合物被应用于另外的共同治疗中，即与另一种抗癌药物组合。
在某些实施方案中，本文中公开的方法进一步包括，使免疫细胞群体与编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸(例如，包含编码CAR或TCR的核酸的载体)接触，由此产生表达CAR或TCR的细胞群体。在某些实施方案中，首先在有其靶抗原(例如，在有CD19+B细胞存在下的兰妥莫单抗)存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫细胞群体，然后再与编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸接触。
在某些实施方案中，在与编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸接触以后，在有其靶抗原(例如，在有CD19+B细胞存在下的兰妥莫单抗)存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫细胞群体。在某些实施方案中，与接触编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸并行地，在有其靶抗原(例如，在有CD19+B细胞存在下的兰妥莫单抗)存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫细胞群体。
用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)加上其同源抗原的活化/繁殖的步骤，和与编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR的核酸接触的步骤，可以在体外、离体、在体内发生，或以不同的组合发生。在某些实施方案中，在体外，在有其靶抗原存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫T细胞，并在体外接触编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸。在某些实施方案中，在体外和在体内，在有其靶抗原存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫T细胞，并在体外接触编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸。在某些实施方案中，在体外和在体内，在有其靶抗原存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫T细胞，并在体内接触编码CAR或TCR分子的核酸。在一个实施方案中，在有其靶抗原(同源配体)和配体或针对共刺激分子的激动剂抗体存在下，用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)活化/繁殖免疫T细胞。示例性的共刺激分子包括41BB、CD28和CD27。在一个实施方案中，所述激动剂41BB抗体是乌拖米单抗(Utomilumab)。在一个实施方案中，在有表达CD19的B细胞存在下，将它们暴露于兰妥莫单抗和Utomilumab来活化/繁殖免疫T细胞。在一个实施方案中，通过给受试者施用兰妥莫单抗和Utomilumab来活化/繁殖免疫T细胞。
在一个实施方案中，编码CAR/TCR分子的核酸选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子载体的核酸是慢病毒。
在其它实施方案中，编码CAR(包括下一代CAR，诸如K13-CAR、SIR、Ab-TCR、TFP等)或TCR分子的核酸是IVT RNA。
在某些实施方案中，双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和CAR分子是针对相同抗原，例如，相同肿瘤细胞抗原。在这样的实施方案中，例如，通过使所述免疫细胞群体接触被双特异性抗体的第二抗原结合结构域或抗-独特型抗体(例如，固定化在如本文中所述的非细胞或细胞底物上的CD19-抗原或抗-CD19个体基因型抗体)靶向的抗原，在体外或离体繁殖和/或活化免疫细胞群体。
可替换地，或组合地，例如通过接触内源性细胞抗原(例如，CD19)，在体内繁殖和/或活化免疫细胞群体。可替换地，或组合地，将免疫细胞群体离体暴露于双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，然后通过输注，例如通过接触内源性细胞抗原(例如，CD19)，进行体内活化。在一个实施方案中，将免疫细胞施用给受试者，例如，作为治疗方案的一部分。
在其它实施方案中，双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和CAR/TCR分子是针对不同的抗原，例如，不同的组织和/或肿瘤细胞抗原。在这样的实施方案中，例如，通过使所述免疫细胞群体接触被双特异性抗体的第二抗原结合结构域或抗-独特型抗体(例如，固定化在如本文中所述的非细胞或细胞底物上的CD19-抗原或抗-CD19个体基因型抗体)靶向的抗原，在体外或离体繁殖和/或活化免疫细胞群体。可替换地，或组合地，例如通过接触内源性细胞抗原(例如，CD19)，在体内繁殖和/或活化免疫细胞群体。可替换地，或组合地，将免疫细胞群体离体暴露于双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，然后通过输注，例如通过接触内源性细胞抗原(例如，CD19)，进行体内活化。在一个实施方案中，将免疫细胞施用给受试者，例如，作为治疗方案的一部分。
在一个实施方案中，被双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个抗原结合结构域结合的抗原选自：CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、CD123、FLT3、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和FCRH5，且CAR/TCR靶向选自以下的抗原：间皮素、EGFR viii、CHD6、CDH17、CDH19、DLL3、CLD18A2、ALK、CD276、CD324、B7H4、EGFR、EBNA3c、EpCam1、L1CAM、叶酸盐受体1、GFRa4、STEAP1、Liv1、连接素4、Cripto、gpA33、IL1RAP、GD2、GD3、gp100、ROR1、SLea、PTK7、催乳素受体、LHR、TSHR、Lewis Y、Her2、GCC、SSEA4、IL-13Ra2、PSMA、PSCA、NY-ESO1、WT1、MART1、MAGE1、AFP、TIM1、TROP2、hTERT、MMP16、UPK1B、BMPR1B、Ly6E、STEAP1、WISP1、SLC34A2、VEGFR3、Tn-Muc1和酪氨酸酶。
在其它实施方案中，所述免疫细胞不仅表达CAR或TCR。在其它实施方案中，所述免疫细胞可以表达调节CAR或TCR的活性的附属模块。示例性的附属模块包括vFLIP K13、vFLIP MC159、NEMO-K277A，以及JAK1、JAK3、STAT5b和BRAF的组成活性突变体。在其它实施方案中，所述免疫细胞可以表达来自BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的一个或多个基因的抑制剂。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在适当的繁殖阶段，和/或与编码CAR和/或TCR的核酸接触以后，储存繁殖的和/或活化的免疫细胞群体。在一个实施方案中，根据本文描述的方法冷冻保存繁殖的和/或活化的和/或表达CAR/TCR的免疫细胞群体。在一个实施方案中，在适当的介质(例如，可输注介质，例如，如本文中所述)中，冷冻保存繁殖的和/或活化的和/或表达CAR/TCR的免疫细胞群体。
在另一个方面，本公开表征了治疗受试者中的障碍或病症(例如，如本文中所述的障碍或病症)的方法。所述方法包括给所述受试者施用根据本文所述的一种或多种方法制备的、繁殖的和/或活化的免疫细胞群体。在实施方案中，所述方法包括获得(例如，得到)繁殖的和/或活化的免疫细胞群体。繁殖的和/或活化的免疫细胞群体可以得自合适的贮存条件，例如，冷冻保存。
在某些实施方案中，所述免疫细胞群体包括免疫效应细胞，例如，本文描述的免疫效应细胞。示例性的免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞和天然杀伤T(NKT)细胞。
在另一个方面，本公开表征了治疗患癌症的受试者或给其提供抗肿瘤免疫的方法。所述方法包括单独地或与另外疗法(例如，如本文中所述的第二种疗法)组合地给所述受试者施用有效量的免疫效应T细胞群体(例如，如本文中所述的繁殖的和/或活化的免疫细胞群体)，其任选地表达CAR和/或外源TCR分子(例如，如本文中所述的第一和/或第二CAR/TCR分子)。
在某些实施方案中，所述治疗方法包括使用一种或多种本文所述的方法获得(例如，得到)繁殖的和/或活化的免疫细胞群体。例如，繁殖的和/或活化的免疫细胞群体可以在先已经通过如下方式得到：使用Plerixafor-动员的T细胞，其中Plerixafor-动员的T细胞在适合CAR分子表达的条件下，引入了CAR分子(例如，编码如本文中所述的CAR分子的核酸分子，例如，编码第一CAR的IVT RNA)；和，在表达双特异性抗体的靶抗原的细胞/底物，例如，表达被双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的至少一个抗原结合结构域结合的靶抗原(例如，同源抗原分子(例如，重组抗原)或抗-独特型抗体分子)的细胞/底物存在下，在使得免疫细胞繁殖和/或活化发生的条件下，使所述表达CAR的细胞群体与本文描述的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)接触。在实施方案中，双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)的靶抗原存在(例如，固定或附着)于如本文中所述的底物(例如，非天然存在的底物)的内部/表面上。可以将繁殖的和/或活化的免疫细胞群体在如本文中所述的合适条件下储存，例如，冷冻保存。
在一个示例性实施方案中，所述CAR针对间皮素(例如，由SEQ ID NO：2832表示的CAR)，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达间皮素CAR的细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 xCD3双特异性抗体)接触。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对间皮素，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达间皮素CAR的细胞与CD19 x CD3 DART接触。在一个示例性实施方案中，所述表达CD19的细胞是正常外周血B淋巴细胞或表达CD19的细胞系。在有CD19 x CD3双特异性的衔接物存在下，可以在体外用于繁殖T细胞的示例性CD19+细胞系包括REC-1、JEKO-1、GRANTA-519、MINO、Nalm6和RAJI细胞系。在有CD19 x CD3双特异性的衔接物存在下，可以在体外用于繁殖T细胞的一种优选的CD19+细胞系是REC-1。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对间皮素，且在有表达BCMA的细胞存在下，使表达间皮素CAR的细胞与BCMA xCD3 DART接触。在有BCMA x CD3双特异性的衔接物(例如，BCMA x CD3DART)存在下，可以在体外用于繁殖T细胞的一种优选的BCMA+细胞系是REC-1。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对间皮素，且在有表达CD123的血细胞存在下，使表达间皮素CAR的细胞与CD123 xCD3 DART接触。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对Her2(例如由SEQ ID NO：2831表示的CAR)，且在有表达CD19的B细胞或B细胞系(例如，REC-1)存在下，使表达Her2 CAR的细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对催乳素受体，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达催乳素受体CAR的细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。在一个示例性实施方案中，所述CAR针对ROR1，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达ROR1 CAR的细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。在另一个示例性实施方案中，所述CAR针对AFP/MHC I复合物，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达AFP-CAR的T细胞与兰妥莫单抗(一种CD19xCD3双特异性抗体)接触。在另一个示例性实施方案中，所述TCR针对NY-ESO/MHC复合物(例如，SEQ ID NO：2836)，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达NY-ESO-TCR的T细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。在另一个示例性实施方案中，所述TCR针对WT1，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达WT1-TCR的T细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。在另一个示例性实施方案中，所述TCR针对MART1，且在有表达CD19的B细胞存在下，使表达MART1-TCR的T细胞与兰妥莫单抗(一种CD19 x CD3双特异性抗体)接触。
表7E提供了几种示例性的双特异性抗体的SEQ ID(DNA)和SEQ ID(蛋白)，所述双特异性抗体通过它们的抗原结合结构域之一结合不同的抗原(例如，CD19、CD20/MS4A1、CD22、BCMA等)，并通过它们的其它抗原结合结构域结合CD3、CD28或41BB。作为一个例子，双特异性抗体FMC63 x CD3由SEQ ID NO(DNA)：2470和SEQ ID NO(蛋白)：2646表示。该双特异性抗体被设计成，当T细胞暴露于表达CD19的靶细胞(例如，REC-1或NALM6细胞)或CD19-珠子时，将活化信号提供给T细胞，包括表达CAR(例如，间皮素-CAR)的T细胞，或提供给表达天然或重组TCR(例如，NYESO-TCR或WT1-TCR)的T细胞。应当指出，即使CAR或TCR不是针对CD19和即使T细胞不表达任何重组CAR或重组TCR，该双特异性抗体也被设计成提供活化信号。
双特异性抗体FMC63 x CD28由SEQ ID NO(DNA)：2526和SEQ ID NO(蛋白)：2702表示。该双特异性抗体被设计成，当T细胞暴露于表达CD19的靶细胞(例如，REC-1或NALM6细胞)或CD19-珠子时，将共刺激提供给T细胞，包括表达CAR(例如，间皮素-CAR)的T细胞，或表达天然或重组TCR(例如，NY-ESO1-TCR或WT1-TCR)的T细胞。应当指出，即使CAR或TCR不是针对CD19和即使T细胞不表达任何重组CAR或重组TCR，该双特异性抗体也被设计成提供共刺激信号。
双特异性抗体FMC63 x 41BB由SEQ ID NO(DNA)：2582和SEQ ID NO(蛋白)：2758表示。该双特异性抗体被设计成，当T细胞暴露于表达CD19的靶细胞(例如，REC-1或NALM6细胞)或CD19-珠子时，将共刺激提供给T细胞，包括表达CAR(例如，间皮素-CAR)的T细胞，或表达天然或重组TCR(例如，NY-ESO1-TCR或WT1-TCR)的T细胞。应当指出，即使CAR或TCR不是针对CD19和即使T细胞不表达任何重组CAR或重组TCR，该双特异性抗体也被设计成提供共刺激信号。
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Figure BDA0002987268390000951
Figure BDA0002987268390000961
通过使用本领域已知的方法，改变双特异性的/多特异性的衔接物对它们的同源抗原的结合亲和力，可以进一步改善使用双特异性的/多特异性的衔接物对T细胞的活化/繁殖。
在一个实施方案中，所述细胞群体(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞)对于要给其施用细胞进行治疗的受试者而言是自体的。在一个实施方案中，所述免疫效应细胞群体对于要给其施用细胞进行治疗的受试者而言是同种异体的。
在一个实施方案中，所述免疫效应细胞群体是从外周血淋巴细胞分离的T细胞。在一个实施方案中，所述免疫效应细胞群体得自已经接受药剂以动员来自组织的免疫细胞的受试者。在一个实施方案中，所述免疫效应细胞群体得自已经施用CXCR4拮抗剂、细胞因子(例如，G-CSF、GM-CSF等)、β2肾上腺素能激动剂、达沙替尼或已经进行锻炼的受试者。在一个实施方案中，通过裂解红血细胞和/或通过除去单核细胞，得到所述T细胞群体。在一个实施方案中，使用例如本文描述的方法从周围淋巴细胞分离所述T细胞群体。在一个实施方案中，所述T细胞包含CD4+T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞包含CD8+T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞包含Pgp+T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞包含T干记忆细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞包含组织驻留的或肿瘤浸润的T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞包含原初T-细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞(例如，免疫效应细胞)包含可以产生免疫细胞的造血干细胞(例如，脐带血细胞)。在一个实施方案中，所述免疫细胞(例如，免疫效应细胞)源自可以产生免疫细胞的诱导多能干细胞(例如，iPSC)。在另一个实施方案中，所述免疫效应细胞包含T干细胞。在另一个实施方案中，所述免疫效应细胞包含NKT细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞群体(例如，免疫效应细胞)可以得自来自受试者的血液样品，例如，通过血液成分分离术得到。
在一个实施方案中，所述方法包括从受试者的肿瘤组织得到免疫效应T细胞群体(即肿瘤浸润性淋巴细胞)。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括从免疫细胞群体产生经基因改造的表达外源RNA或DNA的免疫细胞的群体。
在一个实施方案中，通过在有双特异性的/多特异性的衔接物和固定化的配体(例如，相应抗原分子或抗-独特型抗体)存在下培养免疫细胞，来繁殖和/或活化所述免疫细胞。在一个实施方案中，在将编码CAR或TCR的核酸(RNA或DNA)引入免疫细胞中以后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28、32、36、36或48小时，使免疫效应细胞与T细胞双特异性抗体和同源配体(例如，抗原分子或抗-独特型抗体)接触。在一个实施方案中，在将编码CAR或TCR的核酸(RNA或DNA)引入免疫细胞(例如，免疫效应细胞)中以后小于24、15、12、10或8小时，使免疫细胞与双特异性的/多特异性的衔接物和它的固定化的同源配体(例如抗原分子或抗-独特型抗体)接触。
在一个实施方案中，通过在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和固定化的配体(例如，同源抗原分子或抗-独特型抗体)和针对在免疫T细胞上表达的共刺激性受体的抗体存在下培养免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，来繁殖和/或活化免疫细胞。示例性的共刺激性受体包括CD28、41BB和CD27。在一个实施方案中，所述41BB抗体是Utomilumab。
在一个实施方案中，所述配体是在结合双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)后活化T细胞的分子。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是兰妥莫单抗，且所述固定化的同源配体是表达CD19的B细胞。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是兰妥莫单抗，且所述固定化的同源配体是用CD19细胞外结构域或其片段包被的珠子。在一个实施方案中，所述同源配体是被双特异性抗体的第二抗原结合部分识别的重组抗原。在一个实施方案中，所述配体是抗-独特型抗体或抗体片段或非免疫球蛋白抗原结合支架(例如，它是结合双特异性抗体的第二抗原结合结构域的抗体分子)，例如，抗-CD19独特型抗体。
在一个实施方案中，所述配体附着至底物。在一个实施方案中，所述底物是固体支持物。在一个实施方案中，所述底物选自：微孔滴定板(例如，ELISA平板)；膜(例如，硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、乙酸酯衍生物和它们的组合)；纤维基质、琼脂糖(Sepharose)基质、糖基质；塑料芯片；玻璃芯片；或任何类型的珠子(例如，路明克斯(Luminex)珠子、免疫磁珠(Dynabeads)、磁珠、流式细胞计量术珠子和它们的组合)。在一个实施方案中，所述底物是ELISA板。在另一个实施方案中，所述底物是珠子，例如，Dynabeads。
在一个实施方案中，以1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或15∶1的珠子每个免疫效应细胞的比例，使免疫效应细胞(例如，CAR-T或TCR-T细胞)与配体(例如，抗原包被的珠子)接触。在一个实施方案中，以3∶1的珠子每个免疫效应细胞的比例，使免疫效应细胞与抗原包被的珠子接触。
在一个实施方案中，在适当的培养基(例如，本文描述的培养基)中进一步繁殖免疫效应细胞(例如，CAR-T或TCR-T)，所述培养基可以任选地含有增殖和/或生存力所需的一种或多种因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGF和TNF-α或用于细胞生长的任何其它添加剂。在一个实施方案中，在有IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和/或死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的一种或多种抑制剂存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有AKT抑制剂存在下繁殖细胞。在一个实施方案中，在有IL-2存在下繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，在有CD28抗体包被的珠子存在下繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，在有41BB抗体包被的珠子存在下繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，在有CD28抗体存在下繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，在有41BB抗体存在下繁殖免疫细胞。在一个实施方案中，所述41BB抗体是Utomilumab。
在一个实施方案中，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和它的同源配体存在下，将用编码CAR或TCR(例如，本文描述的CAR或TCR，例如，本文描述的CD19 CAR或NY-ESO-1TCR)的核酸转导的免疫效应细胞在培养物中繁殖几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约40天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天)的时间段。在一个实施方案中，将所述细胞繁殖4-9天的时间段。在一个实施方案中，将所述细胞繁殖8天或更少(例如，7、6、5、4或3天)的时间段。
可以例如通过各种T细胞功能，例如增殖、靶细胞杀死、细胞因子产生、活化、迁移或它们的组合，来定义免疫细胞(例如免疫效应细胞，例如，CAR-T或TCR-T细胞)的效能。在一个实施方案中，与在没有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，T细胞双特异性抗体)和同源配体存在下在培养物中繁殖的相同细胞相比，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，T细胞双特异性抗体)和同源配体存在下繁殖5天的免疫细胞(例如，本文描述的CD19CAR细胞)在抗原刺激后表现出细胞加倍的至少1、2、3或4倍增加。在一个实施方案中，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，T细胞双特异性抗体)和同源配体存在下，将免疫效应细胞(例如，本文描述的表达CD19 CAR的细胞)在培养物中繁殖5天，并且与在相同培养条件下在没有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，T细胞双特异性抗体)和同源配体存在下在培养物中繁殖的相同细胞相比，得到的细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生，例如，IFN-y和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与在相同培养条件下在没有双特异性的/多特异性的衔接物和同源配体存在下在培养物中繁殖的相同细胞相比，在有双特异性的/多特异性的衔接物(例如，T细胞双特异性抗体)和同源配体存在下繁殖5天的免疫效应细胞(例如，本文描述的CD19 CAR细胞)表现出促炎性细胞因子产生(例如，IFN-y和/或GM-CSF水平)的至少1、2、3、4、5、10倍或更多倍的增加(pg/ml)。
在一个实施方案中，通过本文描述的方法(诸如流式细胞计量术)测量，所述免疫细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞)繁殖了至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍或650倍)。在一个实施方案中，细胞繁殖了约500倍。
在一个实施方案中，在用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和它的同源配体(例如，同源抗原分子)刺激后约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天，测量细胞繁殖。在一个实施方案中，在用配体(例如，同源抗原分子)刺激后10-25天，测量细胞繁殖。在一个实施方案中，在用配体(例如，同源抗原分子)刺激后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天，测量繁殖。
在一个实施方案中，在适当的繁殖阶段以后冷冻保存免疫细胞，例如，免疫效应细胞。在一个实施方案中，根据本文描述的方法冷冻保存细胞。在一个实施方案中，将繁殖的细胞冷冻保存在适当的培养基(例如，可输注培养基，例如，如本文中所述)中。
在另一个方面，本公开表征了包含免疫效应细胞群体的反应混合物，其中反应混合物中的群体的多个细胞包含含有CAR/TCR编码序列(例如，CD19 CAR编码序列或NYESO-1TCR编码序列，例如，如本文中所述)的核酸分子。
在一个实施方案中，至少20％、50％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞表达CAR/TCRmRNA。
在另一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫细胞(例如，免疫效应细胞)在它们的细胞表面上表达CAR/TCR。
在一个实施方案中，所述反应混合物可以进一步包含，如本文中所述的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)和它的同源配体(例如，同源抗原分子或抗-独特型抗体)。在一个实施方案中，所述配体是抗原(例如，CD19)，其在细胞表面上表达且被T细胞双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗)的抗原结合结构域之一结合。在另一个实施方案中，所述配体是抗-独特型抗体，例如，抗-CD19独特型抗体。
在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，表达CAR/TCR的T细胞)和配体(例如，抗原)包被的珠子以1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或15∶1的珠子每个免疫效应细胞的比例存在。在一个实施方案中，免疫效应细胞和配体(例如，抗原)包被的珠子以3∶1的珠子每个免疫效应细胞的比例存在。反应混合物进一步包含T细胞双特异性抗体。在一个实施方案中，所述反应混合物进一步包含共刺激分子，诸如41BB激动剂(例如，41BBL或Utomilumab)。
在一个实施方案中，所述反应混合物进一步包含冷冻保护剂或稳定剂，例如，糖、寡糖、多糖和多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐和冠醚。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是葡聚糖。
根据本文描述的方法、制剂和反应混合物，可以将免疫效应细胞(例如，通过本文描述的方法得到，并通过本文描述的双特异性抗体活化/繁殖)基因改造成含有CAR、下一代CAR(例如，SIR、zSIR、TFP、Ab-TCR)和/或靶向一种或多种癌症相关抗原的重组TCR分子。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原是在国际申请WO2015/142675(2015年3月13日提交，其通过引用整体并入本文)中描述的肿瘤抗原。在某些实施方案中，CAR、重组TCR、TCR受体融合蛋白或TFP、抗体TCR或AbTCR，和合成的免疫受体或SIR，如在PCT/US2017/024843、WO 2014/160030A2、WO 2016/187349 A1、PCT/US2016/058305和PCT/US17/64379(它们通过引用整体并入本文)中所述。
在另一个方面，本公开表征了治疗具有癌症的受试者或给其提供抗肿瘤免疫的方法。所述方法包括给所述受试者施用有效量的免疫效应细胞群体，其中所述免疫效应细胞群体通过或者在先已经通过以下方式来繁殖：使所述免疫效应细胞群体接触双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，其中所述双特异性抗体靶向优先在造血细胞上表达的同源抗原分子；和，在有配体(例如，同源抗原分子或抗-独特型抗体分子)存在下，繁殖/活化所述免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，所述核酸是RNA，例如，体外转录的RNA。在另一个实施方案中，所述同源抗原分子是在造血细胞上表达的抗原。在一个实施方案中，所述同源抗原分子或所述抗-独特型抗体分子附着至底物，例如，珠子。在某些实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用包含CAR或重组TCR(例如，包含编码CAR或重组TCR或rTCR的核酸的载体)的免疫细胞群体，其中所述免疫效应细胞群体进行如本文中所述繁殖或在先已经进行了如本文中所述繁殖。在一个实施方案中，所述载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，所述免疫效应细胞群体用载体转导一次，例如，在从来自受试者的血液样品得到免疫效应细胞群体以后1天内，例如，通过血液成分分离术得到。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向同源抗原分子(例如，CD19)，且所述CAR/重组TCR靶向不同的抗原分子(例如，间皮素或NY-ESO-1)。在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向同源抗原分子(例如，CD19)，且所述CAR/rTCR靶向相同的同源抗原分子。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向本文描述的在造血细胞上表达的抗原，例如，CD19，且所述CAR/rTCR靶向本文描述的癌症相关抗原，例如，间皮素或NY-ESO-1。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向在B细胞上表达的抗原(例如，CD19、CD20/MS4A1或CD22)，且CAR/rTCR靶向在实体瘤(例如，乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、胃肠癌、肾癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、内分泌癌和软组织癌)上表达的抗原(例如，间皮素、Her2、Her3、TSHR、LHR、EGFRviii、EGFR、叶酸盐受体α、ROR1、NY-ESO-1、AFP等)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向在浆细胞上表达的抗原(例如，BCMA、CD138、SLAMF7等)，且CAR/rTCR靶向在实体瘤(例如，乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、胃肠癌、肾癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、内分泌癌和软组织癌)上表达的抗原(例如，间皮素、Her2、Her3、TSHR、LHR、EGFRviii、EGFR、叶酸盐受体α、ROR1等)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向在髓样细胞上表达的抗原(例如，CD33，CD123，MPL等)，且CAR/rTCR靶向在实体瘤(例如，乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、胃肠癌、肾癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、内分泌癌和软组织癌)上表达的抗原(例如，间皮素、Her2、Her3、TSHR、LHR、EGFRviii、EGFR、叶酸盐受体α、ROR1、NY-ESO-1、AFP等)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体靶向CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和/或FCRH5，且CAR/rTCR靶向间皮素、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；叶酸盐受体α(FRa或FR1)；叶酸盐受体β(FRb)；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；唾液酸基Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；\肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；CD19；CD20/MS4A1；CD123；CD22；CD23，CD30；CD33；CD171；CS-1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；CD319,和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位，在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位，蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA(XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；surviving；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物的受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL，生物素，c-MYC表位标签，CD34，LAMP1 TROP2，GFRα4，CDH17，CDH6，NYBR1，CDH19，CD200R，Slea(CA19.9；唾液酸基Lewis抗原)；岩藻糖基-GM1，PTK7，gpNMB，CDH1-CD324，DLL3，CD276/B7H3，IL11Ra，IL13Ra2，CD179b-IGLl1，TCRγ-δ，NKG2D，CD32(FCGR2A)，Tn ag，Tim1-/HVCR1，CSF2RA(GM-CSFR-α)，TGFβR2，Lews Ag，TCR-β1链，TCR-β2链，TCR-γ链，TCR-δ链，FITC，促黄体激素受体(LHR)，促卵泡激素受体(FSHR)，绒毛膜促性腺激素激素受体(CGHR)，CCR4，GD3，SLAMF6，SLAMF4，HIV1包膜糖蛋白，HTLV1-Tax，CMV pp65，EBV-EBNA3c，KSHV K8.1，KSHV-gH，甲型流感血凝素(HA)，GAD，PDL1，鸟苷酸环化酶C(GCC),针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体，MPL，针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体，HLA，HLA-A，HLA-A2，HLA-B，HLA-C，HLA-DP，HLA-DM，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DQ，HLA-DR，HLA-G，IGE，CD99，RAS G12V，组织FAACTOR 1(TF1)，AFP，GPRC5D，密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))，P-糖蛋白，STEAP1，LIV1，连接素-4，CRIPTO，GPA33，BST1/CD157，低电导氯离子通道，VISTA，CD16ORF54，Muc5Ac，EMR2，Robo4，RNF43，CLDN6，MMP16，UPK1B，BMPR1B，Ly6E，STEAP1，WISP1，SLC34A2和被TNT抗体识别的抗原。
根据治疗如本文中所述的障碍(例如，癌症)和提供本文描述的抗肿瘤免疫的方法，在某些实施方案中，所述方法包括给受试者施用通过本文描述的方法制备的免疫细胞群体(例如，CAR-T细胞)以及T细胞双特异性抗体。在一些实施方案中，将免疫细胞群体基因改造成表达CAR或rTCR分子，例如本文描述的CAR或rTCR，例如，本文描述的CD19 CAR或NY-ESO-1rTCR。
本文还提供了一种组合物，其包含如本文中所述的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)和双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，所述组合物用于治疗患与肿瘤抗原表达有关的疾病(例如，如本文中所述的障碍)的受试者。
在一个实施方案中，所述癌症是血液学癌症，例如，ALL或CLL。在实施方案中，所述与肿瘤抗原表达相关的疾病选自增殖性疾病、癌变前病症、癌症和与肿瘤抗原表达有关的非癌症相关适应症。
在一个优选的实施方案中，本文描述的与肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。
在前述方法或用途中的任一种的优选实施方案中，与疾病相关的肿瘤抗原选自以下项的一种或多种：间皮素、EGFR viii、CHD6、CDH17、CDH19、DLL3、CLD18A2、ALK、CD276、CD324、B7H4、EGFR、EBNA3c、EpCam1、L1CAM、叶酸盐受体1、GFRa4、STEAP1、Liv1、连接素4、Cripto、gpA33、IL1RAP、GD2、GD3、gp100、ROR1、SLea、PTK7、催乳素受体、LHR、TSHR、Lewis Y、Her2、GCC、SSEA4、IL-13Ra2、PSMA、PSCA、NY-ESO1、WT1、MART1、MAGE1、AFP、TIM1、TROP2、hTERT、MMP16、UPK1B、BMPR1B、Ly6E、STEAP1、WISP1、SLC34A2、VEGFR3、Tn-Muc1和酪氨酸酶。
在一个实施方案中，所述细胞群体对于施用所述群体的受试者而言是自体的。在一个实施方案中，所述细胞群体对于施用所述群体的受试者而言是同种异体的。在一个实施方案中，所述受试者是人。
在一个实施方案中，对于每千克受试者体重，给所述受试者施用104-106免疫细胞，例如，免疫效应细胞。在一个实施方案中，所述受试者接受免疫效应细胞群体的初次施用(例如，104-106免疫效应细胞/千克受试者体重的初次施用，例如，104或105免疫效应细胞/千克受试者体重)，和免疫效应细胞群体的一次或多次后续施用(例如，104-106免疫效应细胞/千克受试者体重的一次或多次后续施用，例如，104-106免疫效应细胞/千克受试者体重)。在一个实施方案中，在前次施用后小于15天(例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)，例如，在前次施用后小于4、3、2天，施用一次或多次后续施用。在一个实施方案中，所述受试者在免疫效应细胞群体的至少三次施用期间，接受共计约106免疫效应细胞/千克受试者体重，例如，受试者接受1x105免疫效应细胞的初始剂量，3x105免疫效应细胞的第二次施用，和6x105免疫效应细胞的第三次施用，和例如，在前次施用后小于4、3、2天施用每次施用。
在某些实施方案中，给所述受试者施用已经被基因改造成表达重组受体诸如嵌合抗原受体(CAR)、下一代CAR(例如，SIR、zSIR、TFP、Ab-TCR、cTCR)或重组TCR的免疫效应细胞。在某些实施方案中，给所述受试者施用免疫效应细胞，其中超过10％、20％、50％、75％、80％、90％、95％、99％的细胞表达重组受体。
在某些实施方案中，给所述受试者施用已经从肿瘤分离出的免疫效应细胞(例如肿瘤浸润性淋巴细胞)。
在某些实施方案中，给所述受试者施用已经用细胞因子或趋化因子活化以攻击肿瘤的免疫效应T细胞(例如，细胞因子活化的杀伤细胞)。
在某些实施方案中，给所述受试者施用细胞疗法产品(例如，CAR-T)和双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)(例如，本文描述的双特异性抗体)，持续预定的时间段(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21、22、23或24小时)或(例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、90、100、120天)。在一个实施方案中，所述受试者接受双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体，例如，本文描述的双特异性抗体)2-20天的时间段。在一个实施方案中，所述受试者接受双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体，例如，本文描述的双特异性抗体)28天或更少的时间段，例如，20、10、7、6或5天。在一个实施方案中，在1-28天的多个循环中，施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)，随后是1-14天的休息阶段。
在一个示例性实施方案中，在施用免疫效应T细胞(例如，CAR-T细胞)以后给所述受试者施用双特异性抗体兰妥莫单抗(BLINCYTO)，且兰妥莫单抗作为连续静脉内输注使用输液泵以恒定流速施用给受试者，所述输液泵是可编程的、可锁定的、非弹性的，且具有在其处方信息中描述的警告。在一个示例性实施方案中，通过连续输注，以1微克/天、2微克/天、5微克/天、10微克/天、20微克/天、25微克/天、28微克/天、30微克/天或50微克/天的剂量施用兰妥莫单抗。在优选的实施方案中，在每个周期中，在第一剂兰妥莫单抗之前1小时静脉内预先给药100mg泼尼松或等效物(例如，16mg地塞米松)，然后施用兰妥莫单抗。
在一个实施方案中，给所述受试者施用如本文中所述的细胞疗法产品(例如，CAR-T)和双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)(例如，兰妥莫单抗)以及如本文中所述的共刺激分子，例如，如本文中所述的41BB激动剂，例如，Utomilumab。在一个实施方案中，以在0.05mg/kg至5.0mg/kg范围内的剂量，静脉内施用Utomilumab。
在一个实施方案中，在施用淋巴细胞耗竭性化学疗法以后，给受试者施用细胞疗法产品(例如，CAR-T)和双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)。几种淋巴细胞耗竭性化疗方案是本领域已知的。一种示例性的淋巴细胞耗竭性化疗方案包括静脉内30mg/m2/天的氟达拉滨+静脉内500mg/m2/天的环磷酰胺x3天。在一个示例性实施方案中，在完成淋巴细胞耗竭性化学疗法的施用以后1天，给所述受试者施用细胞疗法产品(例如，CAR-T)。可以与细胞疗法产品(例如，CAR-T)的施用并行地，在细胞疗法产品(例如，CAR-T)的施用之前，或在细胞疗法产品(例如，CAR-T)的施用之后，给受试者施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)。在优选的实施方案中，在细胞疗法产品(例如，CAR-T)的施用之后，给所述受试者施用双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)。
在某些实施方案中，与增加细胞疗法产品(例如，CAR-T)效力的药剂(例如，如本文中所述的药剂)组合地实现所述方法或用途。例如，在一个实施方案中，所述药剂可以是抑制抑制性分子的药剂。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRl、CD160、2B4和TGFβ。在一个实施方案中，所述药剂是PD-1抗体，例如，派姆单抗。
在一个实施方案中，本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR-T)和双特异性抗体与一药剂(例如，本文描述的药剂)组合施用，该药剂改善与施用表达免疫效应细胞和/或双特异性抗体的细胞有关的一种或多种副作用。例如，免疫效应T细胞和双特异性抗体，与类固醇、IL6R拮抗剂(例如托珠单抗)、IL1R拮抗剂(例如，阿那白滞素)、TRAIL拮抗剂(例如DR5-Fc或针对TRAIL的中和抗体，例如，MAB375-SP)组合地施用。
在一个实施方案中，所述反应混合物进一步包含冷冻保护剂或稳定剂，例如，糖、寡糖、多糖和多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐和冠醚。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是葡聚糖。
在一个实施方案中，所述受试者(例如，从其获得免疫细胞的受试者和/或治疗的受试者)是人，例如，癌症患者。在某些实施方案中，从其获得免疫细胞的受试者是健康供体。在某些实施方案中，从其获得免疫细胞的受试者已经接受动员剂，例如，CXCR4拮抗剂。
在某些实施方案中，所述受试者具有与肿瘤或癌症相关抗原的表达相关的疾病，例如，如本文中所述的疾病。在一个实施方案中，所述受试者具有癌症，例如，如本文中所述的癌症。
在一个实施方案中，所述受试者具有选自以下的癌症：血液学癌症、实体瘤或其转移病灶。在优选的实施方案中，所述癌症是实体瘤。
在实施方案中，所述受试者不具有复发的癌症。在其它实施方案中，所述受试者具有复发的癌症。
在一个实施方案中，从具有实体瘤(例如，乳腺癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃肠癌、脑癌、内分泌癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌和肝癌)的受试者获得(例如，得到)免疫细胞(例如，免疫效应细胞群体)。
在一个实施方案中，从作为同种异体供体(例如，健康供体，例如，不具有癌症的人)的受试者获得(例如，得到)免疫细胞(例如，免疫效应细胞群体)。
下述测定可以用于测定免疫细胞(例如，已经通过使用如本文中所述的双特异性的/多特异性的衔接物(例如，双特异性抗体)繁殖/活化的T细胞)的表型和功能活性。这些测定也可以用于测定表达CAR或重组TCR并且已经使用其它方式(诸如使用CD3 x CD28珠子或与套细胞淋巴瘤衍生的细胞系(例如，REC-1细胞)一起共培养)繁殖的T细胞。所述测定也可以用于测定使用本公开的其它方法(例如，使用TRAIL的抑制剂或通过表达JAK3的组成活性突变体)产生的免疫细胞的表型和功能活性。
进一步，除CD4和CD8标志物以外，其它表型标志物在细胞繁殖过程中显著地、但是大部分可再现地变化。因而，这样的再现性会实现为特定目的定制活化的T细胞产品的能力。
一旦构建了本文描述的CAR，各种测定就可以用于评价分子的活性，例如但不限于在抗原刺激后繁殖T细胞的能力，在没有再刺激的情况下维持T细胞繁殖的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。在下面更详细地描述了评价本公开的CAR的作用的测定。
对原代T细胞中的CAR表达进行蛋白质印迹分析，可以用于检测单体和二聚体的存在。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。
通过流式细胞计量术可以测量在抗原刺激后CAR+T细胞的体外繁殖。也可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+T细胞繁殖。参见，例如，Milone等人,MolecularTherapy 17(8)：1453-1464(2009)。动物模型也可以用于测量CART活性。
以前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如，Milone等人,MolecularTherapy17(8)：1453-1464(2009)。
成像技术可以用于评价CAR在荷瘤动物模型中的特异性运输和增殖。此类测定法已描述于例如Barrett等人,Human Gene Therapy 22：1575-1586(2011)。
其它测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些，也可以用于评价本文描述的CAR、TCR、TIL和其它免疫效应细胞。
在一个方面，本公开提供了用于治疗与本文描述的癌症相关抗原的表达相关的疾病的方法。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达XCAR或XTCR，其中X代表如本文中所述的肿瘤抗原，且其中癌细胞表达所述X肿瘤抗原。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达本文描述的XCAR或XTCR，其中所述癌细胞表达X。在一个实施方案中，X在正常细胞和癌症细胞上表达，但是在正常细胞上以更低的水平表达。在一个实施方案中，例如，如通过本文描述的测定所确定的，所述方法进一步包括选择CAR或TCR，其以允许XCAR结合和杀死表达X的癌细胞的亲和力结合X，但是小于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的表达X的正常细胞被杀死。表7F提供了不同抗原的列表，以及使用表达靶向这些抗原的CAR/TCR的免疫效应细胞和本公开的方法可以预防、抑制或治疗的示例性疾病。
表7F
Figure BDA0002987268390001051
Figure BDA0002987268390001061
Figure BDA0002987268390001071
Figure BDA0002987268390001081
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD19 CAR，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，要治疗的癌症是ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、DLBCL(弥漫性大B细胞性淋巴瘤)、MCL(套细胞淋巴瘤)或MM(多发性骨髓瘤)。
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗免疫障碍的方法，所述细胞被基因改造成表达CD19 CAR，其中造成疾病的或与疾病相关的细胞表达CD19。在一个实施方案中，所述免疫障碍是自身免疫障碍(例如，狼疮、SLE、类风湿性关节炎、舍格伦综合征、结节病等)。
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD22 CAR，其中癌细胞表达CD22。在一个实施方案中，要治疗的癌症是ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、DLBCL(弥漫性大B细胞性淋巴瘤)或MCL(套细胞淋巴瘤)。
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD20/MS4A1 CAR，其中癌细胞表达CD20/MS4A1。在一个实施方案中，要治疗的癌症是ALL(急性成淋巴细胞性白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、DLBCL(弥漫性大B细胞性淋巴瘤)或MCL(套细胞淋巴瘤)。
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗免疫障碍的方法，所述细胞被基因改造成表达CD20、CD22、BCMA、CS1或CD138 CAR，其中造成疾病的或与疾病相关的细胞表达CD20、CD22、BCMA、CS1或CD138。在一个实施方案中，所述免疫障碍是自身免疫障碍(例如，狼疮、SLE、类风湿性关节炎、舍格伦综合征、结节病等)。
在一个实施方案中，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达BCMA CAR，其中癌细胞表达BCMA。在一个实施方案中，要治疗的癌症是浆细胞障碍(例如，骨髓瘤)或原发性渗出性淋巴瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达EGFRvIIICAR(或EGFRviiiCAR)，其中癌细胞表达EGFRvlll(或EGFRviii)。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达间皮素CAR(MSLN-CAR)，其中癌细胞表达间皮素(MSLN)。在一个实施方案中，要治疗的癌症是间皮瘤、胰腺癌、胃肠癌、肺癌、乳腺癌或卵巢癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD123CAR，其中癌细胞表达CD123。在一个实施方案中，要治疗的癌症是AML。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CS-lCAR，其中癌细胞表达CS-1。
在一个实施方案中，要治疗的癌症是多发性骨髓瘤或原发性渗出性淋巴瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CLL-lCAR，其中癌细胞表达CLL-1。在一个实施方案中，要治疗的癌症是AML。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD33CAR，其中癌细胞表达CD33。在一个实施方案中，要治疗的癌症是AML。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达MPL-CAR，其中癌细胞表达MPL(或血小板生成素受体)。在一个实施方案中，要治疗的癌症是AML或MDS。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达GD2CAR，其中癌细胞表达GD2。
在一个实施方案中，要治疗的癌症是神经母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达TnCAR，其中癌细胞表达Tn抗原。在一个实施方案中，要治疗的癌症是卵巢癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达PSMACAR，其中癌细胞表达PSMA。在一个实施方案中，要治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达RORlCAR，其中癌细胞表达RORl。在一个实施方案中，要治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达FLT3 CAR，其中癌细胞表达FLT3。在一个实施方案中，要治疗的癌症是AML。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD38CAR，其中癌细胞表达CD38。在一个实施方案中，要治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD44v6CAR，其中癌细胞表达CD44v6。在一个实施方案中，要治疗的癌症是宫颈癌、AML或MM。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CEACAR，其中癌细胞表达CEA。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胃肠癌或胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达B7H3CAR，其中癌细胞表达B7H3。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达KITCAR，其中癌细胞表达KIT。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胃肠癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达IL-13Ra2CAR，其中癌细胞表达IL-13Ra2。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD30CAR，其中癌细胞表达CD30。在一个实施方案中，要治疗的癌症是淋巴瘤或白血病。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达GD3CAR，其中癌细胞表达GD3。
在一个实施方案中，要治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达IL-1lRaCAR，其中癌细胞表达IL-1lRa。在一个实施方案中，要治疗的癌症是骨肉瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达PSCACAR，其中癌细胞表达PSCA。在一个实施方案中，要治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达VEGFR2CAR，其中癌细胞表达VEGFR2。在一个实施方案中，要治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达LewisYCAR，其中癌细胞表达LewisY。在一个实施方案中，要治疗的癌症是卵巢癌或AML。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CD24CAR，其中癌细胞表达CD24。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达叶酸盐受体αCAR，其中癌细胞表达叶酸盐受体α。在一个实施方案中，要治疗的癌症是卵巢癌、NSCLC、子宫内膜癌、肾癌或其它实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达ERBB2CAR，其中癌细胞表达ERBB2(Her2/neu)。在一个实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌或其它实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达MUClCAR，其中癌细胞表达MUCl。在一个实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、肺癌或其它实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达EGFRCAR，其中癌细胞表达EGFR。在一个实施方案中，要治疗的癌症是胶质母细胞瘤、SCLC(小细胞肺癌)、SCCHN(头和颈的鳞状细胞癌)、NSCLC或其它实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达CAIXCAR，其中癌细胞表达CAIX。在一个实施方案中，要治疗的癌症是肾癌、CRC、宫颈癌或其它实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达GD3CAR，其中癌细胞表达GD3。
在一个实施方案中，要治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过给有此需要的受试者提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，所述细胞被基因改造成表达岩藻糖基GMlCAR，其中癌细胞表达岩藻糖基GM。
在另一个方面，提供了治疗受试者的方法，例如，在受试者中减轻或改善过度增殖性病症或障碍(例如，癌症)例如实体瘤、软组织肿瘤或转移性病灶的方法。不希望受任何特定理论约束，由细胞疗法产品(例如，CAR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)引起的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答，或可替换地可以是由于直接vs间接的免疫应答。
在一个方面，本公开的细胞疗法产品(例如，表达CAR的T细胞、NK细胞)可以是用于哺乳动物的离体免疫接种和/或体内疗法的疫苗类型。在一个方面，所述哺乳动物是人。
除了就离体免疫接种而言使用基于细胞的疫苗之外，本公开还提供了用于体内免疫接种以在患者中引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和繁殖的细胞可以用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。具体地，本公开的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)用于治疗与本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病、障碍和病症。在某些方面，本公开的细胞疗法产品用于治疗，具有发展与本文所述的癌症相关抗原的表达有关的疾病、障碍和病症的风险的患者。因而，本公开提供了用于治疗或预防与本文所述的癌症相关抗原的表达有关的疾病、障碍和病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的细胞疗法产品。
在一个方面，本公开的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以用于治疗增殖性疾病诸如癌症或恶性肿瘤，或是癌变前病症诸如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期。进一步，与本文所述的癌症相关抗原表达相关的疾病包括、但不限于，例如，非典型的和/或非经典的癌症、恶性肿瘤、癌变前病症或表达本文所述的癌症相关抗原的增殖性疾病。与本文所述的癌症相关抗原的表达有关的非癌症相关适应症包括、但不限于：例如，自身免疫病(例如，狼疮)、炎症性障碍(变态反应和哮喘)和移植。
本公开的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以单独施用，或与稀释剂和/或与其它组分(诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群体)组合地作为药物组合物施用。
本公开提供了用于预防癌症复发的方法，所述癌症与表达本文所述的癌症相关抗原的细胞有关，所述方法包括给有此需要的受试者施用本公开的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)，其结合表达本文所述的癌症相关抗原的细胞。在一个方面，所述方法包括，与有效量的另一种疗法组合，给有此需要的受试者施用有效量的本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)，其结合表达本文所述的癌症相关抗原的细胞。
本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以与其它已知的药剂和疗法组合使用。
本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)和至少一种额外的治疗剂可以同时地、在相同组合物中或在分开的组合物中、或依次地施用。对于依次施用，可以首先施用本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)，然后可以施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。
可以在活跃障碍期间、或在缓解期间或疾病不太活跃期间施用细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)和/或其它治疗剂、规程或模态。细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以在其它治疗之前、与治疗同时、在治疗后或在障碍缓解期间施用。
当组合施用时，细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)和另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以高于、低于或等于单独使用的每种药剂(例如，作为单一疗法)的量或剂量的量或剂量施用。在某些实施方案中，细胞疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量低于单独使用的每种药剂(例如，作为单一疗法)的量或剂量(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施方案中，产生预期效应(例如，癌症的治疗)的细胞疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量低于达到相同治疗效果所需的单独使用的每种药剂(例如，作为单一疗法)的量或剂量(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在其它方面，本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以与肿瘤内施用的免疫调节剂组合地用在治疗方案中。在某些实施方案中，所述免疫调节剂是IL2。在某些实施方案中，所述免疫调节剂是活化NF-κB信号传导通路的药剂。可以活化NF-κB信号传导通路的示例性免疫调节剂包括以下一种或多种：vFlipK13(SEQ ID NO(DNA)：2357；SEQ ID NO(蛋白)：2467)，人NEMO K277A突变体(SEQ ID NO(DNA)：2358和SEQ ID NO(蛋白))：2468)和人IKK2-S177E-S181E突变体(SEQ ID NO(DNA)：2359和SEQ ID NO(蛋白)：2469)。在某些实施方案中，通过编码对应基因或cDNA的核酸的转染(例如通过电穿孔)，向肿瘤施用免疫调节剂，例如，IL2、vFLIP K13 SEQ ID NO(DNA)：2357、人NEMO K277A突变体(SEQ ID NO(DNA)和/或人IKK2-S177E-S181E突变体(SEQ ID NO(DNA)：2359。在某些实施方案中，使用编码对应基因或cDNA的病毒载体，例如，本文描述的病毒载体，例如，慢病毒载体、AAV载体或腺病毒载体，向肿瘤施用免疫调节剂，例如，IL2、vFLIP K13 SEQ ID NO(DNA)：2357、人NEMO K277A突变体(SEQ ID NO(DNA)和/或人IKK2-S177E-S181E突变体(SEQ ID NO(DNA)：2359。在某些实施方案中，在施用免疫效应细胞之前约2天(例如，1天、2天、3天、7天等)，递送所述免疫调节剂。在某些实施方案中，在施用免疫效应细胞之后约2天(例如，1天、2天、3天、7天等)，递送所述免疫调节剂。
在一个实施方案中，本文描述的细胞疗法产品(例如，CAR/TCR修饰的免疫效应细胞；例如，T细胞、NK细胞)可以与化学治疗剂组合使用。
在一个示例性实施方案中，本文描述的细胞疗法产品是CD19 CART产品并施用给具有CD19+淋巴瘤(例如，CD19+非霍奇金淋巴瘤(NHL)、CD19+FL或CD19+DLBCL)的受试者。在实施方案中，所述受试者具有复发性或难治性CD19+淋巴瘤。在实施方案中，在施用(例如，输注)CD19 CAR-T细胞之前、同时或之后，向受试者施用淋巴细胞耗竭性化学疗法。在一个实施例中，在施用CD19 CART细胞之前，向受试者施用淋巴细胞耗竭性化学疗法。例如，淋巴细胞耗竭性化学疗法在CD19 CART细胞输注之前1-4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施方案中，例如，如本文中所述，施用多剂量的CD19 CART细胞。例如，单剂量包含约5x108个CD19CART细胞。在实施方案中，在施用(例如，输注)本文描述的表达CAR的细胞(例如，非-CD19CAR表达的细胞)之前、同时或之后，向受试者施用淋巴细胞耗竭性化学疗法。在实施方案中，在施用(例如，输注)非-CD19 CAR表达的细胞(例如，本文描述的非-CD19 CAR表达的细胞)之前、同时或之后，向受试者施用CD19 CART。
在某些实施方案中，将本文描述的表达CAR的细胞与以下物质组合地施用给受试者：白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽与IL-15Ra多肽例如hetIL-15(Admune Therapeutics，LLC)二者的组合。
在一个实施方案中，可以给受试者施用减轻或改善与表达CAR的细胞的施用有关的副作用的药剂。与表达CAR的细胞的施用相关的副作用包括、但不限于CRS和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)(也称为巨噬细胞活化综合征(MAS))和神经学并发症(例如，癫痫发作、失语症、意识错乱、昏迷等)。
因此，本文所述的方法可以包括向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步施用一种或多种药剂，以管理用表达CAR的细胞的治疗所引起的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-y、TNFa、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一个实施方案中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，被施用以治疗该副作用的药剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的药剂。在一个实施方案中，中和这些可溶形式中的一种或多种的药剂是抗体或其抗原结合片段。这样的药剂的例子包括、但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFa的抑制剂和IL-6的抑制剂。
本公开还提供了TRAIL和/或DR5的抑制剂，以及使用这样的抑制剂来减少、预防和/或治疗免疫疗法和细胞疗法产品(例如，CAR-T、TCR-T细胞和双特异性的T细胞衔接物(BiTE))的副作用的方法。在一个实施方案中，TRAIL和/或DR5的抑制剂用于减少、预防和/或治疗细胞因子释放综合征(CRS)，以及与免疫疗法和细胞疗法(例如，免疫效应细胞疗法)产品的使用相关的神经学并发症。在一个实施方案中，所述BiTE是兰妥莫单抗。
在本公开的另一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理由用细胞疗法(例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的细胞)治疗引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理用结合免疫效应细胞的双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗或BCMA x CD3双特异性抗体)治疗所引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理用免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL)或结合免疫效应细胞的双特异性抗体(例如，兰妥莫单抗)治疗所引起的副作用(例如CRS和神经毒性)。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理用结合免疫效应细胞的双特异性抗体治疗所引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理用表达TCR的细胞治疗引起的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，以管理用任何免疫效应细胞治疗所引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。
TRAIL拮抗剂的一个例子是针对TRAIL的中和抗体，例如MAB375-SP。在一个实施方案中，以约5mg/kg(例如5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100/kg mg)的剂量通过皮下或静脉内注射，将MAB375-SP施用给受试者，以预防或治疗由免疫效应细胞疗法(例如，CAR-T、TCR-T、TIL、兰妥莫单抗、BCMA x CD3 BiTE等)的施用而引起的细胞因子释放综合征和其它毒性，包括神经毒性。在某些实施方案中，通过鞘内或心室内注射来施用MAB375-SP，以预防或治疗与细胞疗法产品的施用有关的神经毒性。在某些实施方案中，用于鞘内或心室内注射的MAB375-SP的剂量为每周约20mg(例如，20mg、50mg、100mg)。在一个实施方案中，在对第一剂量无应答的情况下，施用超过一个剂量的MAB375-SP。在一个实施方案中，每周约施用一次(例如，每周一次，每周两次，每周三次，每两周一次，每月一次等)MAB375-SP。在一个实施方案中，预防性地施用MAB375-SP，即，以预防CRS的发展。在其它实施方案中，施用MAB375-SP以治疗CRS。在其它实施方案中，在CRS和/或神经毒性的最早征象和症状，诸如发热>38.5℃、收缩压或舒张压下降超过10mm Hg、收缩压<100mm Hg或舒张压<70mm Hg，施用MAB375-SP。在一个实施方案中，MAB375-SP作为单一疗法施用。在其它实施方案中，MAB375-SP与其它药剂(例如，皮质类固醇、DR5-Fc、托珠单抗或阿那白滞素)联合施用。
TRAIL拮抗剂的另一个例子是结合DR5并阻止其与TRAIL结合的抗体或蛋白。TRAIL拮抗剂的一个例子是结合TRAIL并阻止或竞争其与DR5结合的抗体或蛋白。结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白的一个例子是DR5-Fc。在一个实施方案中，以约10mg(例如10mg、20mg、50mg、100mg)的剂量，通过皮下或静脉内注射将DR5-Fc施用给受试者，以预防或治疗由免疫疗法(例如，免疫效应细胞疗法，例如，CAR-T、TCR-T、TIL、兰妥莫单抗、BCMA x CD3BiTE等)的施用而引起的细胞因子释放综合征和其它毒性(包括神经毒性)。在一个实施方案中，约每周施用一次DR5-Fc(例如，每周一次，每周两次或每周三次)。在某些实施方案中，通过鞘内或心室内注射施用DR5-Fc，以预防或治疗与细胞疗法产品的施用有关的神经毒性。在某些实施方案中，用于鞘内或心室内注射的DR5-Fc的剂量为每周约20mg(例如，20mg、50mg、100mg)。在一个实施方案中，在对第一剂量无应答的情况下，施用超过一个剂量的DR5-Fc。在一个实施方案中，DR5-Fc作为单一疗法施用。在其它实施方案中，DR5-Fc与其它药剂(例如，MAB375-SP、皮质类固醇、托珠单抗或阿那白滞素)联合施用。
结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白的其它例子是本领域已知的，例如，DR4-Fc(SEQ ID NO：2441)、DcR1-Fc(SEQ ID NO：2448)、DcR2-Fc、DR5-ECD(SEQ ID NO：2392)、DR4-ECD(SEQ ID NO：2386)、DcR1-ECD(SEQ ID NO：2375)和DcR2-ECD(SEQ ID NO：2380)，且可以用在本公开的替代实施方案中。
在某些方面提供了治疗方法，所述方法包括向受试者施用能够治疗、预防、延迟或减轻毒性发展的药剂，例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP。在某些情况下，在所述施用时，受试者已经预先施用了治疗，例如包括免疫疗法和/或细胞疗法的治疗。在某些实施方案中，药剂或其它治疗是在开始施用所述疗法以后少于或不超过十、七、六、五、四或三天的时间进行施用。在任何这样的实施方案中的一些中，在受试者表现出1级CRS的时间施用所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗，或者在受试者表现出1级CRS的第一体征或症状之后24小时内施用。在某些情况下，在受试者表现出CRS的体征或症状和/或表现出1级CRS的时间施用所述药剂或其它治疗。在某些情况下，在开始施用所述疗法之后，在受试者表现出1级CRS的第一体征或症状之后24小时内施用所述药剂或其它治疗。
在某些实施方案中，1级CRS的体征或症状是发热。在某些情况下，在开始施用所述疗法之后，在发热的第一体征之后24小时内施用所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗。在某些方面，在开始施用所述疗法之后出现发热的第一体征以后约16小时内、约12小时内、约8小时内、约2小时内或约1小时内，施用所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗。
在某些实施方案中，发热是持续发热。在某些情况下，在用解热药治疗后，发热不会降低或降低不超过1℃。在某些方面，发热是在用解热药治疗后不会降低或降低不超过1℃的发热。在某些情况下，在用解热药治疗受试者后，发热尚未降低超过1℃。
在某些实施方案中，发热包括至少或至少约38.0℃的温度。在某些方面，发热包括在约38.0℃至42.0℃、38.0℃至39.0℃、39.0℃至40.0℃、或40.0℃至42.0℃(包括端值)之间的温度。在某些实施方案中，发热包括大于或大于约或者为或为约38.5℃、39.0℃、39.5℃、40.0℃、41.0℃、42.0℃的温度。
在某些实施方案中，在开始施用所述疗法后小于5天、开始施用所述疗法后小于4天或开始施用所述疗法后小于3天，施用所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗。
在某些实施方案中，所述疗法是或包含细胞疗法。在某些情况下，所述细胞疗法是或包含过继性细胞疗法。在某些方面，所述疗法是或包含肿瘤浸润性淋巴细胞性(TIL)疗法、转基因的TCR疗法或表达重组受体的细胞疗法，其任选地是T细胞疗法。在某些实施方案中，所述疗法是表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法。在某些实施方案中，所述疗法是双特异性的/多特异性的T细胞衔接物疗法。在一个示例性实施方案中，所述疗法是兰妥莫单抗。在某些实施方案中，所述疗法是CD123 x CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，所述疗法是CD33 xCD3双特异性抗体疗法。在一些实施方案中，所述疗法是CD123 x CD3 DART或CD19x CD3DART。
在某些情况下，所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)与其它治疗联合施用，所述其它治疗包括类固醇，或拮抗剂，或选自IL-10、IL-I0R、IL-6、IL-6受体、IFNγ、IFNGR、IL-2、IL-2R/CD25、MCP-1、CCR2、CCR4、MΙPΙβ、CCR5、TNFα、TNFR1、IL-1和IL-lRα/IL-lβ的细胞因子受体或细胞因子的抑制剂。
在某些方面，TRAIL拮抗剂与选自抗体或抗原结合片段、小分子、蛋白或肽和核酸的药剂联合施用。在某些情况下，所述药剂或其它治疗是或包含选自托珠单抗、阿那白滞素(anakinra)、斯托西单抗(situximab)、沙鲁单抗(sarilumab)、奥鲁凯珠单抗(olokizumab)(CDP6038)、艾西莫单抗、ALD518/BMS-945429、希瑞库单抗(sirukumab)(CNTO 136)、CPSI-2634、ARGX-109、FE301和FMl0l的药剂。
在某些实施方案中，TRAIL拮抗剂与托珠单抗联合施用。在某些这样的实施方案中，托珠单抗以从或从约1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至8mg/kg、2mg/kg至6mg/kg、2mg/kg至4mg/kg、或6mg/kg至8mg/kg(包括端值)剂量的量施用，或托珠单抗以至少或至少约或约2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg或8mg/kg剂量的量施用。
在某些实施方案中，TRAIL拮抗剂与阿那白滞素联合施用。在某些这样的实施方案中，阿那白滞素以从或约1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至8mg/kg、2mg/kg至6mg/kg、2mg/kg至4mg/kg、或6mg/kg至8mg/kg(包括端值)的剂量量施用，或阿那白滞素以至少或至少约或约2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg或8mg/kg的剂量量施用。
在某些方面，所述方法进一步包括与TRAIL拮抗剂联合地给受试者施用类固醇。在某些这样的方面，在施用所述疗法后7天、8天或9天内的时间施用类固醇。在某些情况下，类固醇的施用时间是在施用所述疗法后出现低血压的第一体征之后的24小时内。在某些情况下，在受试者表现出2级细胞因子释放综合征(CRS)的时间，或在施用所述疗法后受试者表现出2级CRS的第一体征之后的24小时内，施用类固醇。在某些实施方案中，在受试者表现出2级神经毒性的时间，或在施用所述疗法后在受试者表现出2级神经毒性的第一体征或症状之后的24小时内，施用类固醇。
在某些实施方案中，与TRAIL拮抗剂联合施用的药剂是或包含类固醇，所述类固醇是或包含皮质类固醇。在某些方面，所述药剂是类固醇，所述类固醇是或包含糖皮质激素。在某些情况下，所述皮质类固醇是或包含地塞米松或泼尼松。在某些情况下，静脉内或口服地施用类固醇。
在某些情况下，以从或从约1.0mg至20mg地塞米松/天、1.0mg至10mg地塞米松/天、或2.0mg至6.0mg地塞米松/天(包括端值)的等同剂量的量施用类固醇。
在某些方面，在开始施用所述疗法之后，在低血压的第一体征出现以后24小时内或同时施用TRAIL拮抗剂，例如，MAB375-SP或DR5-Fc。在某些情况下，在开始加压疗法同时施用TRAIL拮抗剂，例如，MAB375-SP或DR5-Fc。在某些情况下，低血压包括收缩压小于或约小于90mm Hg、80mm Hg或70mm Hg。在某些情况下，低血压包括舒张压小于60mm Hg、50mm Hg或40mm Hg。
在某些实施方案中，所述疗法是或包含细胞疗法，且在含有细胞的单一药物组合物中施用所述细胞。在某些情况下，所述疗法是或包含细胞疗法且细胞的剂量是分次剂量，其中在不超过3天的时间段中在多个组合物中施用所述剂量的细胞，它们共同含有所述剂量的细胞。
在某些实施方案中，为其施用TRAIL拮抗剂的疾病或病症是或包含肿瘤或癌症。在某些实施方案中，所述疗法是细胞疗法，其包括一定剂量的表达重组受体的细胞。在某些方面，所述重组受体结合、识别或靶向与疾病或病症有关的抗原。在某些情况下，所述重组受体是T细胞受体或功能性的非-T细胞受体。在某些情况下，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方案中，所述疗法是或包含含有一定剂量的细胞的疗法，所述细胞含有T细胞。在某些情况下，所述T细胞是CD4+或CD8+。在某些实施方案中，所述T细胞对于受试者而言是自体的。在某些实施方案中，所述T细胞对于受试者而言是同种异体的。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在施用所述疗法之前施用化学治疗剂。在某些情况下，所述受试者在开始施用所述疗法之前已经预先用化学治疗剂治疗。在某些方面，所述化学治疗剂包括选自以下的药剂：环磷酰胺、氟达拉滨和/或它们的组合。在某些实施方案中，在开始施用所述疗法之前2-5天施用所述化学治疗剂。在某些情况下，以在或约1g/m2受试者至在或约3g/m2受试者的剂量施用所述化学治疗剂。
在某些实施方案中，为其施用TRAIL拮抗剂的毒性是神经毒性。在某些实施方案中，在施用所述疗法(例如，CAR-T疗法)后达到或达到约第7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，受试者中的CNS相关结果是不可检测的，或与包括替代治疗方案的方法相比是降低的，其中在严重CRS或神经毒性已经发生以后，或在2级或更高的CRS或神经毒性已经发生以后，给所述受试者施用所述药剂或其它治疗。在某些实施方案中，所述毒性结果是与3级或更高的神经毒性有关的症状，或是与2级或更高的CRS有关的症状。在某些实施方案中，所述毒性结果减少了大于50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些情况下，所述毒性结果是与3级或更高的神经毒性有关的症状。在某些实施方案中，所述毒性结果选自3级或更高的神经毒性，包括意识错乱、谵妄、表达性失语症、意识混浊不清、肌阵挛、嗜睡、改变的精神状态、惊厥、癫痫发作-样活动和癫痫发作。
在某些实施方案中，所述毒性结果是2级或更高的CRS，其包含选自以下的一种或多种症状：连续至少三天的高于38摄氏度、在38摄氏度、或约38摄氏度的持续发热；需要高剂量血管加压剂或多次血管加压剂的低血压；低氧，其任选地包括小于90％、在90％或约90％的血浆氧(pO2)水平；和需要机械通气的呼吸衰竭。在某些实施方案中，所述疗法是包含一定剂量的细胞的细胞疗法，并且与使用替代治疗方案施用细胞疗法(在所述受试者中或在替代性组群或治疗组中的相应受试者中)相比，所述细胞在所述受试者中表现出增加的或延长的繁殖和/或持久性，其中所述替代治疗方案包括施用所述细胞疗法，随后在严重CRS已经发生后或在2级或更高的CRS已经发生后施用所述药剂或其它治疗，并且任选地，其中所述替代治疗方案中的受试者不施用所述药剂，并且任选地，在施用所述细胞以后和在所述2级或更高的CRS或严重CRS的发生之前，不施用旨在治疗CRS或神经毒性的任何其它治疗。在某些实施方案中，繁殖和/或持久性增加或延长了2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在某些实施方案中，所述疗法是包含一定剂量的细胞的细胞疗法，并且与使用替代治疗方案施用细胞疗法(在所述受试者中或在替代性组群或治疗组中的相应受试者中)相比，所述细胞在所述受试者中表现出增加的或延长的繁殖和/或持久性。在某些情况下，所述替代治疗方案包括施用所述细胞疗法，随后在严重CRS或神经毒性已经发生后或在2级或更高的CRS或神经毒性已经发生后，施用所述药剂或其它治疗。在某些情况下，所述替代治疗方案中的受试者不施用所述药剂。在某些情况下，在施用所述细胞以后和在所述2级或更高的CRS或严重CRS或2级或更高的神经毒性或严重神经毒性发生之前，所述替代治疗方案中的受试者不施用旨在治疗CRS或神经毒性的任何其它治疗。
在某些实施方案中，繁殖和/或持久性增加或延长了2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在某些实施方案中，所述疗法是细胞疗法，包括经基因改造的和/或表达CAR的细胞。在某些情况下，在开始施用所述疗法之后第30天、第60天或第90天，在受试者血液中，经基因改造的和/或表达CAR的细胞的浓度或数目是，至少在或约10个经基因改造的或表达CAR的细胞/微升，外周血单核细胞(PBMC)总数的至少50％，至少或至少约1x105个经基因改造的或表达CAR的细胞，和/或至少5,000拷贝的编码CAR的或经基因改造的编码受体的DNA/微克DNA。在某些实施方案中，在第30、60或90天，在开始施用所述疗法以后，表达CAR的和/或经基因改造的细胞在受试者的血液或血清中是可检测到的。在某些情况下，在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，受试者的血液含有至少20％的表达CAR的细胞、至少10个表达CAR的细胞/微升或至少1x104个表达CAR的细胞。在某些情况下，在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，受试者的血液含有至少50％、60％、70％、80％或90％的生物学有效剂量的细胞。在某些实施方案中，在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，受试者的血液含有至少20％的经基因改造的和/或表达CAR的细胞，至少10个经基因改造的和/或表达CAR的细胞/微升，和/或至少1x104个经基因改造的和/或表达CAR的细胞。在某些情况下，在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，受试者表现出疾病或病症的负担减轻或持续减轻。在某些情况下，疾病或病症的负担减轻或持续减轻是疗法施用以后的峰值的在或约或者至少在或约50、60、70或80％的减轻，或是与有效剂量有关的减轻。
在某些实施方案中，在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，受试者在细胞疗法治疗后没有和/或尚未表现出严重神经毒性、严重CRS、2级或更高的CRS、2级或更高的神经毒性，和/或尚未表现出癫痫发作或其它CNS结果；或在开始施用所述疗法以后第30、60或90天，小于或约小于25％、小于或约小于20％、小于或约小于15％或小于或约小于10％)的经如此治疗的受试者在细胞疗法治疗后没有和/或尚未表现出严重神经毒性、严重CRS、2级或更高的CRS、2级或更高的神经毒性，和/或尚未表现出癫痫发作或其它CNS结果。
在某些实施方案中，所述疗法是细胞疗法，其包含经基因改造的和/或表达CAR的细胞；并且与通过包含替代定量施用方案的方法所获得的结果相比，在施用所述疗法后，经基因改造的和/或表达CAR的细胞随时间的血液浓度的曲线下面积(AUC)更大，例如其中所述受试者施用所述疗法，和在受试者表现出严重的或2级或更高的或3级或更高的CRS或神经中毒时施用所述药剂或其它治疗。
在某些实施方案中，还提供了用于治疗、预防、延迟或减轻受试者中毒性发展的药剂，例如TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP或其它治疗，所述受试者在先已经施用了疗法，该疗法包括免疫疗法和/或细胞疗法。在某些实施方案中，(a)在以下时间向受试者施用药剂，例如，TRAIL拮抗剂或其它治疗：(i)在受试者已经开始施用所述疗法后小于或不超过10、7、6、5、4或3天的时间；和/或(ii)在受试者没有表现出严重细胞因子释放综合征(CRS)的体征或症状和/或没有表现出2级或更高的CRS的时间；和/或(iii)在受试者没有表现出严重神经毒性的体征或症状和/或没有表现出2级或更高的神经毒性的时间；和/或(b)在受试者已经开始施用所述疗法的时间至施用所述药剂或其它治疗的时间之间，(i)受试者尚未表现出严重CRS和/或尚未表现出2级或更高的CRS和/或(ii)受试者尚未表现出严重神经毒性和/或没有表现出2级或更高的神经毒性。
在某些实施方案中，所述药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP或其它治疗)在受试者表现出CRS的体征或症状和/或表现出1级CRS时施用，或在施用所述疗法后在受试者表现出1级CRS的第一体征或症状以后24小时内施用。在某些实施方案中，1级CRS的体征或症状是发热；和/或在施用所述疗法后在出现发热的第一体征以后24小时内施用所述药剂或其它治疗。
在某些实施方案中，还提供了用于治疗、预防、延迟或减轻受试者中毒性发展的药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗，所述受试者在先已经施用了疗法，所述疗法包括免疫疗法和/或细胞疗法，其中所述药剂或其它治疗在施用所述疗法后出现发热的第一体征的24小时内施用。
在某些实施方案中，还提供了用于治疗、预防、延迟或减轻受试者中毒性发展的药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗，所述受试者在先已经施用了疗法，所述疗法包括免疫疗法和/或细胞疗法，其中所述药剂或其它治疗在施用所述疗法后出现发热的第一体征的24小时内施用。
在某些实施方案中，还提供了用于用作药物的药剂(例如，TRAIL拮抗剂，例如，DR5-Fc和/或MAB375-SP)或其它治疗，所述药物用于治疗、预防、延迟或减轻受试者中毒性的发展，所述受试者在先已经施用了疗法，所述疗法包括免疫疗法和/或细胞疗法。在某些实施方案中，(a)在以下时间向受试者施用所述药剂或其它治疗：(i)在受试者已经开始施用所述疗法后小于或不超过10、7、6、5、4或3天的时间；和/或(ii)在受试者没有表现出严重细胞因子释放综合征(CRS)的体征或症状，和/或没有表现出2级或更高的CRS的时间；和/或(iii)在受试者没有表现出严重神经毒性的体征或症状，和/或没有表现出2级或更高的神经毒性的时间；和/或(b)在受试者已经开始施用所述疗法的时间至施用所述药剂或其它治疗的时间之间，(i)在受试者尚未表现出严重CRS和/或尚未表现出2级或更高的CRS，和/或(ii)受试者尚未表现出严重神经毒性和/或没有表现出2级或更高的神经毒性。
在一个实施方案中，可以给受试者施用改变细胞疗法(例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR/TCR的细胞)的活性的药剂。在一个实施方案中，可以给受试者施用增强双特异性抗体的活性的药剂，其中双特异性抗体结合免疫效应细胞。例如，在一个实施方案中，所述药剂可以是TRAIL拮抗剂，例如，本文描述的TRAIL拮抗剂。在另一个实施方案中，所述药剂可以是BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2和/或DR5的抑制剂。在另一个实施方案中，所述药剂可以是抑制抑制性分子的药剂。在某些实施方案中，抑制性分子例如程序性死亡1(PD-1)可以降低表达CAR/TCR的细胞所引起免疫效应应答的能力。抑制性分子的例子包括PD-1、PD-Ll、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRl、CD160、2B4和TGFβ。抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制)，可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，抑制性的核酸，例如，抑制性的核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化剂样效应物核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)，例如，如本文中所述的，可以用于抑制表达CAR的细胞中的抑制性分子的表达。在一个实施方案中，所述抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，在表达CAR/TCR的细胞内抑制所述抑制性分子。在这些实施方案中，抑制抑制性分子的表达的dsRNA分子连接至编码CAR/TCR组分(例如，所有组分)的核酸。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是，例如，结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，所述药剂可以是结合PD-1、PD-Ll、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也被称作MDX-010和MDX-101，并作为
Figure BDA0002987268390001201
销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(可得自Pfizer的IgG2单克隆抗体，以前称作替西木单抗，CP-675,206))。在一个实施方案中，所述药剂是结合TIM3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述药剂是结合CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述药剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。
本公开也涉及通过干扰和/或阻断TRAIL(TNFSF10)或其受体(例如，DR5)的活性，来预防和治疗免疫障碍，诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病、炎性肠病的方法。具体地，本公开涉及用于预防和治疗由巨噬细胞活化造成的免疫障碍的方法。在某些实施方案中，本公开涉及用于预防和治疗由T细胞诱导的巨噬细胞活化造成的免疫障碍的方法。
在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂，例如本文描述的TRAIL拮抗剂，以管理由巨噬细胞和单核细胞的活化所引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。在一个实施方案中，给所述受试者施用TRAIL拮抗剂以管理由免疫效应细胞(例如T细胞)对巨噬细胞和单核细胞的活化所引起的可溶性因子(例如，细胞因子)水平升高。TRAIL拮抗剂的一个例子是针对TRAIL的中和抗体例如MAB375-SP。在一个实施方案中，以约5mg/kg(例如5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100/kg mg)的剂量，通过皮下或静脉内注射将MAB375-SP施用给受试者，用于预防或治疗类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病、炎性肠病。在某些实施方案中，通过鞘内或心室内注射来施用MAB375-SP，以预防或治疗与免疫障碍有关的神经毒性，例如，巨噬细胞活化综合征。在某些实施方案中，用于鞘内或心室内注射的MAB375-SP的剂量是每周约20mg(例如，20mg、50mg、100mg)。在一个实施方案中，在对第一剂量无应答的情况下，施用超过一个剂量的MAB375-SP。在一个实施方案中，约每周施用一次(例如，每周一次，每周两次，每周三次，每两周一次，每月一次等)MAB375-SP。在一个实施方案中，预防性地施用MAB375-SP，即，以预防免疫障碍的发生。在其它实施方案中，施用MAB375-SP以治疗免疫障碍，例如，本文描述的免疫障碍，例如，类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病。在其它实施方案中，在免疫障碍发生的最早征象和症状，诸如发热>38.5℃、收缩压或舒张压下降超过10mm Hg、收缩压<100mm Hg或舒张压<70mm Hg时，施用MAB375-SP。在一个实施方案中，MAB375-SP作为单一疗法施用。在其它实施方案中，MAB375-SP与其它药剂(例如，皮质类固醇、DR5-Fc、托珠单抗或阿那白滞素)联合施用。TRAIL拮抗剂的另一个例子是结合DR5并阻止其与TRAIL结合的抗体或蛋白。TRAIL拮抗剂的一个例子是结合TRAIL并阻止或竞争其与DR5结合的抗体或蛋白。结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白的一个例子是DR5-Fc。在一个实施方案中，以约10mg(例如10mg、20mg、50mg、100mg)的剂量，通过皮下或静脉内注射将DR5-Fc施用给受试者，用于预防或治疗免疫障碍，例如，本文描述的免疫障碍，例如，类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病。在一个实施方案中，约每周施用一次DR5-Fc(例如，每周一次，每周两次或每周三次)。在某些实施方案中，通过鞘内或心室内注射施用DR5-Fc，以预防或治疗与免疫障碍有关的神经毒性。在某些实施方案中，用于鞘内或心室内注射的DR5-Fc的剂量为每周约20mg(例如，20mg、50mg、100mg)。在某些实施方案中，通过关节内注射来施用DR5-Fc。在一个实施方案中，在对第一剂量无应答的情况下，施用超过一个剂量的DR5-Fc。在一个实施方案中，DR5-Fc作为单一疗法施用。在其它实施方案中，DR5-Fc与其它药剂(例如，MAB375-SP、皮质类固醇、托珠单抗或阿那白滞素)联合施用。结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白的其它例子是本领域已知的，例如，DR4-Fc、DcR1-Fc、DcR2-Fc，且可以用在本公开的替代实施方案中。在某些实施方案中，TRAIL拮抗剂选自
i)针对TRAIL的中和抗体，
ii)针对DR5的拮抗抗体(TRAIL-R2)，
iii)DR5的竞争性拮抗剂(例如，DR5-Fc)，
iv)能够结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白，
v)TRAIL和/或DR5的核酸抑制剂，
vi)TRAIL和/或DR5的小分子抑制剂，
vii)以上的组合。
本公开的药物组合物可以包含如本文中所述的细胞疗法产品，例如，表达CAR/TCR的产品，例如，多个表达CAR/TCR的细胞，以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本公开的药物组合物可以包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL(TNFSF10)和死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)的小分子抑制剂、多肽抑制剂或核酸抑制剂。
本公开的药物组合物可以包含双特异性的或多特异性的衔接物。这样的组合物可以包含缓冲液诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，将本公开的组合物配制成用于静脉内施用。
可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用本公开的药物组合物。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素来确定。
在一个实施方案中，所述药物组合物基本上不含有，例如不存在，可检测水平的污染物，例如其选自内毒素、支原体、能复制的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV糖胺聚糖(gag)、残余的抗-CD3/抗-CD28包被的珠子、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、包装载体的细胞或质粒组分、细菌和真菌。
当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，要施用的本公开的组合物的精确量可以由医师决定，并考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异。通常可以指出，包含本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物可以以104-109个细胞/kg体重的剂量施用，在某些情况下为105-106个细胞/kg体重，包括在那些范围内的所有整数值。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术，施用所述细胞(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、骨髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。
在一个方面，通过静脉内注射施用本公开的T细胞组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射进肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一个特定的示例性方面，受试者可以接受动员剂(例如，本文描述的动员剂，例如，CXCR4拮抗剂)，然后进行白细胞去除术，其中将白细胞离体收集、富集或除去，以选择和/或分离目标细胞，例如，T细胞。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法或本公开中描述的方法进行繁殖，并进行处理，使得可以引入本公开的一种或多种CAR/TCR构建体和附属模块(例如，JAK3、STAT5的组成活性突变体和/或BRD9的抑制剂等)，从而产生本公开的细胞疗法产品。使用双特异性的/多特异性的衔接物，可以在体外活化和/或繁殖CAR/TCR细胞。有此需要的受试者随后可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之前、之后或同时，受试者接受本公开的繁殖的细胞疗法产品(例如CAR/TCR T细胞)的输注。在另一个方面，在外科手术之前或之后施用繁殖的细胞。在施用T细胞后，受试者可以接受双特异性的/多特异性的衔接物，有或没有共刺激剂(例如，41BBL或Utomilumab)，以允许所施用的细胞在体内繁殖。受试者可以进一步接受TRAIL拮抗剂，以预防、延迟、减轻或治疗输注的细胞疗法产品的毒性。
要施用给患者的上述治疗的剂量，将随所治疗病症的确切性质和治疗的接受者而变化。根据本领域接受的实践，可以缩放用于人类施用的剂量。
在一个实施方案中，例如，使用体外转录，将CAR/TCR引入免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)中，并且受试者(例如，人)接受本公开的CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的初次施用，和本公开的CAR/TCR免疫效应细胞(例如、T细胞、NK细胞)的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在前次施用以后小于15天(例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用。在一个实施方案中，每周将本公开的CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的超过一次施用给受试者(例如，人)，例如，每周施用本公开的CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的2、3或4次施用。在一个实施方案中，所述受试者(例如，人受试者)每周接受CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的超过一次施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也被称作一个周期)，随后1周不施用CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，然后向受试者施用CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或多次另外施用(例如，CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的每周超过一次施用)。在另一个实施方案中，所述受试者(例如，人受试者)接受超过一个周期的CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，每周3次施用。在一个实施方案中，将本公开的CAR/TCR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)施用至少2、3、4、5、6、7、8或更多周。
在一个方面，使用慢病毒病毒载体(诸如慢病毒)产生本公开的表达CAR/TCR的细胞。以此方式产生的细胞(例如，CAR/TCR T)将具有稳定的表达。
在一个方面，使用病毒载体诸如γ逆转录病毒载体，例如，本文描述的γ逆转录病毒载体，产生表达CAR/TCR的细胞，例如，CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。
在一个方面，CART在转导后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天瞬时表达CAR载体。通过RNA CAR载体递送，可以实现CAR/TCR的瞬时表达。在一个方面，通过电穿孔将CAR/TCR RNA转导进T细胞中。
在使用瞬时表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)(尤其是带有鼠scFv的CART)治疗的患者中可能出现的一个潜在问题是，多次治疗后的过敏反应。
不受该理论约束，据信，这样的过敏性应答可能由患者出现体液性抗-CAR应答(即，具有抗-IgE同种型的抗-CAR抗体)引起。有人认为，当存在十到十四天的抗原暴露中断时，患者的产生抗体的细胞会经历从IgG同种型(其不会引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂CAR疗法过程中，极有可能产生抗-CAR的抗体应答(诸如通过RNA转导产生的那些)，CART输注中断不应持续超过十到十四天。
实施例
参考以下实验实施例，进一步详细描述本公开。提供这些实施例仅出于例证目的，且除非另外指出，否则不旨于构成限制。因此，本公开绝不应当被解释为限于以下实施例，而是应当被解释为涵盖，由于本文中提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
产生和表征CAR-T细胞的方法，包括慢病毒和逆转录病毒的产生，T细胞和PBMC的感染，T细胞的培养和繁殖，T细胞功能的体外测定，诸如ELISA、流式细胞计量术、细胞死亡测定(例如，Matador测定)、抗原检测测定(例如，Topanga测定)和体内测定，是在文献中已知的，且已经描述在WO 2018/102795(其通过引用整体并入本文中)中。
慢病毒和逆转录病毒的产生.基本上如以前所述(Matta,Hozayev,Tomar,Chugh,&Chaudhary,2003)，在293FT细胞中，通过基于磷酸钙的转染来产生慢病毒。
T细胞和PBMC的感染.除非另外指出，否则从来自洛杉矶儿童医院(ChildrenHospital of Los Angeles)血库的健康、去标识的成年供体获得血沉棕黄层细胞，并用于通过葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)梯度离心分离出外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))并按照生产商的说明书来分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(龙沙集团(Lonza))中。可替换地，使用CD3/CD28珠子和100IU重组人-IL2。将细胞在5％CO2保湿培养箱中，于37℃培养。在用慢病毒载体感染之前，将细胞在上述培养基中活化1天。一般而言，在早晨使用旋转感染(与300μl已经重悬在有8μg/ml
Figure BDA0002987268390001231
(Sigma，目录号H9268)存在的XVIVO培养基中的浓缩病毒一起，在37℃，在1800rpm旋转90分钟)，来感染原代细胞(例如T细胞)。在晚上更换培养基，连续几天重复感染，共感染2-3次。除非另外指出，否则在最后一次感染后，将细胞沉淀并重新悬浮在新鲜XVIVO培养基中，放入细胞培养瓶中用于选择，该培养基含有10ng/mlCD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2，并补充了相应的抗生素(如果指示的话)。可替换地，使用CD3/CD28珠子和100IU重组人-IL2。如果不使用药物选择，则将细胞在上述培养基中培养10～15天，如果使用药物选择，则培养20～30天。在用表达EGFP的慢病毒感染细胞的情况下，无需进行药物选择即可繁殖它们，或进行流式分选以富集表达EGFP的细胞。为了感染癌细胞系，大约500,000个细胞用含有
Figure BDA0002987268390001232
(Sigma，目录号H9268)的2ml未浓缩的病毒上清液感染，总体积为3ml。然后在第二天早晨，将细胞沉淀并重新悬浮于含有相应抗生素的培养基中，并置于细胞培养瓶中用于选择。
抗体和药物.洋地黄皂苷购自Sigma(目录号D141)，并在DMSO中制备100mg/ml的储备溶液。在PBS中制备1mg/ml的稀释储备物。除非另外指出，否则用于细胞裂解的洋地黄皂苷的终浓度为30μg/ml。
临床级CAR-T的制造和施用
对于临床级CAR-T的制造，使用商业来源(例如，Lentigen,Lonza等)产生编码CAR的cGMP级慢病毒。使用白细胞去除术从供体(自体或同种异体)收集T细胞。使用所记载的CLINIMAC Prodigy(Miltenyi Biotech)自动化封闭系统(Zhu F,Shah N等人,Cytotherapy,2017)，并遵循生产商的说明书，制造CAR-T细胞。使用5到10之间的感染复数(MOI)。用于临床级CAR-T制造的替代方法诸如可可尼(Cocoon,Lonza)和手动打开系统是本领域已知的，且可以用在本发明的替代实施方案中。在淋巴细胞耗竭性化学疗法以后，从大约1x106个CD3CAR-T细胞/kg开始，以逐渐增加的剂量将CAR-T细胞施用给患者。
IL2 ELISA.在表达CAR的Jurkat-NFAT-GFP效应细胞或T细胞的细胞培养物上清液中，测量了人IL2、IFNγ、IL6和TNFα，所述细胞已经使用来自R&D系统(R&D systems，明尼阿波利斯(Minneapolis)，MN)的ELISA试剂盒并遵循生产商的推荐，与特定靶细胞系共培养了24～96小时。
FACS分析.小鼠抗-人c Myc APC缀合的单克隆抗体(目录号IC3696A)来自R&DSystems(Minneapolis，MN)。生物素化的蛋白L购自GeneScript(Piscataway，NJ)，以1mg/ml在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重构，并在4℃保存。链霉亲和素-APC(SA1005)购自ThermoFisher Scientific。
为了使用Myc染色检测CAR，将1×106细胞收获，并用3ml冰冷的1×含有4％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，将细胞重新悬浮于0.1ml含有10μl APC-缀合的Myc抗体的冰冷的洗涤缓冲液中，并在黑暗中温育1小时，然后用冰冷的洗涤缓冲液洗涤2次。
为了使用蛋白L染色检测CAR，将1×106细胞收获，并用3ml冰冷的1×含有4％牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，将细胞在4℃重新悬浮于0.1ml含有1μg蛋白L的冰冷的洗涤缓冲液中1小时。将细胞用冰冷的洗涤缓冲液洗涤3次，然后与在0.1ml洗涤缓冲液中的10μl APC-缀合的链霉亲和素一起温育(在黑暗中)30分钟，然后用冰冷的洗涤缓冲液洗涤2次。使用来自BD Biosciences的FACSVerse分析仪完成FACS。
细胞死亡测定.为了测量细胞死亡，如在PCT/US17/52344“A Non-RadioactiveCytotoxicity Assay(非放射性细胞毒性测定)”中所述，使用了基于Gluc、NLuc或LucPPe异位细胞溶质表达的新颖的测定法。
除非另外指出，否则为了测量LucPPe-146-1H2活性，制备由1mM D-萤光素合成晶体(Sigma)、25mM甘氨酰甘氨酸(pH 7.8)组成的10X萤光素储备溶液。制备含有25mM甘氨酰甘氨酸(pH 7.8)、15mM磷酸钾(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EGTA、2mM ATP(Sigma)的萤光素测定缓冲液的储备溶液。每1.0ml的萤光素酶测定缓冲液的工作溶液，由885.5μl测定缓冲液+1μl DTT(1M储备物)+100μl的10X萤光素储备溶液+13.5μl ATP(100mM储备物)组成。除非另外指出，否则通常将含有底物的测定缓冲液，以1∶1(v/v)比例，添加到含有细胞的培养基中。
在表A中提供了被基因改造成表达萤光素酶(例如，GLuc、NLuc、LucPPe)的细胞系，其用于使用Matador细胞毒性测定来测量不同构建体的细胞毒性，该不同构建体靶向不同的细胞表面和细胞内抗原。在该实验中使用的细胞系、在细胞系上的靶抗原和它们的生长培养基显示在下表A中。这些细胞系也可用作抗原呈递细胞(APC)，用于在不存在和存在本公开的不同的双特异性的/多特异性的衔接物的情况下，激活/繁殖表达靶向不同抗原的CAR/TCR的免疫细胞。例如，CD19+REC-1细胞可以用作靶向CD19的CAR的APC。可替换地，在有兰妥莫单抗存在下，REC-1细胞可以用作免疫细胞(例如，T细胞或间皮素CAR-T细胞或NYESO-1-TCR-T细胞)的APC。将细胞在5％CO2保湿培养箱中于37℃培养。所述细胞系获自ATCC、NIH AIDS试剂计划，或可在实验室中得到。
表A
Figure BDA0002987268390001251
Figure BDA0002987268390001261
用NFAT依赖性GFP报道基因改造的Jurkat细胞系(克隆E6-1)，是UCSF的ArthurWeiss博士的赠品。将Jurkat细胞维持在补充了10％FBS、青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中。
向导RNA分子
包括表8中列出的靶向序列的gRNA分子，用于在该子实施例中描述的实验。除非另有说明，否则将所有gRNA分子作为双gRNA分子进行测试，其中双gRNA分子包括在该子实施例中所述的tracr和crRNA序列。
表8
Figure BDA0002987268390001272
CRISPR CAR T细胞的产生
在第0天，将分离并冷冻的Pan T细胞解冻，并用CD3/CD28珠子(CD3/CD28 CTS
Figure BDA0002987268390001271
43205D)活化。在第1天，用编码CD19 CAR(SEQ ID NO：2822)或CD20 CAR(SEQID NO：2824)CAR)的慢病毒，转导活化的T细胞。在第3天，对转导的CART细胞进行电穿孔，以引入预复合的gRNA/Cas9核糖核蛋白(“RNP”)形式的CRISPR/Cas系统。为了形成RNP，将所有RNA样品在95℃加热。将化脓链球菌(S.pyogenes)CAS9蛋白(NLS CAS9iPROT106154，37μM)在缓冲液中稀释，然后向其中加入tracrRNA(具有序列AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGC ACCGAGUCGGUGUUUUUUU(SEQ ID NO：2054)；AXO Labs)。将CAS9蛋白与tracrRNA混合后，添加CRISPR RNA(在每种情况下，各crRNA包含序列nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2052)，其中n残基代表靶向表8中所示不同基因的所示靶向序列的20个核糖核酸残基)。然后将预复合的RNP添加到共计100万个细胞中，RNP浓度为3.2μM。使用
Figure BDA0002987268390001281
转染系统100μL试剂盒(MPK10096)，在1600V、lOms、3个脉冲下，用氖电穿孔仪进行电穿孔。将细胞再培养7天。细胞然后分裂，其中一些用于执行流式细胞计量术：针对CAR(PE)和不同标志物诸如CD3(PerCP-Cy5.5)、CD4(V450)和CD8(APC)、CD45RA、CCR7、CD62L染色。将剩余的T细胞冷冻，并用于功能测定和下一代测序(NGS)样品制备。使用CRISPR系统进行T细胞基因编辑的其它方法是本领域已知的，并且可以用于本公开的替代实现中(Osborn,MJ等人,Molecular Therapy,24；3,2016)。
可替换地，将编码靶向表4a中所示不同基因的gRNA的双链寡核苷酸，克隆到pLenti-CRISPR-v2(SEQ ID NO：359)(其可得自Addgene)中的U6启动子的下游，并遵循分销商(即Addgene)的推荐。该载体还编码化脓链球菌CAS9蛋白(Sp-NLS-Cas9)。根据分销商(Addgene)的推荐，通过将编码gRNA的慢病毒载体与包装载体一起转染到293FT细胞中，制备慢病毒。在第0天，将分离并冷冻的Pan T细胞解冻，并用CD3/CD28珠子(CD3/CD28 CTS
Figure BDA0002987268390001282
43205D)活化。在第1天，用编码不同gRNA的慢病毒(或空载体)和编码CD19 CAR(SEQ ID NO：477)或CD20 CAR(SEQ ID NO：478)CAR)的慢病毒，转导活化的T细胞。将细胞再培养7天。细胞然后分裂，其中一些用于执行流式细胞计量术：针对CAR(PE)和不同标志物诸如CD3(PerCP-Cy5.5)、CD4(V450)和CD8(APC)、CD45RA、CCR7、CD62L染色。将剩余的T细胞冷冻，并用于功能测定和下一代测序(NGS)样品制备。
基本上类似的规程，用于制备靶向不同基因并表达TCR或下一代CAR(例如，SIR、Ab-TCR、TFP等)的CRISPR T细胞。
shRNA CAR T细胞的制备
为了制备编码shRNA的慢病毒，使用标准的分子生物学技术，将双链寡核苷酸克隆到慢病毒载体pLKO.1(SEQ ID NO：357)中U6启动子的下游，所述双链寡核苷酸编码靶向表5所示不同基因的shRNA (SEQ ID NO：274至SEQ ID NO：335)。按照分销商(Addgene)的推荐，将编码shRNA的转移载体与包装质粒一起转染到293FT细胞中以后，制备慢病毒。如上所述，将活化的T细胞用所得的病毒感染，并繁殖。在某些实施方案中，用编码shRNA的慢病毒和编码CAR的慢病毒共同感染T细胞。在某些实验中，用嘌呤霉素选择被编码shRNA的慢病毒感染的T细胞。
编码JAK1、JAK3、Stat5b、Stat3、BRAF、IL2RG和CARD11组成活性突变体的慢病毒表达载体的制备.
编码JAK1、JAK3、Stat5b、Stat3、BRAF、IL2RG和CARD11的cDNA得自Sinobiological(义翘神州生物技术有限公司)，并使用定制引物，使用基于PCR的快速-变化(Quick-Change)方案进行诱变。通过自动测序确认突变体克隆。所得的克隆用作PCR中的模板，以扩增编码序列。将扩增的PCR片段克隆到慢病毒载体pLENTI-EF1α(SEQ ID NO：337)或逆转录病毒载体MSCV-hygro(Clontech)中。还将编码JAK1、JAK3、Stat5b、Stat3、BRAF、IL2RG和CARD11的野生型和突变体形式的cDNA，克隆到编码CAR/TCR的慢病毒或逆转录病毒载体中，并通过2A序列与它们隔开。
T细胞增殖测定
评价了响应于靶细胞的CART细胞增殖。靶细胞系列出在表A中。将CAR-T细胞在T细胞培养基中解冻温育2小时以进行恢复。将细胞在Cellometer上计数。在10,000拉德(rad)，辐照靶细胞。辐照后，将靶细胞在T细胞完全培养基中洗涤2次并计数。然后将30,000个经辐照的靶细胞与CART细胞以1∶1比例共培养。作为阴性对照，仅将培养基添加至CART细胞。
将共培养物在37℃温育4天。在第4天，将共培养细胞在冰上用CD3-percp cy5.5(Ebioscience：45-0037)、CD4-eflor450(Ebioscience：48-0047)和CD8-APC(Ebioscience17-0087)染色20分钟，并通过相对于CountBright绝对计数微球(LifeTechnologies)进行流式细胞计量术测量，以确定相对细胞计数。
通过两个分别在冰上孵育20分钟的步骤，测量CAR表达：生物素化的蛋白L+链霉亲和素-PE(Jackson immuno research)。使用BD 5激光Fortessa，获取流式细胞计量术数据，并通过FlowJo软件进行分析。
双特异性抗体的表达和纯化
通过IDT，合成编码双特异性抗体序列的DNA片段(SEQ ID NO：2470-2645)，并克隆到pcDNA3.1载体(ThermoFisher)中。使用自动化的Sanger测序，对构建体进行序列确认。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞经双特异性抗体表达载体转染，然后培养7天，以产生双特异性抗体。收集含有分泌的双特异性抗体分子的CHO细胞上清液。通过FPLC AKTA系统，使用HisTrapHP柱(GE Healthcare)纯化双特异性抗体。简而言之，将CHO细胞培养物澄清，并加载到具有低咪唑浓度(20mM)的柱上，然后使用等度高咪唑浓度洗脱缓冲液(500mM)洗脱结合的双特异性蛋白。
从普乐沙福(Perixafor)动员的细胞产生CAR-T细胞并表征
血液癌症患者在第1～5天，以每天10μg/kg的剂量，通过皮下注射施用G-CSF(优保津)，并在第3～5天，以每天0.24mg/kg的剂量皮下施用Perixafor。在Perixafor的最后一剂后6小时，从患者收集白细胞去除术产品。使用磁珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书，从白细胞去除术产品中分离CD3+T细胞。将T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。使用聚凝胺，将T细胞用编码靶向CD19的嵌合抗原受体的三种不同慢病毒载体感染两次：a)FMC63-BBz-2A-PAC；b)FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP和c)CD19-hu-mROO5-1-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP。CARFMC63-BBz-2A-PAC的序列呈现在SEQ ID NO：478中。该CAR构建体是含有FMC63 scFv(作为抗原结合结构域)、4-1BB共刺激结构域和CD3z活化结构域的第2代CAR构建体。该构建体还经由2A可切割的接头共表达嘌呤霉素抗性基因(PAC)。CAR构建体FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP在设计上与构建体FMC63-BBz-2A-PAC类似，不同之处在于PAC基因被替代成EGFP(增强的绿色荧光蛋白)。最后，构建体CD19-hu-mROO5-1-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP在设计上与构建体FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP类似，不同之处在于FMC63 scFv被也靶向CD19的CD19-hu-mROO5 scFv替代。将CAR FMC63-BBz-2A-PAC克隆进pLENTI-EF1载体(SEQ ID NO：337)中，而将其它两种CAR克隆进噬菌体载体(Addgene目录号24527)中。用CAR构建体感染后，将T细胞在补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中繁殖。还用嘌呤霉素选择被FMC63-BBz-2A-PAC CAR构建体转导的细胞，持续12天。
将被CAR构建体FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP和CD19-hu-mROO5-1-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP转导的T细胞，在没有药物选择下繁殖，并通过流式细胞计量术监测转导效率。在第8天，大约37.2％和42.8％的被CAR构建体FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP和CD19-hu-mROO5-1-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP感染的T细胞分别表现出EGFP表达。在第24天，大约34.4％和60.8％的被CAR构建体FMC63-MYC-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP和CD19-hu-mROO5-1-CD8TM-BBZ-T2A-eGFP感染的T细胞分别表现出EGFP表达。这些结果证实，Perixafor动员的细胞可以用于制备CAR-T细胞，且这些细胞可以在体外繁殖而不经历衰竭。
为了检查从Perixafor动员的细胞产生的CAR-T细胞是否具有功能活性，在培养10天后，在384孔板中，在60μl的XVIVO培养基中，一式三份地将大约3x104CAR-T细胞或对照T细胞与相同数量的稳定表达LucPPe-146-1H2(LucPPe)的RAJI或NALM6细胞共培养4小时。可替换地，以10∶1的E；T比例培养细胞。如PCT/US17/52344“A Non-RadioactiveCytotoxicity Assay”中所述，通过添加D-萤光素来测量细胞毒性。洋地黄皂苷的处理用于测量最大细胞死亡。图1显示了，如发光增加所测得的，所有三种CAR构建体有效诱导RAJI的细胞死亡。类似地，图2显示了，如发光增加所测得的，所有三种CAR构建体有效诱导NALM6细胞的死亡。这些结果证明，可以从Perixafor动员的血细胞产生CAR-T细胞，并且这样的细胞对表达其靶抗原的细胞表现出细胞毒性。
在单独的实验中，在24小时后收集来自共培养实验的上清液，并测定细胞因子的诱导。观察到，相对于与亲本T细胞一起的共培养，CAR-T细胞与RAJI细胞的共培养导致IFNγ、TNFα和IL2的产生增加。
通过流式细胞计量术，分析了CAR-T细胞的不同标志物(例如，CD4、CD8、CD62L、P-糖蛋白、CD25、CD127和FoxP3等)的表达。没有观察到TREG(CD3+、CD4+、CD25高、CD127低、FoxP3+)细胞的比例的显著增加，从而提示，可以从Perixafor动员的血细胞生成CAR-T细胞，且没有TREG的会过度生长。另外，从Perixafor动员的血液产生的CAR-T细胞产品中的CD4和CD8细胞的比例，类似于从非动员的细胞产生的CAR-T细胞产品中的CD4和CD8细胞的比例。
为了测试从Perixafor动员的血液制备的不同CAR-T细胞的体内效力，通过尾静脉向NSG小鼠注射0.5x 106个稳定表达荧火虫萤光素酶的RAJI细胞(RAJI-Luc)，并在三天后注射4x 106个表达不同CAR构建体的T细胞。在注射D-萤光素后，每周通过生物发光成像对动物进行成像。在没有施用T细胞或施用对照T细胞的动物中，存在明显的肿瘤生长，并且它们全部死亡。相比之下，施用了从Perixafor动员的血液产生的CAR-T细胞的动物表现出改善的存活。
当从仅用Perixafor处理进行动员(未用G-CSF处理)的血细胞生成CAR-T细胞时，获得了基本相似的结果。
从BL-8040、G-CSF、GM-CSF-动员的细胞产生CAR-T细胞并表征
从健康的受试者，或已经以1mg/kg的剂量皮下施用BL-8040持续2天的患不同癌症的受试者，收集白细胞去除术产品。如在上述实施例中所述，将得到的白细胞去除术细胞产品用于分离T细胞，然后用于制备CD19 SIR-T细胞。从BL-8040-动员的血液产生的CD19SIR-T细胞表现出体外繁殖，在体外暴露于靶细胞时显示出有效的细胞毒性和细胞因子产生，且在免疫缺陷小鼠中使用RAJI异种移植物模型进行体内试验时显示出有效的抗癌活性。当从健康的受试者，或已经施用G-CSF(皮下10μg/kg，持续5天)或GM-CSF(皮下250μg/m2/天，持续5天)的患不同癌症的受试者收集的白细胞去除术产品产生CAR-T或SIR-T细胞时，获得了基本相似的结果。
Perixafor、BL-8040、G-CSF、GM-CSF-动员对细胞疗法产品的产生的影响
进行了一项研究，以对比从已经接受了2个或更多个周期的在先化学疗法的癌症患者产生的细胞疗法产品。患不同类型的不同癌症(例如，弥散性大B细胞淋巴瘤、急性B-ALL、CLL、多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等)的患者是符合条件的。从有和没有Perixafor动员(在第1～3天，每天皮下施用0.24mg/kg)的受试者，收集白细胞去除术产品。如上述部分所述，分离出T细胞，并用于使用慢病毒介导的基因转导来制造CAR-T和TCR-T细胞。观察到Perixafor动员会提高白细胞去除术产品中T细胞的收率，并且对以下方面没有重大不利影响：a)基因转导；b)CAR/TCR的表达；c)CAR-T/TCR-T产品体外繁殖；d)CAR-T/TCR-T细胞产品在体外的细胞毒性和细胞因子产生；e)CAR-T/TCR-T细胞产品体内繁殖；和f)CAR-T/TCR-T细胞产品在体内的抗肿瘤效力。发现从Perixafor动员的白细胞去除术产品，产生的CAR-T/TCR-T产品会提高在制造时获得的CAR-T/TCR-T细胞的总数，减少制造时间和成本，并减少制造失败。当在白细胞去除术之前使用其它CXCR4拮抗剂(例如，BL-8040)进行动员时，获得了类似的结果。最后，还发现用G-CSF、GM-CSF动员会提高细胞去除术产品用于产生CAR-T细胞的收率。
使用Perixafor动员的免疫细胞治疗弥散性大B细胞淋巴瘤患者
弥散性大B细胞淋巴瘤患者以每天皮下0.24mg/kg的剂量接受Perixafor，持续3天。在Perixafor的最后一剂后6小时，从患者收集白细胞去除术产品。使用来自MiltenyiBiotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001311
系统并按照制造商的推荐，对白细胞去除术产品进行CD3-阳性的T淋巴细胞的选择。细胞用编码CD19-CAR(例如，SEQ ID NO：2822]的临床级慢病毒进行转导，然后使用CliniMACS
Figure BDA0002987268390001312
系统，在封闭系统中选择和繁殖CAR-T细胞。得到的细胞产品经过质量控制试验(包括无菌性和肿瘤特异性的细胞毒性试验)后，将其冷冻保存。同时，在白细胞去除术后，患者开始淋巴细胞耗竭性化学疗法(30mg/m2/天的氟达拉滨+500mg/m2/天的环磷酰胺x 3天)。在他们的淋巴细胞耗竭性方案结束后1天，将先前储存的CAR-T细胞产品运输、解冻并在患者的床边输入。患者接受静脉内输入的CAR-转导的淋巴细胞。根据研究方案，CAR-T产品的剂量范围是从1x 104CAR+ve CD3细胞/kg至5x 108CAR+veCD3细胞/kg。CAR-T产品可以以单次输注或分批输注来施用。可以在T细胞输注前至少30分钟，口服15mg/kg对乙酰氨基酚(最大650mg)和静脉内0.5～1mg/kg苯海拉明(最大剂量50mg)对患者进行预先药物治疗。患者可以任选地接受每天注射人IL-2。然后由医生酌情进行临床和实验室相关的随访研究，并可以包括：关于表达CD19的ALL/淋巴瘤细胞和/或过继转移的T细胞的存在的定量RT-PCR研究；FDG-PET和/或CT扫描；关于疾病特异性病理评价的骨髓检查；淋巴结活组织检查；和/或，根据FDA的生物应答改进剂咨询委员会(FDA'sBiologic Response Modifiers Advisory Committee)制定的适用于基因转移研究的指南，进行长期随访。基本上类似的方案，可以用于使用Perixafor-动员的免疫细胞(例如，T细胞)治疗其它疾病，所述细胞已经被基因改造成表达CAR，其中CAR靶向在造成疾病或与疾病相关的细胞上表达的一种或多种抗原。
使用Perixafor和化学疗法动员的免疫细胞治疗卵巢癌患者
卵巢癌患者接受使用环磷酰胺(4克/m2)+依托泊苷(600mg/m2)的化学疗法。在化学疗法结束后1天，患者接受Pegfilgastrim(12mg)的皮下注射。当绝对嗜中性粒细胞计数达到500/mm3以上时，患者每天皮下注射0.24mg/kg剂量的Perixafor，持续3天。在Perixafor的最后一剂后6小时，从患者收集白细胞去除术产品。使用来自Miltenyi Biotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001313
系统并按照制造商的推荐，对白细胞去除术产品进行CD3-阳性的T淋巴细胞的选择。任选地，通过除去CD25-阳性的T细胞，除去T调节性细胞(CD3+、CD4+、CD25高、CD127低、FoxP3+)。细胞用编码FR1-CAR(例如，SEQ ID NO：2827]的临床级慢病毒转导，然后在封闭系统中选择和繁殖CAR-T细胞。得到的细胞产品通过质量控制试验(包括无菌性和肿瘤特异性的细胞毒性试验)后，将其冷冻保存。同时，在白细胞去除术后，患者开始淋巴细胞耗竭性化学疗法(30mg/m2/天的氟达拉滨+500mg/m2/天的环磷酰胺x 3天)。在他们的淋巴细胞耗竭性方案结束后1天，将先前储存的CAR-T细胞产品运输、解冻并在患者的床边输入。患者接受静脉内输入的CAR-转导的淋巴细胞。根据研究方案，CAR-T产品的剂量范围是从1x104CAR+ve CD3细胞/kg至5x 108CAR+ve CD3细胞/kg。CAR-T产品可以以单次输注或分批输注来施用。可以在T细胞输注前至少30分钟，对患者进行预先药物治疗。患者可以任选地接受每天注射人IL-2。然后由医生酌情进行临床和实验室相关的随访研究。基本上类似的方案，可以用于使用化学疗法和Perixafor-动员的免疫细胞(例如，T细胞)治疗其它疾病，所述细胞已经被基因改造成表达CAR或TCR，其中CAR或TCR靶向在造成疾病或与疾病相关的细胞上表达的一种或多种抗原。
G-CSF和Perixafor在白细胞去除术之前动员免疫以制造细胞疗法产品的用途
健康供体在第1～5天，通过皮下注射，以每天10μg/kg的剂量接受G-CSF(优保津)，并在第3～5天，以每天0.24mg/kg的剂量皮下接受Perixafor。在Perixafor的最后一剂以后6h，从供体收集白细胞去除术产品。使用磁珠从白细胞去除术产品分离CD3细胞。根据本领域已知的方法，使靶向间皮素的嵌合抗原受体(例如SEQ ID NO：2832)，靶向TCRα(TRAC)基因座。使用本领域已知的方法，使用CD3/CD28珠子，将表达间皮素-CAR-T细胞的TCRa-缺陷型T细胞纯化，繁殖。使用Matador测定，测试了等分试样的间皮素-CAR-T细胞对SKOV3-GLuc细胞的细胞毒性，并证实与对照CAR-T细胞相比，其发挥稳健的细胞毒性。使用本领域已知的方法，使用SKOV3细胞(1x 105细胞，通过皮下注射)在NSG小鼠中的异种移植物模型，测试了另一个等分试样间皮素-CAR-T细胞的体内活性(5x 105CAR-T细胞/小鼠)，并证实与施用对照CAR-T细胞的小鼠相比，其降低肿瘤生长并延长存活。使用本领域已知的方法，通过静脉内输注，将间皮素-CAR-T细胞的另一个等分试样(5x 108CAR-T细胞)施用给表达间皮素的间皮瘤患者。
β2肾上腺素能激动剂或锻炼在白细胞去除术之前动员免疫以制造细胞疗法产品的用途
在患者接受了0.005mg/kg/min的肾上腺素静脉内输注约30分钟后，从具有表达间皮素的转移性卵巢癌的患者收集白细胞去除术产品。在一个替代实施方案中，患者在跑台上进行中等锻炼30分钟以将心率提高到150次搏动/分钟以上。使用来自Miltenyi Biotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001321
系统并按照制造商的推荐，选择CD3-阳性的T淋巴细胞。用编码间皮素CAR(SEQ ID NO：2831)的慢病毒转导大约108-108T细胞。使用CD3/CD28珠子，在封闭系统中将CAR-T细胞繁殖14～21天。得到的细胞产品经过质量控制试验(包括无菌性和肿瘤特异性的细胞毒性试验)。通过静脉内输注将CAR-T细胞产品施用给患者。CAR-T产品的剂量范围是从1x 104CAR+ve CD3细胞/kg至5x 109CAR+ve CD3细胞/kg。
BL-8040在白细胞去除术之前动员免疫以制造细胞疗法产品的用途
皮下施用1mg/kg BL-8040持续2天后，从健康的志愿者收集白细胞去除术产品。使用来自Miltenyi Biotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001322
系统并按照制造商的推荐，选择CD3-阳性的T淋巴细胞。用编码CD19 CAR(SEQ ID NO：478)的慢病毒转导大约108-108T细胞。使用CD3/CD28珠子，在封闭系统中将CAR-T细胞繁殖14～21天。得到的CAR-T细胞产品经过质量控制试验(例如，无菌性、收率、肿瘤特异性的细胞毒性试验、抗原诱导的细胞因子产生、免疫表型等)，并分成等分试样进行冷冻保存。将CAR-T细胞产品的等分试样解冻，并通过静脉内输注施用给CD19+ALL患者。CAR-T产品的剂量范围是从1x104CAR+ve CD3细胞/kg至5x109CAR+veCD3细胞/kg。基本上类似的方案，用于从BL-8040动员的免疫细胞制备自体CAR-T细胞产品。
EZH2抑制剂他泽司他(Tazemetostat)(EPZ6438，目录号S7128，CaymanChemicals)和GSK343(目录号S7164 Cayman Chemicals)对生成用于过继免疫疗法的表现出CD45RA+CD62L+CCR7+表面表达的T干细胞的影响
在申请号PCT/US2017/042248中，已经描述了P-糖蛋白(Pgp)介导的DiOC2(3)外流，分离干样T细胞以用于过继性细胞疗法的用途。在下述实施例中，使用DiOC2(3)染色来研究不同抑制剂对干样T细胞生成的影响。
第0天：从去标识的供体获得血液。RBC裂解后，使用Ficoll-Hypaque分离来收集PBMC。使用来自Miltenyi的CD3微珠(目录号130-050-101)，从4.4亿个PBMC分离2.08亿个T细胞。
将T细胞在三种不同条件下培养：
1.含有IL2 50IU/ml、CD3抗体(30ng/ml)和CD28抗体(30ng/ml)的XVIVO 15培养基(Lonza)。
2.含有CD3抗体(30ng/ml)和CD28抗体(30ng/ml)的XVIVO 15培养基(Lonza)。
3.含有IL2 50IU/ml的XVIVO 15培养基(Lonza)。
第1天：以在2ml培养基中1百万个细胞的密度，将细胞铺板在6-孔板中(如上所述)，并用不同的抑制剂处理。
将细胞培养6天，并将经上面列出的所有处理(1-21)的细胞的等分试样，用于在4℃用DiOC2(3)(60ng/ml在RPMI培养基中)对细胞染色40分钟，用RPMI培养基洗涤，将DiOC2(3)染料在37℃外流90分钟，用PBS+1％FBS洗涤，在4℃用CD62L-APC抗体(5μl/100μl/样品)染色1小时，用PBS+1％FBS洗涤2次，并在流式细胞仪上分析，以检查这些药物是否影响染料外流或Pgp+T细胞群体，其富集T干细胞并且更适于过继性细胞疗法，例如，用于制造CAR-T或TCR-T细胞疗法产品。
更换6孔板中的细胞生长培养基，并以相同浓度添加新鲜药物，再培养一周。
下面表9和表10显示了，试验的不同抑制剂对Pgp+和CD62L+T细胞群体的百分比的影响。当添加到含有CD3抗体、CD28抗体和IL2处理的培养物时，大多数抑制剂会增加Pgp+和CD62L+干样T细胞的百分比。例如，Pgp+细胞的百分比，从含有CD3-CD28-IL2处理的培养物中的19.8％细胞增加到含有CD3、CD28、IL2和Tazemetostat(100nM)处理的培养物中的27.17％，以及含有CD3、CD28、IL2和GSK343(500nM)的培养物中的30.62％。类似地，Pgp+CD62L+细胞的百分比，从含有CD3-CD28-IL2处理的培养物中的6.57％细胞增加到含有CD3、CD28、IL2和Tazemetostat(100nM)处理的培养物中的13.16％，以及含有CD3、CD28、IL2和GSK343(500nM)的培养物中的13.33％。
表9
Figure BDA0002987268390001331
Figure BDA0002987268390001341
表10
Figure BDA0002987268390001342
011618(第11天)：更换培养基，并将新鲜药物加入6孔板。
011818(第13天)：将已经用上面列出的所有处理(1～21)培养13天的细胞的一个等分试样，用DiOC2(3)(60ng/ml在RPMI培养基中)在4℃对细胞染色40分钟。随后，将细胞用RPMI培养基洗涤，并使染料在37℃外流90分钟。将细胞用PBS+1％FBS洗涤，用CD62L-APC(5μl/100μl/样品)在4℃染色1h，用PBS+1％FBS洗涤2次，并在流式细胞仪上分析，以检查这些药物处理是否导致Pgp+/CD62L阳性群体的增加。
表11
Figure BDA0002987268390001343
Figure BDA0002987268390001351
表12
Figure BDA0002987268390001352
用上面列出的所有处理(1-21)培养13天的细胞的第二个等分试样用PBS+1％FBS洗涤，用CD8-PerCP、CD45RA-FITC、CCR7-PE和CD62L-APC(5μ/100μl/4种抗体中的每一种的样品)在4℃染色1h，用PBS+1％FBS洗涤2次，并在流式细胞仪上分析，以检查这些药物是否富集表现出CD8+CD45RA+CCR7+CD62L+表面表达的T干细胞。
表13
Figure BDA0002987268390001353
Figure BDA0002987268390001361
EZH2、BRD和其它抑制剂，对制备用于过继免疫疗法的表现出CD45RA+CD62L+CCR7+表面表达的优秀T干细胞的影响
第0天：从去标识的供体获得血液。RBC裂解后，使用Ficoll-Hypaque分离来收集PBMC。使用CD3微珠，从PBMC分离2亿个T细胞。将T细胞在含有IL2(50IU/ml)、30ng/ml CD3和CD28抗体的XVIVO 15培养基(Lonza)中培养过夜。
第1天：将细胞以每孔30万个细胞/ml的密度铺板在24孔板中，并用不同的药物处理。
在第7天，将培养基替换为含有新鲜药物的新鲜培养基。
在第13天，将培养基替换为新鲜培养基和新鲜药物。将一半细胞转移至6孔板。
第14天：将用上面列出的所有处理(持续13天)的细胞的等分试样，用DiOC2(3)(60ng/ml在RPMI培养基中)在4℃对细胞染色40分钟，用RPMI培养基洗涤，使DiOC2(3)染料在37℃外流90分钟，用PBS+1％FBS洗涤，用CD62L-APC抗体(CD62L是静止T细胞的标志物)(5μl/100μl/样品)在4℃染色1小时，用PBS+1％FBS洗涤2次，并在流式细胞仪上分析，以检查这些药物是否影响染料外流或Pgp+(即，DiOC2(3)-无应答(dull))T-细胞群体。
表15表明，抑制剂处理增加了Pgp+(DiOC2(3)-无应答)和CD62L+T细胞群体，如下所示：
Figure BDA0002987268390001371
Figure BDA0002987268390001381
用上面列出的所有处理培养14天的细胞的第二个等分试样，用PBS+1％FBS洗涤，并用CD8-PerCP、CD45RA-FITC、CCR7-PE和CD62L-APC(5ul/100ul/4种抗体中的每一种的样品)在4℃染色1小时，用PBS+1％FBS洗涤2次，并在流式细胞仪上分析，以检查这些药物是否富集表现出CD8+CD45RA+CCR7+CD62L+表面表达的T细胞。
各种抑制剂对CD8+/CD45RA+/CCR7+/CD62L+(P4)和CD45RA+/CCR7+/CD62L+(P6)的百分比的影响显示在下面表16中。结果表明，在用不同的抑制剂处理后，CD8+/CD45RA+/CCR7+/CD62L+和CD45RA+/CCR7+/CD62L+细胞的百分比的显著增加。例如，在未处理的样品中，CD8+/CD45RA+/CCR7+/CD62L+细胞的百分比为56.3％，并在用R05335-500 nM、CBFB-500nM、CBFB 1μM、BI7273 100nM、BI7273 500nM、B9564 100nM、B9564 500nM、LP99 500nM、LP99 1μM、IBRD9 500nM、IBRD9 1μM、GSK503 1μM、GSK5032μM、GSK126 100nM、GSK126500nM、UNC1999 100nM、UNC1999 500nM、CPI169 100nM、CPI169 200nM、CPI360 100nM、CPI360 500nM、EI1 500nM、EI1 1μM、EPZ011989 500nM、EPZ011989 1μM、EPZ005687 10nM、EPZ005687 100nM和EED226 500nEED226 1μM、UNC0642 10nM和UNC0642 100nM处理后，增加至>70％。
表16.
Figure BDA0002987268390001382
Figure BDA0002987268390001391
药物处理对Blincyto(兰妥莫单抗)诱导的细胞毒性的影响
用抑制剂处理20天后，使用Matador细胞毒性测定法，测试了来自上述实验的细胞，它们诱导兰妥莫单抗诱导的细胞死亡的能力。为此目的，将未处理的和经抑制剂处理的T细胞，以2x105个细胞/孔，单独地或在有2x105Nalm6-GLuc细胞存在下，铺板在24孔板中的不含任何额外生长因子的XVIVO培养基中。以100ng/百万T细胞的终浓度加入兰妥莫单抗(Blincyto)。将细胞培养过夜，第二天收集上清液并使用Matador测定法进行测定。对于Matador测定法，将15μl的上清液添加到384-孔板每个孔的15μl的XVIVO培养基中，并通过以孔模式向每孔添加15μl的1∶100CTZ，来进行hGLuc测定。结果显示，与未处理的T细胞相比，用EI1(500nM)、EPZ005687(100nM)、LP99(1μM)、UNC1999(100nM)、CPI169(200nM)、CPI360(100nM)和CPI360(500nM)处理的细胞中，细胞毒性显著增加。因而，除了它们对T干细胞的效果之外，上述抑制剂还可以用于增强免疫效应细胞(诸如CAR-T细胞、TCR-T细胞和双特异性的T细胞衔接物，例如，兰妥莫单抗处理过的T细胞)的细胞毒性潜力。
预防和逆转疾病中的T-细胞衰竭
未修饰的宿主：感染
广泛报道了患有慢性HIV、HCV、HBV感染的患者耗尽了T细胞。
在某些实施方案中，如下单独或组合地用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2抑制剂药物，治疗患有慢性病毒感染的患者：对患有慢性HIV、HCV、HBV感染的患者群体取样，以确定他们的从外周血单核细胞(PBMC)获得的T细胞上表达PD1。使用PD1作为衰竭标志物的规程，应用于在慢性HIV和EBV感染中存在的衰竭T细胞样品，因此是在慢性病毒感染中可接受的衰竭标准(Day等人,2006,出处同上)。与健康供体相比，进行该分析。可替换地，通过四聚体共染色测定病毒特异性T细胞的PD1。随后，分析CD4+和CD8+T细胞的PD1表达，并对YYl、Ezh2或cJun表达进行共染色。这之后，单独地或组合地用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂药物处理。将BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2抑制剂药物，直接注射(例如，腹膜内、静脉内途径)或口服施用给遭受慢性病毒感染(诸如HIV、HCV、HBV)的患者。通过测量外周血淋巴细胞中靶蛋白的抑制，确定每种抑制剂施用的剂量和频率。在一个替代实施方案中，通过药代动力学研究确定施用剂量和频率，以将每种抑制剂药物的血浆水平维持在IC50以上。
因此，预期BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2抑制剂药物的主要效果是针对病毒特异性的衰竭T细胞，其可能通过恢复IL2产生和T细胞增殖而逆转衰竭，且预期除了IL2挽救以外的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2抑制剂药物会减少PD1、Lag3和Tim3的衰竭标志物。
未修饰的宿主：癌症
在某些实施方案中，单独地或组合地用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5抑制剂药物，治疗具有恶性癌症的患者。在一个实施方案中，口服地施用所述抑制剂。在另一个实施方案中，胃肠外地施用所述抑制剂。在另一个实施方案中，将所述抑制剂直接注射在肿瘤部位。预期抑制剂药物的主要效果是针对浸润肿瘤的衰竭T细胞，以通过恢复IL2产生和T细胞增殖来帮助逆转衰竭。
经修饰的宿主：癌症，TIL治疗
在某些实施方案中，如下用经BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5下调或灭活修饰的TIL，来治疗癌症患者：从肿瘤活检组织提取肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，并在培养物中培养。应用在组织培养条件中培养TIL的标准方案。在某些实施方案中，使用商购可得的肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech)。将TIL在培养物中繁殖，活化，并用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂处理，或用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5 shRNA慢病毒颗粒感染，以确定衰竭表型的逆转。使用的化学抑制剂列出在表6中，并以高于它们的IC50浓度的剂量使用。靶向以上基因的shRNA的序列(例如，SEQ ID NO：274-335；2226-2237)显示在表5中。一旦从样品患者确认了这些体外结果，便对黑素瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤、非小肺癌患者应用类似的规程。在这样的患者中，将TIL提取，离体繁殖，并用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2化学抑制剂处理，或用编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5 shRNA的慢病毒载体感染，并输回到受试者中以产生抗肿瘤应答。在另一个实施方案中，将TIL提取，离体繁殖，并使用标准的分子生物学技术，使用Cas9/CRISP方案，单独地或组合地敲除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的一个或两个等位基因。在一个实施方案中，通过用慢病毒载体感染细胞，实现BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的敲低，其中慢病毒载体编码酿脓链球菌(Streptococcus pyogenese)Cas9/CRISP和靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的gRNA序列。例如，合成了与靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和DR5的gRNA序列对应的双链寡核苷酸，并克隆进从Addgene得到的pLenti-CRISPR-v2载体(SEQ ID NO：359)中。靶向以上基因的gRNA的序列(SEQ ID NO：1-104；1775-1786)提供在表4a中。按照可得自Addgene的推荐制备慢病毒，并用于感染TIL。随后，将TIL在含有CD3/CD28珠子和IL2(30IU)的T细胞培养基中繁殖，并用于体外和体内研究以及用于人类临床试验。
在另一个实施方案中，将TIL提取，离体繁殖，并遗传基因改造成单独地或组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体。JAK1(例如，SEQID NO：375-376)、JAK3(例如，SEQ ID NO：361-367)、STAT5b(例如，SEQ ID NO：369-373)、STAT3(例如，SEQ ID NO：381-385)、IL2RG(例如，SEQ ID NO：387)、CARD11(例如，SEQ IDNO：378-379)和BRAF(例如，SEQ ID NO：389)的组成活性突变体的SEQ ID NO提供在表1中。在另一个实施方案中，将TIL提取，离体繁殖，并遗传基因改造成单独地或与慢病毒载体一起组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体，其中慢病毒载体编码靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5中的一个或多个的shRNA。在另一个实施方案中，将TIL提取，离体繁殖，并遗传基因改造成单独地或与慢病毒载体一起组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体，其中慢病毒载体编码酿脓链球菌Cas9/CRISP和靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的gRNA序列。在另一个实施方案中，将TIL提取，在有BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5中的一种或多种的化学抑制剂存在下离体繁殖，并遗传基因改造成单独地或组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体。
经修饰的宿主：感染，CAR-T和TCR-T治疗
将CAR-T细胞和TCR-T细胞通过共转导或连续转导，修饰成表达RNAi或shRNA或其它抑制性RNA，以阻止BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5表达。在另一个实施方案中，将CAR-T/TCR-T细胞通过共转导或连续转导，修饰成单独地或组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式。在另一个实施方案中，将CAR-T和TCR-T细胞通过共转导或连续转导，修饰成单独地或与RNAi或Rz或其它抑制性RNA一起组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，以阻止BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5表达。
对于具有BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5敲低的CAR/TCR载体，可以使用两个分开的载体系统来表达CAR和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1和HDAC2的siRNA、shRNA或miRNA。在某些实施方案中，使用单一的载体系统，其采用分开的启动子，一个启动子特定用于CAR/TCR转录，另一启动子用于BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的siRNA、shRNA或miRNA转录。
对于共表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式的CAR/TCR载体，可以使用两个分开的载体系统来表达CAR，以及JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性突变体形式。在某些实施方案中，使用单一的载体系统，其采用分开的启动子，一个启动子特定用于CAR/TCR转录，另一启动子特定用于JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF组成活性形式的转录表达。在某些实施方案中，使用单一的载体系统，其采用单一的启动子，来表达表达盒，该表达盒编码CAR/TCR转录，以及JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，其中编码CAR/TCR和突变体的核酸被2A序列隔开。几种示例性的编码CAR/TCR，以及编码JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式的表达盒由SEQ ID NO：484-499表示。通过将编码CAR/TCR的核酸替换成编码不同CAR/TCR的核酸，可以构建其它这样的表达构建体。因而，在SEQ ID NO：484中编码CD8SP-FMC63-(vL-vH)-Myc-BBz盒的核酸可以替换成编码不同CAR或TCR的核酸。类似地，编码JAK3-M511I突变体的核酸可以替换成编码不同突变体JAK1(例如，SEQ ID NO：375-376)、JAK3(例如，SEQ ID NO：362-367)、STAT5b(例如，SEQ ID NO：369-373)、STAT3(例如，SEQ ID NO：381-385)、IL2RG(例如，SEQ ID NO：387)、CARD11(例如，SEQID NO：378-379)和BRAF(例如，SEQ ID NO：389)的核酸。在某些实施方案中，通过同源重组改变它们的基因组基因座，实现在CAR-T/TCR-T细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式。例如，通过使用Cas9/CRISP系统，可以通过同源重组修饰CAR-T细胞中的JAK3基因的一个或多个拷贝，以将它突变成JAK3-M511I突变体形式。
在另一个实施方案中，在施用给患者之前，所述患者具有在BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5中的一种或多种化学抑制剂存在下，离体繁殖的CAR-T/TCR-t。CAR-T/TCR-T细胞的离体繁殖还可以包括AKT/PI3K通路的抑制剂和其它免疫调节性药物，诸如来那度胺。
在另一个实施方案中，所述患者具有在没有离体处理或修饰的情况下，繁殖和施用的CAR-T/TCR-T。将CAR-T/TCR-T细胞输入，并用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂治疗患者数天、数周、数月或数年(根据需要)，以维持抗癌或抗病毒效果。患者也可以接受使用AKT/PI3K抑制剂和/或免疫调节性药物(IMiD)诸如来那度胺的治疗。
基本上类似的方案用于繁殖其它免疫效应细胞，包括、但不限于表达TCR、SIR、TFP和/或AbTCR等的那些。
与其它抗-衰竭措施共施用
上述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，和/或JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，与针对检查点受体或其配体的干预联合施用(“双重治疗”)。在某些实施方案中，上述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，和/或JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，与在本公开中描述的双特异性的和多特异性的衔接物(诸如兰妥莫单抗)联合施用。
在某些实施方案中，如下用检查点轴抗体(例如，纳武单抗、阿特朱单抗)和BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂药物(双重治疗)，治疗适合于用封闭检查点受体的抗体治疗的癌症患者(例如，非小细胞肺癌、移行细胞癌、黑素瘤、其它癌症)：在癌症患者中应用双重治疗的规程，遵循为了确定对特定肿瘤类型的适用性而为每种检查点轴抗体建立的方法：一些需要测试肿瘤的PDLl表达，而其它不需要。如果数据支持检查点受体的抗体对衰竭的逆转会诱导肿瘤应答，则将此视作添加BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂策略，来改善应答的适当证明。
在某些实施方案中，上述的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，和/或JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，与双特异性的和多特异性的衔接物(诸如兰妥莫单抗)和/或共刺激剂(例如，Utomilumab)和/或检查点抑制剂(例如，纳武单抗、阿特朱单抗)和/或免疫调节性药物(例如，来那度胺)联合施用。
CAR-T细胞中的敲除以抵抗衰竭和促进长期持久性
在几种不同的CAR-T细胞中报道了衰竭(Long等人，2015)。涵盖敲除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5，以允许通过改变经基因改造的T细胞的增殖、存活、细胞因子分泌、细胞毒性、终末分化、衰竭和体内持久性来产生不同的免疫应答。
为了产生CAR-T细胞的不同库，在CAR-T细胞中通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除，敲除了BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5。通过电穿孔转染Cas9 mRNA，以及BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的向导RNA(gRNA)，实现CAR-T细胞中的敲除。将向导RNA(gRNA)设计成靶向以上基因的外显子，并列出在表8中。在某些测定中，cas-9是Cas9核糖核蛋白(RNP)。在某些测定中，将Cas9 RNP以及体外转录的靶向BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的gRNA预组装，然后电穿孔进T细胞中。
在另一个实施方案中，将CAR-T细胞通过共转导或连续转导，修饰成仅表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式，或与敲除BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5一起组合地表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和BRAF的组成活性形式。在某些实施方案中，使用与表达CAR的载体相同的载体，在CAR-T细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性形式。在替代实施方案中，使用单独的载体，在CAR-T细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性形式，然后使用一个载体来表达CAR。在一些实施方案中，通过使用同源重组(例如，使用CAS9系统)在它们的基因组等位基因中诱导突变，在免疫效应细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性形式。
BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5敲除，和/或JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性形式的表达，与其它免疫效应细胞(包括、但不限于，TIL、转移的TCR T细胞或抗病毒的CAR-T细胞)一起的类似应用也是合适的。
兰妥莫单抗和其它T细胞双特异性的衔接物用于在体外活化和繁殖T细胞的用途
血沉棕黄层细胞得自来自血库的健康的去标识的成年供体，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书来分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。在一个替代实施方案中，如下活化PBCM或T细胞：在有50IU重组人-IL2存在下，将它们以5x105个细胞/ml的浓度重新悬浮在含有兰妥莫单抗(10ng/ml)+辐照的(100Gy)REC-1细胞(套细胞淋巴瘤；ATCC目录号CRL-3004)(浓度为5x106个细胞/ml)的新鲜XVIVO培养基中。在另一个替代实施方案中，细胞培养基进一步含有经纯化的CD19 x CD28双特异性抗体(SEQ ID NO：2708，2705或2706)和/或CD19 x 41BB双特异性抗体(SEQ ID NO：2761，2762，2758或2764)，各自在约10ng/ml的浓度。将细胞在5％CO2保湿培养箱中在37℃培养。将细胞在以上培养基中活化1天，然后用编码CAR或TCR(例如，SEQ ID NO：2822-2835)或TCR(SEQ ID NO：2836)的慢病毒载体感染。一般而言，在早晨使用旋转感染(与300μl已经重悬在有8μg/ml
Figure BDA0002987268390001451
(Sigma，目录号H9268)存在下的XVIVO培养基中的浓缩病毒一起，在37℃，在1800rpm旋转90分钟)，来感染原代细胞(例如T细胞)。感染以后，将细胞沉淀，并以5x105个细胞/ml的浓度重新悬浮在含有兰妥莫单抗(10ng/ml)+辐照的(100Gy)REC-1(套细胞淋巴瘤；ATCC目录号CRL-3004)细胞(5x106个细胞/ml)和50IU重组人-IL2的新鲜XVIVO培养基中。将细胞在以上培养基中培养10-15天。每2-4天给培养基补充新鲜REC-1细胞、兰妥莫单抗和IL2。通过CFSE染色测得，在有REC-1细胞和兰妥莫单抗存在下培养后实现稳健的细胞繁殖。随后使用本领域已知的方法，将繁殖的CAR-T细胞用于体外细胞毒性研究、在NSG小鼠中的体内效力研究和癌症患者的临床试验，所述癌症表达被CAR/TCR靶向的抗原。
还使用CD19+RAJI和NALM6细胞重复以上实验。尽管在兰妥莫单抗存在下，将表达CAR或TCR的T细胞与RAJI和NALM6细胞共培养后看到繁殖，但是繁殖的程度小于用REC-1细胞所见的程度。因而，套细胞淋巴瘤细胞和具体地REC-1细胞是当与双特异性的T细胞衔接物结合使用时，用于繁殖T细胞(例如，CAR-T细胞、TCR-T细胞和TIL)的优选抗原呈递细胞，所述衔接物具有至少一个结合在REC-1上表达的抗原(例如，CD19、CD20、CD22和BCMA)的结合结构域。REC-1细胞也是用于繁殖靶向CD19、CD20、CD22和BCMA的CAR-T细胞的优选抗原呈递细胞。
通过用CD19-胞外结构域包被的磁珠(CD19-ECD-珠子)替换REC-1细胞，重复实验。在含有兰妥莫单抗(10ng/ml)和CD28抗体(10ng/ml)和IL2(50IU)的新鲜XVIVO培养基中，将CAR-T细胞与CD19-ECD-珠子一起，以1∶1、1∶5和1∶10的比例温育。在一个替代实施方案中，细胞培养基进一步含有经纯化的CD19 x CD28双特异性抗体(SEQ ID NO：2708、2705或2706)和/或CD19 x 41BB双特异性抗体(SEQ ID NO：2761、2762、2758或2764)，各自在约10ng/ml的浓度。将细胞在5％CO2保湿培养箱中在37℃培养10-25天。在兰妥莫单抗存在下，与CD19-ECD珠子一起温育后，看到CAR-T细胞的稳健繁殖。
将如上所述的基本上类似的规程用于使用编码CAR的逆转录病毒进行感染。将基本上类似的规程，用于繁殖经睡美人(sleeping beauty)或piggybac转座子编码的CAR和TCR所转导的T细胞。基本上如以前所述(Nakazawa等人,J Immunother 32,8,2009年10月和Kebriaei等人,Clin Invest.2016；126(9)：3363-3376)，用编码CAR的睡美人和piggyback转座子转导T细胞。如上所述，用兰妥莫单抗和REC-1细胞繁殖细胞。
除了用CD19 x CD28双特异性抗体(例如，SEQ ID NO：2708、2705或2706)替换CD28抗体以外，重复以上实验。在有兰妥莫单抗和CD19 x CD28双特异性抗体(SEQ ID NO：2708、2705或2706)和REC-1细胞或JEKO细胞和IL2(50IU)存在下，表达CAR的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用CD19 x CD28双特异性抗体。当在有REC-1细胞和兰妥莫单抗、CD19 x CD28双特异性抗体和IL2存在下繁殖时，看到表达CAR的PBMC和/或T细胞的稳健繁殖。随后使用本领域已知的方法，将繁殖的CAR-T细胞用于体外细胞毒性研究、在NSG小鼠中的体内效力研究和癌症患者的临床试验，所述癌症表达被CAR/TCR靶向的抗原。
将基本上类似的规程，用于在有兰妥莫单抗和CD19 x 41BB双特异性抗体(SEQ IDNO：2761、2762、2758或2764)和REC-1细胞存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用CD19 x 41BB双特异性抗体。
将基本上类似的规程，用于在有兰妥莫单抗和REC-1细胞+Utomilumab存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。兰妥莫单抗和Utomilumab各自以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用。
将基本上类似的规程，用于在有兰妥莫单抗和REC-1细胞+CD28激动剂抗体存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。兰妥莫单抗和Utomilumab各自以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用。
将基本上类似的规程，用于在有BCMA x CD3 DART和BCMA x CD28双特异性抗体(SEQ ID NO：2709、2711或2712)和U266细胞存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用BCMA x CD3 DART和BCMA x CD28双特异性抗体。
将基本上类似的规程，用于在有BCMA x CD3 DART双特异性抗体和BCMA x 41BB双特异性抗体(SEQ ID NO：2765、2766或2767)和U266细胞存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用BCMA x CD3 DART和BCMA x 41BB双特异性抗体。
将基本上类似的规程，用于在有CD22 x CD3双特异性抗体(SEQ ID NO∶2668、2667或2663)和CD19 x CD28双特异性抗体((SEQ ID NO：2708、2705或2706)和REC-1或JEKO细胞存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用CD22x CD3双特异性的和CD19 x CD28双特异性抗体。还使用RAJI和NALM6细胞重复实验。尽管在有兰妥莫单抗存在下，将表达CAR或TCR的T细胞与RAJI和NALM6细胞共培养后看到繁殖，但是繁殖的程度小于用REC-1细胞所见的程度。
将基本上类似的规程，用于在有兰妥莫单抗和CD22 x 41BB双特异性抗体(SEQ IDNO：2775、2778或2780)和REC-1细胞存在下，繁殖表达CAR-T的PBMC和/或T细胞。以在100pg/ml至100ng/ml之间的浓度使用兰妥莫单抗和CD22 x 41BB双特异性抗体。
在上述实施例中，使用双特异性抗体繁殖表达CAR-T的细胞。
通过使用双特异性抗体，基本上类似的规程可以用于繁殖任何T细胞(例如，TIL、表达重组TCR的T细胞等)，所述双特异性抗体通过它们的抗原结合结构域之一结合并活化T细胞，并且结合在抗原呈递细胞上表达的抗原。例如，当在有表达CD19的细胞(诸如REC-1或K562-CD19或Jeko-1细胞)存在下培养时，在有或没有CD19 x CD28双特异性抗体(例如，SEQID NO；2708、2705或2706)的情况下，兰妥莫单抗可以用于繁殖TIL或繁殖表达重组NY-ESO1TCR的T细胞或繁殖表达间皮素SIR的T细胞。
在有APC和APS存在下，靶向不同抗原的双特异性T细胞衔接物的用途
血沉棕黄层细胞得自来自血库的健康的去标识的成年供体，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书来分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。在5％CO2保湿培养箱中，在37℃，培养细胞。将细胞在以上培养基中活化1天，然后用编码CAR或TCR(例如，SEQ ID NO：2822-2835)或TCR(SEQ ID NO：2836)的慢病毒载体感染。感染以后，将细胞沉淀，并以5x105个细胞/ml的浓度重新悬浮在含有如在表17中所示的抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)、初级活化刺激、共刺激剂和额外细胞因子的新鲜XVIVO培养基中。以10ng/ml的浓度加入所有抗体(包括双特异性抗体)、CD3、CD28和Utomilumab。以30-50IU的浓度加入每种细胞因子(IL2、IL7或IL15)。将细胞在以上培养基中培养10-25天。每2-4天用新鲜培养基更换培养基。随后使用本领域已知的方法，将繁殖的CAR-T细胞用于体外细胞毒性研究、在NSG小鼠中的体内效力研究和癌症患者的临床试验，所述癌症表达被CAR/TCR靶向的抗原。
表17
Figure BDA0002987268390001471
Figure BDA0002987268390001481
Figure BDA0002987268390001491
兰妥莫单抗和/或其它T细胞双特异性抗体和/或共刺激分子(例如，41BB配体或Utomilumab)用于在体内的T细胞活化和繁殖的用途
从患表达间皮素的转移性卵巢癌的患者，收集白细胞去除术产品。使用来自Miltenyi Biotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001492
系统并按照制造商的推荐，选择CD3-阳性的T淋巴细胞。用编码间皮素CAR(例如，SEQ ID NO：2832)的慢病毒转导大约108-108T细胞。使用CD3/CD28珠子，在封闭系统中，将CAR-T细胞繁殖14-21天。得到的细胞产品经过质量控制试验(包括无菌性和肿瘤特异性的细胞毒性试验)。在接受CAR-T细胞的输注之前，患者任选地接受淋巴细胞耗竭性化学疗法。一种示例性的淋巴细胞耗竭性化疗方案包括，30mg/m2/天的静脉内氟达拉滨+500mg/m2/天的静脉内环磷酰胺x3天。一个替代方案包括，在第-7天和第-6天以60mg/kg/天的剂量静脉内施用环磷酰胺，随后在第-5天至第-1天IVPB施用氟达拉滨25mg/m2/天。另一个替代方案是环磷酰胺1000mg/m2。如果施用淋巴细胞耗竭性化学疗法，那么在淋巴细胞耗竭性化学疗法结束后1天输入CAR-T细胞。否则，在没有先前化学疗法的情况下输入CAR-T细胞。通过静脉内输注将CAR-T细胞产品施用给患者。CAR-T产品的剂量为1x104CAR+ve CD3细胞/kg至5x 109CAR+ve CD3细胞/kg。在输入CAR-T细胞的3小时内，给患者施用兰妥莫单抗。对于治疗的前7天，兰妥莫单抗的初始剂量为通过连续静脉内输注9μg/天，然后从第8天(周2)开始至第29天(周4)升高至通过连续静脉内输注28μg/天。任选地，每天1次，以250000IU/kg的剂量，皮下施用白介素(IL)-2，最多21剂，其中第一剂在输注CAR-T细胞产品的3小时内施用。任选地，每4周以0.6-10mg/kg的剂量静脉内施用utomilumab。如果患者显示出任何毒性征象，包括提示细胞因子释放综合征或神经毒性的症状和征象，则停止兰妥莫单抗的输注。
实施例：Perixafor动员的T细胞用于制造TCR/CAR-T细胞产品的用途和兰妥莫单抗用于体内繁殖TCR/CAR T细胞产品的用途.
多发性骨髓瘤患者(HLA-A2)每天皮下接受0.24mg/kg的剂量的Perixafor，持续3天。在Perixafor的最后一剂后6小时，从患者收集白细胞去除术产品。使用来自MiltenyiBiotec的CliniMACS
Figure BDA0002987268390001501
系统并按照制造商的推荐，选择CD3-阳性的T淋巴细胞。用编码NY-ESO-1T细胞受体(SEQ ID NO：2836)的慢病毒转导大约108-108T细胞，并根据本领域已知的方法，使用CD3/CD28珠子繁殖经基因改造的T细胞产品。得到的细胞产品经过质量控制试验(包括无菌性和肿瘤特异性的细胞毒性试验)。通过静脉内输注，将TCR-T细胞产品施用给患者。TCR-T产品的剂量为1x104NY-ESO-1TCR+ve CD3细胞/kg至NY-ESO-1TCR 5x109CAR+ve CD3细胞/kg。将兰妥莫单抗(100ng/106细胞)加入含有NY-ESO T细胞受体基因改造的T细胞产品的袋中，将产品在摇动平台上混合15分钟，然后输入患者中。在NY-ESO TCR基因改造的T细胞产品的输注结束后5分钟内，患者还接受兰妥莫单抗的输注。在治疗的前7天，兰妥莫单抗的初始剂量为连续静脉内输注9μg/天，然后在第8天(第2周)开始至第29天(第4周)升高至连续静脉内输注28μg/天。使用NY-ESO TCR产品，将基本上类似的规程用于治疗滑膜肉瘤、粘液性(myxoid)圆细胞脂肪肉瘤、黑素瘤、NSCLC和卵巢癌的患者。
使用重组的靶向WT1的TCR基因改造的T细胞产品，将基本上类似的规程用于治疗急性髓性白血病(具有表达WT1的AML)的患者。使用Perixafor-动员的已经被基因改造成表达CAR(例如，间皮素CAR、SEQ ID NO：2832；IL13Ra2 CAR、SEQ ID NO：2829；Her2 CAR、SEQID NO：2831；AFP/MHC CAR、SEQ ID NO：2835)或TCR的免疫细胞(例如，T细胞)，基本上类似的方案可以用于治疗其它疾病，其中CAR或TCR靶向造成疾病的或与疾病相关的细胞上表达的一种或多种抗原。所述方法也可以用于涉及肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性细胞疗法和/或与T细胞疫苗接种方案一起使用。
TRAIL拮抗剂和双特异性的T细胞衔接物用于制造CAR-T细胞产品的用途
血沉棕黄层细胞得自来自血库的健康的去标识的成年供体，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。任选地，TRAIL拮抗剂MAB375-SP、DR5-Fc或DR4-Fc单独地或组合地各自以50ng/ml的浓度加入。在5％CO2保湿培养箱中，在37℃培养细胞。将细胞在以上培养基中活化1天，然后用编码靶向CD19的CAR(例如，SEQ ID NO：2822)的慢病毒载体感染。一般而言，在早晨使用旋转感染(与300μl已经重悬在有8μg/ml
Figure BDA0002987268390001502
(Sigma，目录号H9268)存在的XVIVO培养基中的浓缩病毒一起，在37℃在1800rpm旋转90分钟)，来感染原代细胞(例如T细胞)。在晚上更换培养基，并将感染再重复2天，共3次感染。在第3次感染后，将细胞沉淀，并以5x105个细胞/ml的浓度重新悬浮在新鲜XVIVO培养基中，该培养基含有10ng/ml的BCMA xCD3双特异性抗体(SEQ ID NO：2653)+辐照的(100Gy)REC-1细胞(5x106个细胞/ml)和50IU重组人-IL2。将细胞在以上培养基中培养10-15天。任选地，以各自50ng/ml的浓度，单独地或组合地加入TRAIL拮抗剂MAB375-SP、DR5-Fc或DR4-Fc。每3-4天给培养基补充新鲜REC-1细胞、BCMA x CD3 BiTE和IL2。在有REC-1细胞和双特异性抗体存在下培养以后，实现稳健的细胞繁殖。将如上所述的基本上类似的规程，用于使用编码CAR的逆转录病毒进行感染。在一个替代实施方案中，用10ng/ml的兰妥莫单抗替换BCMA x CD3BiTE。
TRAIL中和抗体阻断CAR-T细胞在与THP-1细胞一起培养时产生IL1α.
将使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)从单核细胞分离的T细胞，在IL2(30IU)存在下，用CD3抗体(10ng/ml)和CD28抗体(10ng/ml)刺激24小时，然后用以下载体感染：编码靶向CD19的嵌合抗原受体(GV8)并共表达EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的慢病毒载体，或仅编码EGFP的对照载体。将细胞在补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和30IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中繁殖，并用在下述实验中：
将THP-1细胞(单核细胞性白血病)以106个细胞/孔的密度铺板在24-孔板中，并保持不处理，或用PMA 50ng/ml(以诱导巨噬细胞分化)或PMA 50ng/ml+TRAIL抗体(MAB375-SP20ng/ml)处理。将平板温育过夜以使THP1细胞分化。在另一个24-孔板中，将Bv173-hGLuc(300万个细胞/孔/500μl)与T-载体(3x106个细胞/孔/500μl)细胞或T-CD19-CAR细胞(3x106个细胞/孔/500μl)一起，以1∶10的E∶T比例共培养24h。次日，从Bv173+T细胞收集上清液，并加到在1天前已经铺板在一个单独24-孔板中的THP-1细胞上。将THP1细胞在有上清液存在下培养72h，并收集细胞，离心，并将上清液通过ELISA测试IL1α和IL6的产生。图3显示了THP1细胞的PMA诱导的巨噬细胞分化的抑制，伴有IL1α产生的增加，所述IL1α产生被TRAIL抗体阻断。当将来自T细胞(包括CAR-T细胞)的上清液与TPA分化的THP1细胞一起温育时，TRAIL抗体也对IL1α产生具有不大的抑制作用。
AIL抗体阻断THP1细胞在与CAR-T细胞一起共培养时产生IL1-α
将使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)从单核细胞分离的T细胞，在IL2(30IU)存在下，用CD3抗体(10ng/ml)和CD28抗体(10ng/ml)刺激24小时，然后用以下载体感染：编码靶向CD19的嵌合抗原受体(GV8)并共表达EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的慢病毒载体，或仅编码EGFP的对照载体。将细胞在补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和30IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中繁殖。
在有或没有以12ng/ml或20ng/ml的浓度添加的TRAIL抗体MAB375-SP(R&DSystems)的情况下，将THP1细胞以1.5x105个细胞/孔，单独地，或与CD19+Bv173(以2.5x105个细胞/孔)和/或T-载体细胞或表达针对CD19的CAR(GV8)的T-细胞(2.5万个细胞/孔)一起，铺板在24-孔板中。T细胞与BV173细胞的E∶T比例为1∶10。在共培养48小时以后收集上清液，并使用Duel-Set ELISA试剂盒(R&D systems)，一式三份地测定每孔25μl上清液的IL1-α和IL6。
图4表明，当与表达CD19 CAR(GV8)的T细胞+BV173靶细胞一起共培养时，TRAIL抗体处理显著地阻断THP1细胞的IL1α产生。
TRAIL抗体阻断PMA分化的THP1细胞在与CAR-T细胞一起共培养时产生IL1-α
将使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)从单核细胞分离的T细胞，在IL2(30IU)存在下，用CD3抗体(10ng/ml)和CD28抗体(10ng/ml)刺激24小时，然后用以下载体感染：编码靶向CD19的嵌合抗原受体(GV8)并共表达EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的慢病毒载体，或仅编码EGFP的对照载体。将细胞在补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和30IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中繁殖。
将THP1(600万)细胞铺板在6-孔板中，并用50ng/ml PMA处理24小时。次日，将细胞用PBS-EDTA处理以使细胞脱离，进行洗涤以除去PMA，并在有或没有以12ng/ml或20ng/ml的浓度添加的TRAIL抗体MAB375-SP(R&D Systems)的情况下，将洗涤的细胞以1.5x 105个细胞/孔，单独地，或与CD19+Bv173(2.5x105个细胞/孔)和/或T-亲本细胞或表达针对CD19的CAR(GV8)的T-细胞(2.5x104个细胞/孔)一起，铺板在24-孔板中。T细胞与BV173细胞的E∶T比例为1∶10。在共培养48小时以后收集上清液，并使用Duel-Set ELISA试剂盒(R&Dsystems)，一式三份地测定每孔25μl上清液的IL1-α和IL6。
图5表明，TRAIL抗体处理，阻断了PMA分化的THP细胞(mTHP1)、与BV173细胞一起共培养的mTHP1细胞、与T-载体细胞一起共培养的mTHP1细胞以及与CD19-CAR-T细胞+BV173细胞一起共培养的mTHP1细胞的IL1α产生。因而，TRAIL是T细胞诱导的(包括CAR-T细胞诱导的)单核细胞/巨噬细胞产生IL1α的重要介质。由于单核细胞/巨噬细胞谱系细胞的IL1α产生，被认为是与施用过继转移的T细胞(包括CAR-T和TCR-T细胞)有关的细胞因子释放综合征和神经毒性的重要介质，因此这些结果证实，TRAIL抑制剂(例如，TRAIL抗体、DR5-Fc、DR4-Fc、DcR1-Fc、DcR2-Fc、拮抗剂DR5抗体、TRAIL/DR5信号传导的小分子和核酸抑制剂)可以用于预防和治疗与施用过继转移的T细胞有关的CRS和神经毒性。
中和性TRAIL抗体用于预防细胞因子释放综合征和神经毒性的用途
急性淋巴细胞白血病患者接受了CD19-CAR-T细胞产品(5x108CAR+ve CD3细胞/kg)。由于高白血病负担，患者处于发展CRS和神经毒性的高风险中。在施用CAR-T细胞后的第二天，在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量接受预防剂量的针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)。在1周后重复剂量。在一个替代实施例中，多发性骨髓瘤患者接受了BCMA-CAR-T细胞产品(5x108CAR+ve CD3细胞/kg)。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量接受预防剂量的针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)。
中和性TRAIL抗体用于治疗细胞因子释放综合征和神经毒性的用途
急性淋巴细胞白血病患者接受了CD19-CAR-T细胞产品。输注后3天，患者显示出提示细胞因子释放综合征和神经毒性的征象和症状，包括高热、低血压、呼吸窘迫和改变的精神状态。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，给患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，施用针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)。12小时后施用第二剂针对TRAIL的中和抗体。
DR5-Fc用于预防细胞因子释放综合征和神经毒性的用途
急性淋巴细胞白血病患者接受了CD19-CAR-T细胞产品。由于高白血病负担，患者处于发展CRS和神经毒性的高风险中。在施用CAR-T细胞后的第二天，在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，接受预防剂量的临床级DR5-Fc。在1周后重复剂量。在一个替代实施例中，多发性骨髓瘤患者接受了BCMA-CAR-T细胞产品。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，接受预防剂量的针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)。在一个替代实施方案中，替代DR5-Fc或者与DR5-Fc联合，给患者施用其它的TRAIL拮抗剂(例如，DR4-Fc、DcR1-Fc和DcR2-Fc)。
DR5-Fc用于治疗细胞因子释放综合征和神经毒性的用途
急性淋巴细胞白血病患者接受了CD19-CAR-T细胞产品。输注后3天，患者显示出提示细胞因子释放综合征和神经毒性的征象和症状，包括高热、低血压、呼吸窘迫和改变的精神状态。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，给患者通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，施用临床级DR5-Fc。12小时后施用第二剂DR5-Fc。在一个替代实施方案中，替代DR5-Fc或者与DR5-Fc联合，给患者施用其它的TRAIL拮抗剂(例如，DR4-Fc、DcR1-Fc和DcR2-Fc)。
鞘内MAB375-SP用于治疗神经毒性的用途
急性淋巴细胞白血病患者接受了CD22-CAR-T细胞产品。在输注CAR-T细胞后10天，患者显示出提示神经毒性的征象和症状，包括意识错乱、失语症、改变的精神状态和癫痫发作。通过鞘内注射，以20mg的剂量(重新悬浮于2ml生理盐水)，给患者施用针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)。在3天后施用第二剂鞘内MAB375。
鞘内DR5-Fc用于治疗神经毒性的用途
多发性骨髓瘤患者接受了BCMA-CAR-T细胞产品。在输注CAR-T细胞后10天，患者显示出提示神经毒性的征象和症状，包括意识错乱、失语症、改变的精神状态和癫痫发作。通过鞘内注射，以20mg的剂量(重新悬浮于2ml生理盐水)，给患者施用临床级中和性DR5-Fc。在3天后施用第二剂鞘内DR5-Fc。在一个替代实施方案中，替代DR5-Fc或者与DR5-Fc联合，给患者施用其它的TRAIL拮抗剂(例如，DR4-Fc、DcR1-Fc和DcR2-Fc)。
TRAIL拮抗剂在制造细胞疗法产品中的用途
血沉棕黄层细胞得自来自血库的健康的去标识的成年供体，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。在5％CO2保湿培养箱中，在37℃，培养细胞。将细胞在以上培养基中活化1天，然后用编码CAR或TCR(例如，SEQ ID NO：2822-2836)的慢病毒载体感染。感染以后，将细胞沉淀，并以5x105个细胞/ml的浓度，重新悬浮在含有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体、50IU重组人-IL2的新鲜XVIVO培养基中。单独地或以不同的组合加入下述TRAIL拮抗剂：i)50ng/ml的MAB375-SP，ii)50ng/ml的重组DR5-Fc(Sigma-Aldrich；D9563)；iii)50ng/ml的重组DR4-Fc(Sigma-Aldrich；D9438)；iv)50ng/ml的重组人TRAIL R3/TNFRSF10C Fc嵌合体蛋白(R&D Systems)；和v)50ng/ml的DcR2-Fc。在5％CO2保湿培养箱中，在37℃培养细胞。将细胞在以上培养基中培养10-27天，每2-3天更换培养基并添加新鲜TRAIL拮抗剂。在培养基结束时，将T细胞收集，用生理盐水洗涤并重新悬浮于生理盐水中，用于小鼠中的体内研究。当在NSG小鼠的适当模型中试验时，证实了在有TRAIL拮抗剂存在下培养的T细胞具有稳健的抗肿瘤活性和体内长期持久性，该模型由表达被CAR或TCR构建体靶向的抗原的人肿瘤细胞的异种移植物组成。将基本上类似的规程用于制备CAR-T细胞，以用于人临床试验。
TRAIL拮抗剂在T细胞中的表达
血沉棕黄层细胞得自来自血库的健康的去标识的成年供体，并用于通过Ficoll-Hypaque梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC就这样使用，或用于使用CD3磁性微珠(Miltenyi Biotech)并遵循生产商的说明书分离T细胞。将PBMC或分离的T细胞重新悬浮于补充了10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体和100IU重组人-IL2的XVIVO培养基(Lonza)中。在5％CO2保湿培养箱中，在37℃培养细胞。将细胞在以上培养基中活化1天，然后用慢病毒载体感染，该慢病毒载体单独表达编码CAR或TCR盒或共表达TRAIL拮抗剂(例如，DR5-Fc、DR4-Fc、DcR1-Fc、DcR2-Fc和嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白编码细胞外TRAIL结合结构域，其经由跨膜结构域连接至不同的信号传导受体的细胞溶质结构域)。靶向CD19(使用FMC63抗原结合结构域)和NYESO-1/MHC I或II复合物，并共表达TRAIL拮抗剂的示例性表达构建体的SEQ ID NO：提供在表7a中在SEQ ID NO：2853-2863；2865-2875；2877-2887；2889-2899；2901-2911；2913-2923；2925-2935中。感染以后，将细胞沉淀，并以5x105个细胞/ml的浓度重新悬浮在含有10ng/ml CD3抗体、10ng/ml CD28抗体、50IU重组人-IL2的新鲜XVIVO培养基中。将细胞在以上培养基中繁殖14天，然后使用适当的细胞系模型用于体外研究，以确定它们的表型(例如，衰竭和活化标志物的表达)、细胞因子产生(例如，IL1α、IL1β、TNFα、IFNγ和IL6)、增殖潜力、细胞毒性(例如使用Matador测定)。将NALM6和REC-1细胞用作基于FMC63的构建体的靶细胞，而将MEL624细胞系用于靶向NYESO-1/HLA-A2复合物的构建体。使用在免疫缺陷小鼠(例如，NSG小鼠)中表达它们的靶抗原的适当细胞系(例如，NALM6和MEL624)的异种移植物，证实了表达CAR/TCR和共表达TRAIL拮抗剂的T细胞的体内活性。另外，使用Giavridis,T等人(Nat Med.2018Jun；24(6)：731-738.doi：10.1038/s41591-018-0041-7；PMID：29808005)所描述的CRS的SCID-Biege小鼠模型，试验了共表达TRAIL拮抗剂的CAR/TCR对细胞因子释放综合征的发展的影响。最后，将CAR-T和NYESO/HLA-A2 TCR-T细胞产品施用给在临床试验中招募的患者，以试验共表达TRAIL拮抗剂的CAR/TCR产物分别用于治疗CD19+B细胞恶性肿瘤(对于基于FMC63的构建体)和表达NYESO-1/HLA-A2的黑素瘤(对于靶向NYESO-1/HLA-A2的构建体)的安全性和效力。
表达共刺激分子(例如，DcR1、DcR2、CD27、CD28、41BB、OX40和GITR)的T细胞的用途
进行了一项临床试验，以测试表达不同共刺激分子的T细胞，在患癌症的受试者中的安全性和效力。从受试者获得癌组织(例如，肺癌、卵巢癌、结肠癌或淋巴瘤等的活检组织)，然后通过RNA-SEQ和/或微阵列进行基因表达分析，并通过组织化学和/或流式细胞计量术进行蛋白分析，以分析共刺激性受体(例如，DcR1、DcR2、CD27、CD28、41BB、OX40和GITR)的不同配体(例如，TRAIL、CD70、CD80、CD84、41BBL、OX40L和GITRL)的表达。随后，产生CAR-T细胞，其靶向在肿瘤细胞上表达的抗原并共表达共刺激性受体(其配体在癌症组织中表达或过表达)。例如，对于具有过表达TRAIL的、表达CD20的淋巴瘤的患者，制造了还共表达DcR1或DcR2的CD19-CAR-T细胞产品。在另一个示例性实施方案中，对于具有过表达41BBL的、表达间皮素的卵巢癌的患者，产生了共表达41BB的间皮素CAR-T细胞产品。表18提供了一个实施例，其中通过在免疫细胞(例如，T细胞，例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TIL)中表达对应的共刺激性受体，来匹配患病组织(例如，癌细胞或组织)中的不同配体的表达。
表18.
Figure BDA0002987268390001541
Figure BDA0002987268390001551
编码示例性共刺激分子的核酸和多肽的SEQ ID NO：提供在表1中(SEQ ID NO：2250-2259和SEQ ID NO：2360-2368)。其它共刺激分子是本领域已知的，可以用在本公开的替代实施方案中。使用与用于表达CAR/TCR模块相同的载体，或使用单独的载体，在T细胞产品中表达共刺激分子。在某些实施方案中，在T细胞(例如，TIL)中表达共刺激分子，而不共表达CAR或外源TCR。基本上类似的方案用于通过在免疫细胞中异位表达受体，使任何免疫疗法产品(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞)与患病细胞或组织(例如，癌症)匹配，所述受体的配体在患病细胞或组织中表达或过表达。预见到，与对照免疫细胞(例如，没有被基因改造成异位表达或过表达共刺激性受体的免疫细胞)相比，被基因改造成异位表达或过表达一种或多种共刺激性受体的免疫细胞会表现出向患病组织(例如癌症)中的更好浸润和长期持久性。此外，预见到，与对照免疫细胞(例如，没有被基因改造成异位表达或过表达共刺激性受体的免疫细胞)相比，被基因改造成异位表达或过表达一种或多种共刺激性受体(其配体在患病组织/细胞例如癌症或癌细胞中表达或过表达)的免疫细胞会表现出向患病组织(例如癌症)中的更好浸润和长期持久性。
免疫效应细胞疗法与肿瘤内注射K13、NEMO-K277A和IKK2-S177E-S181E组合的用途
通过使用本领域已知方法的电穿孔，使具有表达间皮素的卵巢癌的患者接受哺乳动物表达载体的肿瘤内递送，该哺乳动物表达载体包括编码vFLIP K13、NEMO-K277A和/或IKK2-S177E-S181E的核酸，随后在2天后输注5x108靶向间皮素的CAR-T细胞。证实了vFLIPK13、NEMO-K277A和/或IKK2-S177E-S181E的肿瘤内表达，会刺激免疫细胞向肿瘤中的浸润，包括CAR-T细胞。将基本上类似的规程，用于增强被基因改造成表达NY-ESO-1TCR的免疫效应细胞向肿瘤组织中的浸润。
中和性TRAIL抗体和DR5-Fc用于治疗免疫障碍诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病的用途.
进行了一项临床试验，以在具有免疫障碍诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病的患者中，测试中和性TRAIL抗体(MAB375-SP)或DR5-Fc。试验的合格性标准包括，以上障碍的先前诊断，以及在研究开始时疾病活动性的实验室和临床证据。获得疾病活动性的基线临床和实验室量度标准。患者随机分组以接受安慰剂、MAB375-SP或DR5-Fc。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，每周通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，给随机分配至MAB375-SP或DR5-Fc组的患者施用针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)或DR5-Fc。基于建立的不同疾病活动性的临床和实验室量度标准，在4剂后评价对治疗的应答。
中和性TRAIL抗体和DR5-Fc用于预防免疫障碍诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病的发作的用途.
进行了一项临床试验，以测试临床级中和性TRAIL抗体(MAB375-SP)和DR5-Fc用于预防患免疫障碍诸如类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病的患者中的发作或疾病再活化。试验的合格性标准包括，以上障碍的先前诊断，以及在研究开始时没有进行中的疾病活动性的活跃实验室和/或临床证据。获得疾病活动性的基线临床和实验室量度标准。患者随机分组以接受安慰剂、MAB375-SP或DR5-Fc。在用苯那君(50mg静脉内)和对乙酰氨基酚(750mg口服)预给药后，每周通过静脉内输注，以5mg/kg的剂量，给随机分配至MAB375-SP或DR5-Fc组的患者施用针对TRAIL的临床级中和性抗体(MAB375-SP)或DR5-Fc。基于建立的不同疾病活动性的临床和实验室量度标准，在3和6个月后评价对疾病复发的预防。
在上面的说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用并入本文。在不脱离本公开的范围和精神的情况下，本公开所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已经结合具体优选实施方案描述了本公开，但是应当理解，要求保护的公开内容不应不适当地受限于这样的具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员而言显而易见的、用于实施本公开的所描述的模式的各种修改旨于落入所附权利要求书的范围内。
在本文中引用的每个和每篇专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用整体并入本文。尽管已经参考具体方面公开了发明，显然本领域技术人员可以设计本发明的其它方面和变化，且不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书旨于解释为包括所有这样的方面和等同变化。

Claims (153)

1.一种方法，包括：
使用以下方式处理供体受试者：
(a)CXCR4拮抗剂，
(b)细胞因子，
(c)化学治疗剂，
(d)β2肾上腺素能激动剂，
(e)Src激酶抑制剂，
(f)锻炼，以达到比静止时的心率高至少>25％的心率，或者
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的一个或多个的组合；
从所述供体受试者分离血液；
从所述血液分离免疫效应细胞或其群体；和
任选地用异源多核苷酸转化所述免疫效应细胞或其群体，以表达或过表达内源或外源免疫受体、嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体，其中所述免疫受体、CAR或T细胞受体包含至少一个抗原结合结构域和至少一个跨膜结构域；或者
任选地将所述免疫效应细胞或其群体在培养物中繁殖1～30天的时间段；
将所述免疫效应细胞或其群体施用给有此需要的受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫效应细胞或其群体具有降低的、消除的或改变的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1 HDAC2、JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11、BRAF、CD27、CD28、41BB、DcR1、DcR2、OX40、GITR、BCMA、TRAIL、DR4和/或DR5的表达和/或功能。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合选自由以下项组成的组中的肿瘤抗原：CD5，CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也被称作CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319,和19A24)；C-型凝集素-样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶-样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；在急性白血病或淋巴瘤上表达但不在造血祖细胞上表达的糖基化的CD43表位；在非造血癌症上表达的糖基化的CD43表位；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-llRa)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性的胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20/MS4A1；叶酸盐受体α；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素-样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAlX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β类型，9(LMP2)；糖蛋白100(gpl00)；由裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放读码框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性的1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的己糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替读码框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员lA (XAGEl)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活素；端粒末端转移酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCT A-1或半乳糖凝集素8)；被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MARTI)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)；成对框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 lB 1(CYPlB 1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-样(BORIS或印迹位点调节物兄弟)，被T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TESl)；淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾普遍存在的1(RUl)；肾普遍存在的2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热激蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白-样受体1(LAIRl)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白-样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子-样家族成员f(CD300LF)；C-型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF-样模块的粘蛋白-样激素受体-样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体-样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ-样多肽1(IGLLl)，MPL；生物素；c-MYC表位标签；CD34；LAMP1TROP2；GFRα4；CDH17；CDH6；NYBR1；CDH19；CD200R；Slea(CA19.9；唾液酸基路易斯抗原)岩藻糖基-GM1；PTK7；gpNMB；CDH1-CD324；DLL3；CD276/B7H3；IL11Ra；IL13Ra2；CD179b-IGLl1；ALK TCRγ-δ；NKG2D；CD32(FCGR2A)；CSPG4-HMW-MAA；Tim1-/HVCR1；CSF2RA(GM-CSFR-α)；TGFβR2；VEGFR2/KDR；LewsAg；TCR-β1链；TCR-β2链；TCR-γ链；TCR-δ链；FITC；促黄体激素受体(LHR)；促卵泡激素受体(FSHR)；绒毛膜促性腺激素激素受体(CGHR)；CCR4；SLAMF6；SLAMF4；HIV1包膜糖蛋白；HTLV1-Tax；CMV pp65；EBV-EBNA3c；甲型流感血凝素(HA)；GAD；PDL1；鸟苷酸环化酶C(GCC)；KSHV-K8.1蛋白；KSHV-gH蛋白；针对桥粒核心糖蛋白3(Dsg3)的自身抗体；针对桥粒核心糖蛋白1(Dsg1)的自身抗体；HLA；HLA-A；HLA-A2；HLA-B；HLA-C；HLA-DP；HLA-DM；HLA-DOA；HLA-DOB；HLA-DQ；HLA-DR；HLA-G；IGE；CD99；RAS G12V；组织因子1(TF1)；AFP；GPRC5D；密封蛋白18.2(CLD18A2或CLDN18A.2))；P-糖蛋白；STEAP1；LIV1；连接素-4；CRIPTO；MPL；GPA33；BST1/CD157；低电导氯离子通道；整联蛋白B7；Muc17；C16ORF54；VISTA；Muc5Ac；FCRH5；CLDN6；MMP16，UPK1B；BMPR1B；Ly6E，WISP1和SLC34A2。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD19。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD20。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是CD22。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是BCMA。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是MPL。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抗原是细胞内抗原，诸如NY-ESO-1、AFP、WT1、MAGE-1和突变体Ras。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞经基因改造，以表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达和/或功能被减少或消除，且JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的表达和功能被增强。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞或其群体表达CAR、下一代CAR或TCR。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞是能产生免疫效应细胞的干细胞。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞是经动员的细胞。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述CXCR4拮抗剂选自由普乐沙福、BL-80400、G-CSF、GM-CSF和src抑制剂组成的组。
17.一种通过权利要求1所述的方法得到的细胞或细胞群体。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
19.一种治疗受试者的方法，所述方法包括，给所述受试者施用有效量的根据权利要求17所述的细胞或细胞群体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包括，给所述受试者施用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂。
21.一种用于治疗有此需要的受试者的免疫效应细胞疗法，所述方法包括给所述受试者施用根据权利要求17所述的细胞或细胞群体，以及BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂。
22.根据权利要求21所述的免疫效应细胞疗法，其中在施用所述细胞或细胞群体之前，所述受试者接受BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂的预治疗。
23.根据权利要求21所述的免疫效应细胞疗法，其中所述受试者接受BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂，与所述细胞或细胞群体的同时治疗。
24.根据权利要求21所述的免疫效应细胞疗法，其中在施用所述细胞或细胞群体后，所述受试者接受用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂的治疗。
25.根据权利要求21～34中的任一项所述的免疫效应细胞疗法，其中所述受试者具有与肿瘤抗原表达有关的疾病、癌变前病症、癌症和与肿瘤抗原表达有关的非癌症相关适应症。
26.根据权利要求25所述的免疫效应细胞疗法，其中所述癌症是选自以下一种或多种的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、B-细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T-细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞-或大细胞-滤泡淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞赘生物、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期。
27.根据权利要求25所述的免疫效应细胞疗法，其中所述癌症选自由结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食管癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈的癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期的实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管的癌症、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶组成的组。
28.一种治疗受试者的方法，所述方法包括，在接受包含根据权利要求17所述的细胞或细胞群体的过继性细胞疗法之前、同时或之后，用BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tetl、Tet2、Tet3)、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂治疗受试者。
29.一种制造免疫效应细胞疗法产品的方法，所述方法包括将编码CAR/TCR的多核苷酸引入免疫效应细胞，使得所述多核苷酸整合进所述免疫效应细胞的基因组中的，BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其内含子或外显子内，其中表达和/或功能被减少或消除。
30.一种制造免疫效应细胞疗法产品的方法，所述方法包括使所述免疫效应细胞离体与BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂接触。
31.根据权利要求28、29或30中的任一项所述的方法，其中所述抑制剂是BRD9抑制剂。
32.一种包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码CAR/TCR且编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂。
33.根据权利要求32所述的载体，其中所述BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂是：(1)基因编辑系统，其靶向编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5或它的对应调节元件的基因/RNA内的一个或多个位点；(2)siRNA或shRNA，其抑制BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的表达；(3)BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的蛋白抑制剂；或，(4)BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5的结合配偶体；和，(5)编码(1)～(3)中的任一种的核酸，或它们的组合。
34.根据权利要求32或33所述的载体，其中编码CAR/TCR的多核苷酸与编码BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂的多核苷酸被2A编码序列隔开。
35.一种基因编辑系统，其对BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5基因或其调节元件(例如，BRD9基因或其调节元件)的序列具有特异性。
36.根据权利要求35所述的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统对BRD9基因的序列具有特异性。
37.根据权利要求35或36所述的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统是：(1)CRISPR/Cas基因编辑系统，和/或(2)锌指核酸酶系统、TALEN系统和大范围核酸酶系统。
38.根据权利要求37所述的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统是CRISPR/Cas基因编辑系统。
39.根据权利要求38所述的基因编辑系统，包含：
包含对BRD9基因或其调节元件的序列具有特异性的靶向序列的gRNA分子，和Cas9蛋白；
包含对BRD9基因或其调节元件的序列具有特异性的靶向序列的gRNA分子，和编码Cas9蛋白的核酸；
编码包含对BRD9基因或其调节元件的序列具有特异性的靶向序列的gRNA分子的核酸，和Cas9蛋白；或者
编码包含对BRD9基因或其调节元件的序列具有特异性的靶向序列的gRNA分子的核酸，和编码Cas9蛋白的核酸。
40.根据权利要求35～39中的任一项所述的基因编辑系统，进一步包含模板DNA。
41.根据权利要求40所述的基因编辑系统，其中所述模板DNA包含编码CAR/TCR的核酸序列。
42.一种离体制备用于过继免疫疗法的免疫效应T细胞的组合物，所述组合物包含BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂选自表6所示的化合物。
44.一种细胞群体，包含与其中细胞中的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5抑制剂的表达和/或功能已经被减少、消除或改变的细胞群体相比，更高百分比的具有CD45RA+CD62L+CCR7+T细胞表型的Tscm细胞。
45.一种改善用于过继性细胞疗法的免疫效应细胞的治疗效果的方法，所述方法包括增加所述细胞中JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF中的一种或多种的活性。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过在所述细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的突变体，JAK1的突变体，JAK3-M511I，来增加所述免疫效应细胞的治疗效果。
47.根据权利要求45所述的方法，其中通过在所述细胞中表达JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体，在表1中列出的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体，来增加所述免疫效应细胞的治疗效果。
48.根据权利要求46和47所述的方法，其中所述方法包括，使所述免疫效应细胞，与编码在表1中列出的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体的核酸接触。
49.根据权利要求45～48中的任一项所述的方法，其中通过降低所述细胞中的BRD9、EZH2、MLL2、MLL3、MLL4、甲基胞嘧啶双加氧酶基因、ATM、CHEK、FBXW10、BCOR、FAT1、ASXL1、PHF6、SF3B1、YY1、CBFb、Runx1、EHMT2(G9A)、SMARCA4、CREBBP、PRDM1/BLIMP1、HDAC2、TRAIL和/或DR5中的一种或多种的活性，来进一步改善所述免疫效应细胞的治疗效率。
50.一种治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用权利要求45～49中的任一项所述的细胞。
51.一种制造免疫效应细胞的方法，所述方法包括，引入一种或多种编码在表1中列出的JAK1、JAK3、STAT5b、STAT3、IL2RG、CARD11和/或BRAF的组成活性突变体的多核苷酸。
52.一种制造免疫效应细胞的方法，所述方法包括，在抗原呈递细胞或抗原呈递底物的存在下，将所述细胞暴露于双特异性的或多特异性的衔接物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含：能够衔接所述免疫效应细胞的至少一个抗原结合结构域，和能够衔接抗原呈递细胞(APC)或抗原呈递底物(APS)的至少一个抗原结合结构域。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述APC是造血细胞。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述APC是B细胞谱系细胞。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述APC或所述APS包含CD19抗原。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述APC选自由REC-1、JEKO-1、MINO、GRANTA-519、NALM6和RAJI细胞组成的组。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述APC源自B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的细胞。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物是双特异性抗体。
60.根据权利要求52所述的方法，其中所述方法进一步包括，将所述免疫效应细胞暴露于活化免疫细胞上的共刺激性受体的激动剂。
61.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化T细胞的T细胞受体(TCR)复合物的至少一个结合结构域。
62.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化TCR复合物的CD3亚基的至少一个结合结构域。
63.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化T细胞上提供共刺激的受体的至少一个结合结构域。
64.根据权利要求63所述的方法，其中被所述双特异性的或多特异性的衔接物结合的受体选自由CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40组成的组。
65.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物在APC或APS的存在下，通过TCR复合物活化信号传导。
66.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物在APC或APS的存在下，经由通过共刺激性受体的信号传导而活化T细胞。
67.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合造血细胞的至少一个结合结构域。
68.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合未成熟的B细胞、成熟的B细胞和浆细胞，和/或它们的组合的至少一个结合结构域。
69.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合在B-淋巴样谱系造血细胞上表达的抗原的至少一个结合结构域，所述抗原选自由CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和FCRH5组成的组。
70.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3复合物，且至少一个其它抗原结合结构域结合CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2或FCRH5。
71.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个其它抗原结合结构域结合CD19。
72.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物是兰妥莫单抗。
73.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物是CD19 x CD3 DART。
74.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物由SEQ ID NO:2646至SEQID NO：2652表示。
75.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个其它抗原结合结构域结合CD22。
76.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物由SEQ ID NO:2663至SEQID NO:2668表示。
77.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3e(或CD3ε)，且至少一个其它抗原结合结构域结合CD20/MS4A1。
78.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物由SEQ ID NO:2657至SEQID NO：2662表示。
79.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3复合物，例如，CD3e(或CD3ε)，且至少一个其它抗原结合结构域结合BCMA。
80.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物是BI 836909(AMG 420)。
81.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的衔接物由SEQ ID NO:2653至SEQID NO：2656表示。
82.根据权利要求53所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3复合物，且至少一个其它抗原结合结构域结合CS1/SLAMF7。
83.根据权利要求52所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合T细胞上的活化受体和/或共刺激性受体的至少一个结合结构域，和能够结合非造血细胞或细胞系的至少一个结合结构域。
84.一种繁殖和/或活化免疫效应细胞的方法，所述方法包括给受试者施用双特异性的或多特异性的T细胞衔接物。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物含有，能够衔接免疫细胞的至少一个抗原结合结构域，和能够衔接抗原呈递细胞(APC)的至少一个抗原结合结构域。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述APC是造血细胞。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述APC是B细胞谱系细胞。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述APC表达CD19抗原。
89.根据权利要求84～88中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的衔接物是双特异性抗体。
90.根据权利要求84～89中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，给受试者施用活化免疫细胞上的共刺激性受体的激动剂或配体。
91.根据84～90所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化T细胞的T细胞受体(TCR)复合物的至少一个结合结构域。
92.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化TCR复合物的CD3亚基(例如，TCR复合物的CD3-ε亚基)的至少一个结合结构域。
93.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合和活化T细胞上提供共刺激的受体的至少一个结合结构域。
94.根据权利要求93所述的方法，其中被所述双特异性的或多特异性的衔接物结合的共刺激性受体，选自由CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40组成的组。
95.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物通过TCR复合物活化信号传导。
96.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物，经由通过共刺激性受体的信号传导，来活化T细胞。
97.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合造血细胞的至少一个结合结构域。
98.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物包含，能够结合未成熟的B细胞、成熟的B细胞和浆细胞，和/或它们的组合的至少一个结合结构域。
99.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物，包含能够结合在B-淋巴样谱系造血细胞上表达的抗原的至少一个结合结构域，该抗原选自由CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和FCRH5组成的组。
100.根据权利要求84～91中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物的至少一个结合结构域结合CD3复合物，且至少一个其它抗原结合结构域结合选自由CD19、CD20/MS4A1、CD22、CD23、BCMA、CS1/SLAMF7、CD30、CD32b、CD70、CD79b、CD123、CD33、CD138、CD179b、GPRC5D、Lym1、Lym2和FCRH5组成的组中的成员。
101.一种方法，所述方法通过干扰或阻断TRAIL/TNFSF10的活性，来预防或治疗免疫效应细胞的毒性。
102.根据权利要求101所述的方法，其中通过给接受免疫效应细胞的受试者施用TRAIL/TNFSF10拮抗剂，来干扰或阻断TRAIL的活性。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是抗体、抗体片段、小分子、肽或核酸。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是结合TRAIL(TNFSF10)或其受体，死亡受体5(DR5或TNFRSF10B)或死亡受体4(DR4或TNFRSF10A)的药剂。
105.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂包含以下物质中的一种或多种：抗体、抗体片段或非免疫球蛋白抗原结合支架，诸如DARPIN、艾菲体、艾菲啉、艾德结合素、艾菲廷、欧体、重复体、菲诺梅尔、α体、艾维梅尔、艾崔梅尔、森特仁、前结合素、抗运载蛋白、库尼兹结构域、犰狳重复蛋白或其片段。
106.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是可溶性TRAIL受体。
107.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是靶向TRAIL或其受体DR5和DR4的RNAi核酸。
108.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是小分子化合物，该小分子化合物干扰通过TRAIL与其受体DR5或DR4的结合而被活化的信号转导通路。
109.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是改变TRAIL或其受体的表达的试剂。
110.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂是下调TRAIL或其受体DR5和/或DR4的表达的试剂。
111.根据权利要求102～104中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂在转录、转录后、翻译或翻译后水平上，干扰TRAIL、DR5和/或DR4的表达。
112.根据权利要求102所述的方法，其中在细胞疗法产品的制造中，包括所述TRAIL拮抗剂。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述细胞疗法产品在施用给受试者之前，暴露于TRAIL拮抗剂。
114.根据权利要求112所述的方法，其中将所述TRAIL拮抗剂掺入所述细胞疗法产品中。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述细胞疗法产品经遗传基因改造，以表达：a)可溶性TRAIL受体；b)靶向TRAIL、DR5和/或DR5的scFV；c)靶向TRAIL、DR5或DR4的shRNA；d)靶向TRAIL、DR5或DR4的gRNA；e)异位过表达DcR1或DcR2；f)异位过表达DR5或DR4的显性负性突变体；或g)异位过表达融合蛋白，该融合蛋白含有与CD27、CD28、41BB、OX40、GITR或BCMA的跨膜和细胞溶质结构域融合的细胞外TRAIL-结合结构域。
116.根据权利要求114所述的方法，其中在施用细胞疗法产品之前、同时或之后，将所述TRAIL拮抗剂施用给受试者。
117.根据权利要求114所述的方法，其中施用所述TRAIL拮抗剂，以预防所述细胞疗法产品的毒性。
118.一种治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用TRAIL拮抗剂：
i)以在出现细胞疗法产品的毒性的早期征象时，先发制人；
ii)在出现细胞疗法产品的毒性的征象和症状以后；
iii)以治疗细胞疗法产品的毒性的征象和症状；
iv)以改善细胞疗法产品的效力、存活、增殖和繁殖，以预防衰竭，以改善它们在体内的长期持久性和抗肿瘤活性；和
v)以实现i)、ii)、iii)和iv)的组合。
119.一种改善在过继性细胞疗法中使用的免疫效应细胞的治疗效果的方法，所述方法包括：
i)将编码NF-κB活化剂的核酸，施用进疾病部位；
ii)施用免疫效应细胞。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述NF-κB活化剂编码vFLIP K13的野生型或变体形式、人NEMO-K277A突变体、IKK2-S177E-S181E，或以上试剂的组合。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述编码NF-κB活化剂的核酸是RNA或DNA。
122.根据权利要求119所述的方法，其中使用病毒载体、电穿孔，将所述编码NF-κB活化剂的核酸递送进疾病部位。
123.根据权利要求119所述的方法，其中在施用免疫效应细胞之前、之后或同时，递送所述编码NF-κB活化剂的核酸。
124.一种活化和/或繁殖细胞疗法产品的方法，所述方法在REC-1细胞的存在下，通过使细胞疗法产品与双特异性的或多特异性的衔接物接触，来活化和/或繁殖细胞疗法产品。
125.一种制造细胞疗法产品的方法，所述方法在REC-1细胞的存在下，通过使细胞疗法产品与双特异性的或多特异性的衔接物接触，来制造细胞疗法产品。
126.根据权利要求124或125所述的方法，其中所述双特异性的衔接物具有能够结合淋巴样谱系抗原的至少一个抗原结合结构域。
127.根据权利要求124～126中的任一项所述的方法，其中所述淋巴样谱系抗原是CD19、CD20、CD22和BCMA中的一种或多种。
128.根据权利要求124～127中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物结合和/或活化T细胞受体复合物。
129.根据权利要求124～128中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物是CD19 x CD3、CD20 x CD3、CD22 x CD3或BCMA x CD3双特异性的T细胞衔接物或DART。
130.根据权利要求124～129中的任一项所述的方法，其中所述双特异性的或多特异性的衔接物是兰妥莫单抗。
131.根据权利要求124～129中的任一项所述的方法，其中所述细胞疗法产品是T细胞疗法产品。
132.根据权利要求124～130中的任一项所述的方法，其中所述T细胞疗法产品是CAR-T细胞、TCR-T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)产品。
133.根据权利要求124～131中的任一项所述的方法，其中在双特异性的衔接物存在下，将所述细胞疗法产品暴露于REC-1细胞至少6小时。
134.一种预防和/或治疗免疫障碍的方法，所述方法包括给受试者施用TRAIL拮抗剂的步骤。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述免疫障碍的特征在于巨噬细胞和单核细胞的活化。
136.根据权利要求134或135所述的方法，其中所述免疫障碍是类风湿性关节炎、全身发作的青少年特发性关节炎、斯蒂尔病、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病和炎性肠病中的一种或多种。
137.根据权利要求134～136中的任一项所述的方法，其中所述免疫障碍的特征在于IL1Ra的活化。
138.根据权利要求134～137中的任一项所述的方法，其中所述TRAIL拮抗剂选自
viii)针对TRAIL的中和抗体；
ix)针对DR5的拮抗抗体(TRAIL-R2)；
x)DR5的竞争性拮抗剂(例如，DR5-Fc)；
xi)能够结合TRAIL并竞争其与DR5结合的蛋白；
xii)TRAIL和/或DR5的核酸抑制剂；和/或
xiii)TRAIL和/或DR5的小分子抑制剂。
139.一种繁殖和/或活化免疫细胞疗法产品的方法，所述方法通过与套细胞淋巴瘤衍生的细胞或细胞系一起共培养，来繁殖和/或活化免疫细胞疗法产品。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述免疫细胞疗法产品表达受体，该受体靶向在B谱系和浆细胞谱系细胞上表达的抗原。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述免疫细胞疗法产品表达受体，该受体靶向选自CD19、CD20、CD22和BCMA中的一种或多种的抗原。
142.根据权利要求139～141中的任一项所述的方法，其中所述套细胞淋巴瘤细胞系选自REC-1、JEKO-1、MINO和GRANTA-519中的一种或多种。
143.根据权利要求139～142中的任一项所述的方法，其中所述套细胞淋巴瘤细胞系是REC-1。
144.根据权利要求139～143中的任一项所述的方法，其中在与免疫细胞一起共培养之前，使所述套细胞淋巴瘤细胞或细胞系不能复制。
145.一种用免疫细胞疗法治疗或预防受试者中的疾病的方法，所述方法包括：
i)检查在造成疾病的或与疾病相关的细胞(例如，癌细胞或基质细胞)中，共刺激性受体的配体的表达；
ii)鉴定在造成疾病的或与疾病相关的细胞、癌细胞或基质细胞中表达的，共刺激性受体的配体；
iii)增强免疫细胞中的一种或多种共刺激性受体的表达，该一种或多种共刺激性受体的配体在造成疾病的或与疾病相关的细胞中表达；和
iv)给所述受试者施用来自(iii)的免疫细胞。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述配体由以下项中的一种或多种组成，但不限于：TRAIL、CD70、CD80、CD86、41BBL、OX40L、GITRL和BCMA配体。
147.根据权利要求145所述的方法，其中所述共刺激性受体由以下项中的一种或多种组成，或包含以下项中的一种或多种，但不限于：含有DcR1、DcR2、DR4、DR5、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA的细胞外配体结合结构域的受体。
148.根据权利要求145所述的方法，其中所述共刺激性受体由以下项中的一种或多种组成，或包含以下项中的一种或多种，但不限于：DcR1、DcR2、CD27、CD28、41BB、OX40、GITR和BCMA。
149.根据权利要求1所述的方法，其中所述CXCR4拮抗剂是普乐沙福或BL-8040。
150.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子是G-CSF、GM-CSF或培非格司亭。
151.根据权利要求1所述的方法，其中Src抑制剂是达沙替尼。
152.根据权利要求1所述的方法，其中分离出血液的所述受试者是健康的。
153.根据权利要求1所述的方法，其中分离出血液的所述受试者患有疾病。
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