CN116789859A - 一种用于评价bcma靶向car-t细胞药效的靶细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评价BCMA靶向CAR‑T细胞药效的靶细胞及其应用。本发明提供了一种BCMA融合蛋白，编码该BCMA融合蛋白的多核苷酸、一种含BCMA融合蛋白的靶细胞以及所述靶细胞在BCMA‑CAR‑T细胞体外药效评价中的应用。本发明构建的BCMA融合蛋白可以在悬浮细胞和贴壁细胞中稳定高水平表达，受γ‑分泌酶干扰较小；且所述靶细胞可作为工具细胞用于RTCA评估BCMA‑CAR‑T细胞的杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于评价BCMA靶向CAR-T细胞药效的靶细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)治疗技术通过将CAR基因在体外导入并稳定整合到患者来源T淋巴细胞基因组中，联合单链抗体的靶向作用和T淋巴细胞的效应功能，以非MHC限制性方式高特异性识别细胞表面靶抗原从而杀伤靶细胞。CAR基因通常编码一个用于结合靶抗原的单链抗体可变区片段、跨膜结构域和胞内信号结构域(如CD3ζ胞内结构域等)。因此，CAR-T治疗技术的基本原理是依赖抗体与靶细胞膜表面的抗原表位靶点进行特异性结合，激活T细胞的细胞杀伤能力从而清除靶细胞。针对不同靶点的CAR已经被开发，截至目前已有超过250项的CAR-T治疗恶性肿瘤临床试验在全球范围开展。靶向BCMA的CAR-T技术治疗多发性骨髓瘤的基础研究与临床试验已取得里程碑式突破。CAR-T治疗其他肿瘤也显示了良好的应用前景。
CAR-T细胞治疗产品的复杂性和特殊性常使该类产品在非临床研究和临床研究之间存在较大的种群和个体差异，非临床研究阶段甚至可能没有合适的体外疾病模型进行药效学评价，因此在早期临床试验阶段初步评估CAR-T细胞的有效性是十分必要的。常规的杀伤实验靶细胞，多采用人类永生化细胞或者肿瘤细胞，如K562细胞、293T细胞等。由于这些细胞是人类的永生化细胞，会有很多除了靶抗原蛋白以外的突变蛋白表达到细胞表面，或者被HLA分子递呈到细胞表面，这就导致效应细胞对靶细胞进行杀伤时，除了针对靶抗原的特异性杀伤以外，还有对其他蛋白的非特异性杀伤，杀伤背景高，当效应细胞中特异性T细胞CAR-T细胞比例较低时，就会出现假阴性结果。另外，常规的靶细胞还存在对杀伤信号不敏感，自身增殖速度过快，无法进行长时间杀伤实验等问题。
细胞表面蛋白B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)近年来成为治疗多发性骨髓瘤最有希望的靶点。而BCMA-CAR-T细胞进行功能验证的时候需要BCMA高表达的靶细胞。但目前存在两个主要问题：一是BCMA高表达的细胞多为悬浮细胞，不能用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time CelI AnaIysis)的方法检测其杀伤活性；二是BCMA受到γ-分泌酶的切割，在细胞膜上的表达不稳定。因此，针对BCMA-CAR-T细胞免疫治疗的临床前体外药效学研究开发一种合适的靶细胞是十分重要的。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够在多种细胞膜表面稳定表达的BCMA融合蛋白和一种用于评价BCMA-CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白包括BCMA跨膜区、BCMA胞外段和/或BCMA胞内段。
进一步，所述BCMA跨膜区包括以下分子的跨膜区：T细胞受体α链、β链或ζ链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD34、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40，CD137、ICOS、CD152、CD154、IgG1、IgG4、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1、GITR中的一种或多种。
进一步，所述BCMA跨膜区为CD8α跨膜区。
进一步，所述BCMA跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述BCMA胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述BCMA胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述融合蛋白的结构依次由BCMA胞外段、BCMA跨膜区和BCMA胞内段组成。
进一步，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、3、5依次连接所构成的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述的融合蛋白的多核苷酸。
进一步，所述BCMA胞外段的编码核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
进一步，所述BCMA胞外段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述BCMA跨膜区的核苷酸序列与SEQ ID NO.4所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
进一步，所述BCMA跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述BCMA胞内段的核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
进一步，所述BCMA胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述多核苷酸为SEQ ID NO.2、4、6依次连接所构成的DNA序列。
本发明第三方面提供了一种包括或表达本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的多核苷酸的载体。
进一步，所述载体包括克隆载体或表达载体。
进一步，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明第四方面提供了一种靶细胞，所述靶细胞包括或表达本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体中的一种或多种。
进一步，所述靶细胞还包括可检测标记的核苷酸片段。
进一步，所述可检测标记包括Luciferase、GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种。
进一步，所述可检测标记为Luciferase。
进一步，所述靶细胞包括贴壁细胞、悬浮细胞。
进一步，所述靶细胞包括CHO、SKOV3、K562或U266。
进一步，所述靶细胞受γ分泌酶干扰较小。
进一步，所述靶细胞能够诱导免疫细胞产生TCR信号。
进一步，所述免疫细胞包括T细胞。
进一步，所述T细胞包括原初T细胞或Jurkat细胞。
进一步，所述免疫细胞为Jurkat细胞。
本发明第五方面提供了一种制备本发明第四方面所述的靶细胞的方法，所述方法包括：将本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体引入靶细胞。
本发明第六方面提供了本发明第四方面所述的靶细胞或根据本发明第五方面所述的方法制备得到的靶细胞在制备评价靶向BCMA的细胞药效的产品中的应用。
进一步，所述产品为检验靶向BCMA的细胞识别、杀伤效果的产品。
进一步，所述靶向BCMA的细胞包括BCMA-CAR-T细胞、BCMA-CAR-NK细胞或BCMA-CAR-NKT细胞。
进一步，所述靶向BCMA的细胞为BCMA-CAR-T细胞。
本发明第七方面提供了一种体外评价靶向BCMA的细胞药效的方法，所述方法包括步骤1)：将本发明第四方面所述的靶细胞或根据本发明第五方面所述的方法制备得到的靶细胞与靶向BCMA的细胞共培养。
进一步，所述共培养的方法包括先将所述靶细胞接种到细胞培养器材中，随后向细胞培养器材中加入靶向BCMA的细胞；或先将靶向BCMA的细胞加入到培养器材中，随后向细胞培养器材中加入所述靶细胞；或将所述靶细胞和靶向BCMA的细胞同时加入到培养器材中。
进一步，所述共培养的方法为先将所述靶细胞接种到细胞培养器材中，随后向细胞培养器材中加入靶向BCMA的细胞。
进一步，所述培养器材包括培养板、培养瓶或培养皿。
进一步，所述培养器材为培养板。
进一步，靶向BCMA的细胞与靶细胞的效靶比选自1:1～20:1。
进一步，所述效靶比选自2:1～15:1。
进一步，所述效靶比为3:1、5:1、10:1。
进一步，所述方法还包括步骤2)：共培养完成后，检测靶向BCMA的细胞对靶细胞的识别、杀伤效果。
进一步，所述检测的方法包括使用RTCA检测或流式细胞检测。
进一步，所述靶向BCMA的细胞包括BCMA-CAR-T细胞、BCMA-CAR-NK细胞或BCMA-CAR-NKT细胞。
进一步，所述靶向BCMA的细胞为BCMA-CAR-T细胞。
本发明第八方面提供了本发明第四方面所述的靶细胞或根据本发明第五方面所述的方法制备得到的靶细胞在体外评价靶向BCMA表达检测产品或方法中的应用。
本发明第九方面提供了本发明第四方面所述的靶细胞或根据本发明第五方面所述的方法制备得到的靶细胞在构建与BCMA相关的疾病模型中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明构建的BCMA融合蛋白可以在多种细胞(包括悬浮细胞和贴壁细胞)上稳定高水平表达，且受γ-分泌酶干扰较小。而且，过表达BCMA-CD8α-TM的靶细胞可以激活效应细胞，并被BCMA-CAR-T识别、杀伤，成功应用于评价BCMA-CAR-T细胞的药效。
附图说明
图1为BCMA-CD28TM、BCMA-CD8αTM和BCMA(N81S)的结构模式图，其中1A是BCMA-CD28TM的结构模式图，1B是BCMA-CD8αTM的结构模式图，1C是BCMA(N81S)的结构模式图；
图2为流式细胞检测表达BCMA-CD28TM、BCMA-CD8αTM或BCMA(N81S)的CHO细胞膜表面的BCMA平均荧光强度的直方图；
图3为荧光素酶实验检测过表达BCMA-CD28TM-luc和BCMA-CD8αTM-luc的CHO细胞的生物荧光值的结果统计图；
图4为RTCA监测CAR-T细胞对过表达BCMA-CD8αTM的CHO细胞的杀伤活性的结果图；
图5为流式细胞检测表达BCMA-CD28TM、BCMA-CD8αTM或BCMA(N81S)的SKOV3细胞和K562细胞膜表面的BCMA平均荧光强度的直方图；
图6为RTCA监测CAR-T细胞对过表达BCMA-CD8αTM的SKOV3细胞的杀伤活性的结果图；
图7为荧光素酶实验检测CAR-T细胞对过表达BCMA-CD8αTM的K562细胞的杀伤活性的结果图；
图8为流式细胞检测表达BCMA-CD8αTM的U266细胞膜表面的BCMA表达水平的效果图，其中8A是流式细胞检测BCMA平均荧光强度的直方图，8B是流式细胞检测BCMA表达水平的散点图；
图9为流式细胞检测BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞TCR信号的效果图。注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，研发了一种BCMA融合蛋白，并构建了能够稳定表达BCMA的靶细胞(CHO细胞)，通过RTCA仪器实时监测贴壁细胞信号，证明了所述靶细胞可作为工具细胞用于RTCA评估BCMA-CAR-T杀伤活性。本发明根据所述的BCMA融合蛋白还构建了能够稳定表达BCMA的SKOV3细胞、K562细胞和U266细胞，证明了所述的BCMA融合蛋白(BCMA-CD8αTM)可用于构建BCMA靶细胞的普适性。
在本发明中，术语“融合蛋白”是指具有来自或源自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或多肽。融合蛋白还可以包括来自或源自分离的蛋白质的氨基酸部分之间的连接区或氨基酸接头。融合蛋白还指具有来自或衍生自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的分子，所述蛋白质非共价结合或通过化学交联剂连接(例如，共价连接)，带有或不带有间隔区。融合蛋白可以是多肽构建体。
在本发明中，术语“分离”或“分离的”可以指已经从天然伴随它的组分(例如，蛋白质或其他天然存在的生物或有机分子)中分离或纯化的多肽，所述组分包括但不限于表达蛋白质的原核生物中的蛋白质、脂质和核苷酸。通常，当多肽构成按重量计至少60(例如，至少65、70、75、80、85、90、92、95、97或99)％的样品中的总蛋白质时，其是纯化或分离的。本发明描述的融合蛋白可以以多种方式分离或纯化，这取决于样品中存在哪些其他组分。标准纯化方法包括电泳、分子、免疫学和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和力和反相HPLC色谱。例如，可以使用标准抗融合蛋白抗体亲和柱纯化融合蛋白。超滤和渗滤技术结合蛋白质浓缩，也是有用的。所需的纯化程度取决于所需的用途而变化。在一些情况下不需要对其表达的多肽进行纯化。
在本发明中，术语“跨膜区”(简称TM)可以与术语“跨膜结构域”(简称跨膜域)互换使用，指的是锚定在细胞膜内具有热力学稳定的蛋白质结构区域。跨膜区可以从天然蛋白质中获得，包括但不限于TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRζ、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD16、CD22、CD33、CD34、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD8α、CD9、CD28、IgG1、IgG4、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1、GITR、DAP10、DNAM1、ICOS、CD134(或称为OX40、ACT45、TNFRSF4)、CD137(或称为4-1BB)、CD152、CD154等分子，优选为CD8α，如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
在本发明中，术语“胞外区”或“胞外段”是指膜蛋白位于细胞外的区段，如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
在本发明中，术语“胞内区”或“胞内段”是指膜蛋白位于细胞内的区段，如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列。
在本发明中，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
在本发明中，术语“多核苷酸”或“核苷酸”是指任一长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基和/或它们的类似物。因此，例如，如本发明定义的多核苷酸包括(但不限于)单股和双股DNA、包括单股区和双股区的DNA、单股和双股RNA以及包括单股区和双股区的RNA、包含可为单股或更通常双股或包括单股区和双股区的DNA和RNA的杂合分子。另外，如本发明所用术语“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三股区。这类区中的股可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包括所述分子中一种或多种的全部，但更通常仅包括一些分子的区。三螺旋区的分子中的一种是寡核苷酸。术语“多核苷酸”和“核苷酸”具体地说包括mRNA和cDNA。
多核苷酸可包含修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰可在聚合物装配之前或之后赋予。核苷酸的序列可含有非核苷酸组分。多核苷酸可在合成后通过例如与标签偶联进一步进行修饰。其它类型的修饰包括例如“加帽”，即用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如，膦酸甲基酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰、含有悬垂部分(例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)的那些修饰、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些修饰、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些修饰、含有烷基化物的那些修饰、具有修饰键(例如，α变旋异构核酸)的那些修饰，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基可例如由膦酸酯基团、磷酸基团置换，所述膦酸酯基团、磷酸基团由标准保护基团保护，或进行活化以制备与额外核苷酸的额外键联，或可偶联至固体或半固体支持物。5’和3’末端OH可经磷酸化或经胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可以衍生化成标准保护基团。多核苷酸还可以含有业内通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-变旋异构糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环类似物和非碱性核苷类似物(例如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可被替代键联基团置换。这些替代键联基团包括(但不限于)如下实施例：其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、“(O)NR2(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)置换，其中R或R’各自独立地为H或任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的经取代或未取代的烷基(1-20个C)。并非多核苷酸中的所有键联皆需要相同。前述说明适于本发明中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
在本发明中，术语“编码”是指多核苷酸(例如基因，cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的性质，以用作合成其他大分子(例如确定的氨基酸序列)的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
在本发明中，术语“同一性”或“同源性”是指当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中的每个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在所述位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列享有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当比对两个序列时进行比较，以得到最大同源性。
在本发明中，术语“载体”，指的是能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸输送到靶细胞中并任选表达的构建体。载体的示例包括，但不限于：DNA载体、RNA载体，质粒，转座子载体、CRISPR/Cas9载体、噬菌体载体或病毒载体。所述载体可以是克隆载体或表达载体。如在此所使用的术语“克隆载体”，指的是适合增殖的载体，以在适合载体纯化的不同的异源生物体中获得大量的多核苷酸或基因构建体或表达载体。如在此所使用的术语“表达载体”，指的是适合在靶标细胞中表达多核苷酸的载体。本发明的表达载体是慢病毒载体。如在此所使用的术语“慢病毒载体”，指的是包括必需序列的核苷酸序列，这样在细胞中转录和翻译所述序列以及表达慢病毒基因gag、pol、rev和编码包膜病毒蛋白的基因之后，产生有感染新细胞的能力的病毒颗粒。
在本发明中，术语“靶细胞”涵盖所有生物实体/囊泡，其中膜(也可以是脂质双层)将内部与外部环境(环境)分离，并且在生物实体/囊泡的表面上包含一种或多种类型的特异性受体分子。因此，靶细胞/生物实体/囊泡或靶细胞群被在其表面上存在至少一个常见特异性受体分子定义。
靶细胞或靶细胞群从样品中分离，所述样品例如可包含各种不同的细胞或细胞群。含有至少一个特定受体分子的几乎任何靶细胞均可以与包含在样品中的其他组分相分离。为了使本发明描述的方法达到如下所述的亲合效果，受体分子通常以两个或更多个拷贝存在于靶细胞表面上。
在一些实施例中，靶细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。在一些实施例中细胞可以是古菌。在一些实施例中细胞可以是病毒或细胞器，如线粒体、叶绿体、微粒体、溶酶体、高尔基体或细胞核。在一些实施例中，细胞可以是真核细胞，如植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、原生动物或动物细胞。在一些实施例中靶细胞包括细胞核。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于从人、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、猫、狗、狐猴、山羊、猪、马、恒河猴、猕猴或黑猩猩中获得的细胞。哺乳动物细胞的例子包括但不限于血液细胞或组织细胞，如肝细胞或干细胞。血液细胞可以如是白细胞或红细胞。白细胞可以是例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或树突细胞。个别淋巴细胞可以是，例如T细胞—包括CMV-特异CD8+T-淋巴细胞、细胞毒性T-细胞、记忆T-细胞(记忆T细胞的示例性例子是CD62L+CD8+特异性中央记忆T-细胞)或调节性T-细胞(Treg的示例性例子是CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞)、T-辅助细胞(例如CD4+T-辅助细胞)、B细胞或天然杀伤细胞，提到的只是一些示例性例子。
靶细胞通常是细胞，包括细胞群或如上提到的任何其他生物实体群，其膜(在一些实施例中也可以是脂质双层)将内部与外部环境(环境)分离。靶细胞的进一步特点是其表面上具有特定特异性受体分子。可以通过本发明所述的方法在任何使用的纯化试剂(如受体结合试剂；竞争试剂；和/或多聚化试剂)的顺序移除下纯化这种靶细胞。除了靶细胞或细胞器则生理状态并不改变的优势之外，相应方法或用途提供了调节优势，即在使用这些纯化的生物实体作为药物时，纯化试剂没有施用给受试者(如患者)。
例如，靶细胞可以是组织如器官或其部分的细胞。各个器官的实例包括但不限于肾上腺组织、骨骼、血液、膀胱、脑、软骨、结肠、眼、心、肾、肝、肺、肌肉、神经、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、肿瘤、血管或子宫组织、或结缔组织。在一些实施例中，细胞是干细胞、淋巴细胞或癌细胞。
将要从中分离出靶细胞的样品可以是任何来源，其实例包括但不限于可源自人、动物、植物、细菌、真菌或原生动物。因此，任何以下样品包括但不限于土壤样品、空气样品、环境样品、细胞培养样品、骨髓样品、食物样品、血液样品、血清样品、血浆样品、尿样品、粪便样品、精液样品、淋巴液样品、脑脊液样品、洗鼻咽样品、痰液样品、口腔拭子样品、咽喉拭子样品、鼻拭子样品、支气管肺泡灌洗样品、支气管分泌物样品、牛奶样品、羊水样品、活检样品、癌症样品、肿瘤样品、组织样品、细胞样品、细胞培养样品、细胞溶解产物样品、病毒培养样品、指甲样品、头发样品、皮肤样品、法医样品、感染样品、院内感染样品、空间样品或其任何组合。当需要时，相应的样品可以已被预处理到任何程度。作为一个说明性实例，在用于本发明所述的方法之前，组织样品可能被消化、均质或离心。在另一个说明性实例中，体液如血液的样品可以通过血液细胞标准分离获得。如果本发明描述的分离方法用于基础研究，样品可以是体外细胞培养实验的细胞。样品通常会准备成液体的形式，如溶液或分散体。
在本发明中，靶细胞包括贴壁细胞、悬浮细胞。如本发明所定义，术语“贴壁细胞”是指对于生长而言需要固体支撑物的细胞，因此是锚定依赖性的。贴壁细胞的实例包括但不限于MRC-5细胞、HeLa细胞、Vero细胞、NIH-3T3细胞、L293细胞、CHO细胞、SKOV3细胞、U266细胞、BHK-21细胞、MCF-7细胞、A549细胞、COS细胞、HEK293细胞、Hep G2细胞、SNN-BE(2)细胞、BAE-1细胞和SH-SY5Y细胞。如本发明所定义，术语“悬浮细胞”是指对于生长而言不需要固体支撑物的细胞，因此是非锚定依赖性的。悬浮细胞的实例包括但不限于NSO细胞、U937细胞、Namalawa细胞、HL60细胞、WEHI231细胞、Yac 1细胞、THP-1细胞、K562细胞和U266细胞。在本发明的具体实施例中，靶细胞为CHO、SKOV3、K562或U266细胞。
在本发明中，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在本发明中，术语“可检测标记”是指至少一种能够直接或间接产生可检测信号的标记。该标记的非穷举清单包括：产生可检测信号(例如通过比色法、荧光、发光)的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光、发光染料，通过电子显微镜或通过其电学性质(例如电导率、安培法、伏安法、阻抗)被检测到的电子密度的基团；可检测基团，例如其分子大小足以在其物理和/或化学性质中诱导可检测的修饰的可检测基团，这样检测可通过光学方法(例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化)或物理方法(例如原子力光谱法、隧道效应)或放射性分子(例如32P、35S或125I)完成。在一些实施例中，所述产生可检测信号酶包括但不限于Luciferase；所述发色团包括但不限于GFP、EGFP、RFP或mcherry。在本发明的具体实施例中，所述可检测标记为Luciferase。
在本发明中，术语“切割”，切割位点可以导致肽通过除经典切割以外的机制分离成单独的实体。此种“切割”的确切机制对于本发明的目的而言并不重要，只要切割位点位于编码蛋白质的核苷酸序列之间时，就会导致蛋白质作为单独的实体表达。切割位点可以例如是弗林蛋白酶切割位点、烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点或编码自切割肽。“自切割肽”是指如下功能的肽：当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，立即被“切割”或分离成不同的和离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。
在本发明中，术语“γ分泌酶”、“gamma分泌酶”或“伽马-分泌酶”指的是为从膜结合的APP加工中间体中释放Aβ的关键酶的γ分泌酶。认为γ分泌酶为多-蛋白复合物，包括两种早老素片段以及辅因子呆蛋白、Pen-2和Aph-1。此外，本发明所用的术语“γ分泌酶”包括具有分别在APP中γ位点上裂解的能力的天然存在的酶的所有哺乳动物形式。本发明所用的术语“γ分泌酶”还包括这类酶的所有重组形式、突变体和其它变体，只要它们将催化γ分泌酶底物裂解的功能能力维持在相同底物上天然存在的γ分泌酶的有效性的至少约5％的水平上。
在本发明中，术语“免疫细胞”或“效应细胞”指可以引发免疫应答的细胞，“免疫细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的免疫细胞。“免疫细胞”包括但不限于例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和骨髓来源的细胞(髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。术语“免疫细胞”也可以是人或非人的。术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且指这样的主要类型的白细胞，其在胸腺中完成成熟并在免疫系统中具有各种作用，包括鉴定体内特异性外来抗原和使其他免疫细胞激活与失活。T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，初级T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞(例如，Jurkat、SupT1等)或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是任何发育阶段，包括但不限于：CD4+/CD8+双阳性T细胞，CD4+辅助T细胞(例如，Thl和Th2细胞)，CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)，外周血单核细胞(PBMC)，外周血白细胞(PBL)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，记忆T细胞，原初T细胞，调节性T细胞，γδT细胞等。其他类型的辅助T细胞包括诸如Th3、Thl 7、Th9或Tfh细胞的细胞。其他类型的记忆T细胞包括诸如中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tern细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指经遗传工程改造的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞还可以分化自干细胞或祖细胞。在本发明中，术语“原初T细胞”或Tn指这样的成熟T细胞，其不同于活化或记忆T细胞，其未在外周内遇到其同源抗原。在本发明的具体实施例中，所述T细胞为Jurkat细胞。术语“Jurkat细胞”是指血癌(永生急性T细胞白血病)细胞株，是由三藩市加利福尼亚大学的Arthur Weiss博士研发出来的。
在本发明中，术语“引入”指将外来DNA插入细胞中的方法。如本发明所用，术语引入包括转导法和转染法。转染是通过非病毒方法向细胞引入核苷酸的过程，包括但不限于使用脂质转染法、DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射和原生质体融合。转导是借助病毒载体向细胞引入外来DNA的过程。
在本发明中，术语“靶向BCMA的细胞”可为本发明所描述的任何靶向BCMA的细胞。在一些实施例中，细胞为本发明所描述的T细胞。在一些实施例中，细胞(例如T细胞)获自需要T细胞疗法的受试者。在一些方面中，细胞获自除需要T细胞疗法的受试者以外的供体。靶向BCMA的细胞的实例包括但不限于BCMA-CAR-T细胞、BCMA-CAR-NK细胞或BCMA-CAR-NKT细胞。在本发明的具体实施例中，所述靶向BCMA的细胞为BCMA-CAR-T细胞。
在本发明中，术语“BCMA-CAR-T”或“BCMA-CAR-T细胞”通常是指能够表达BCMA-CAR(又称“嵌合抗原受体”)的T细胞。所述CAR通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，结合肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和胞内结构域。
在本发明中，术语“识别”是指选择性结合靶标。识别病毒的T细胞通常表达结合病毒所表达的抗原的受体。
本发明涵盖在体外杀伤表达BCMA的细胞或抑制所述细胞的生长的方法。一般来说，如本发明在细胞的情形下所用的术语“杀伤”意指导致细胞死亡。这可通过许多机制诸如坏死或其他细胞损伤或诱导凋亡来实现。
在本发明中，术语“靶向”在涉及蛋白表达时旨在包括但不限于将蛋白或多肽引导至细胞内或其外部的适当目的地。通常通过信号肽或靶向肽来实现靶向，该信号肽或靶向肽是多肽链中的氨基酸残基的一段。这些信号肽可以位于多肽序列内的任何位置，但通常位于N端。多肽也可以经工程改造为在C端具有信号肽。信号肽可以指导多肽进行细胞外切割，定位到质膜、高尔基体、内体、内质网和其他细胞区室。在本发明中，术语“靶向”是指CAR-T细胞识别和杀伤靶细胞的能力。
在本发明中，术语“培养”还涵盖诸如生物反应器的大规模方法，包括在搅动发酵罐中附着至微载体生长的贴壁细胞。此外，在本发明的方法中不仅可以培养接触依赖性细胞，而且可以使用悬浮培养技术。本发明中的术语“共培养”是指是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖。细胞的共培养体系包括直接共培养体系和间接共培养体系，本发明中的CAR-T细胞与靶细胞以直接共培养体系进行共培养，2种细胞之间可直接接触。
在本发明中，术语“培养器材”或“培养容器”指容纳用于培养细胞或组织的培养基的容器。培养器材可以是玻璃或塑料的。优选塑料是非生物毒素的。培养器材包括但不限于：培养皿、培养瓶或培养板；在一些实施例中，培养板包括单槽和多槽培养板；在一些实施例中，培养皿包括小室和多小室培养载玻片、盖玻片；在一些实施例中，培养瓶包括烧瓶、试管瓶、滚瓶(roller bottle)、旋转瓶(spinnerbottle)。在本发明的具体实施例中，所述培养器材为培养瓶。
在本发明中，术语“效靶比”是指效应细胞(靶向BCMA的特异性CAR-T细胞)与靶细胞的数量比。
在一些任何此类实施例中，所述与BCMA相关的疾病或障碍与BCMA表达相关。在一些任何此类实施例中，所述与BCMA相关的疾病或障碍是B细胞相关障碍。在一些任何此类实施例中，所述与BCMA相关的疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。在一些实施例中，所述自身免疫性疾病或障碍是系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎(例如青少年类风湿性关节炎)、ANCA相关性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、查加斯病(Chagas’disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、寻常型天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性周围神经病变、血管炎、糖尿病、雷诺综合征(Reynaud’s syndrome)、抗磷脂综合征、古德帕斯丘病(Goodpasture’s disease)、川崎病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性肾小球肾炎。
在一些任何此类实施例中，所述与BCMA相关的疾病或障碍是癌症。在一些实施例中，所述癌症是表达BCMA的癌症。在一些实施例中，所述癌症是B细胞恶性肿瘤。在任何此类实施例中，所述癌症是淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。在一些实施例中，所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤(例如，地方性伯基特淋巴瘤或散发性伯基特淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样B细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺B细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在一些实施例中，所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在一些实施例中，所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(例如，非分泌性多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤)或浆细胞瘤。在本发明的一些实施例中，与BCMA相关的疾病或障碍是以下中的一种或多种：胶质母细胞瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生性障碍、免疫调节性障碍、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性和/或意义不明的单克隆丙种球蛋白病。
在本发明中，术语“疾病模型”通常指具有疾病模拟表现的个体，所述个体实例包括但不限于动物、植物或微生物。在某些实施方式中，所述疾病模型由动物(例如，小鼠、大鼠等)形成。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1构建3种BCMA融合蛋白
3种BCMA融合蛋白(BCMA-CD8αTM、BCMA-CD28TM、BCMA(N81S))的氨基酸序列与核苷酸序列如下：
1)BCMA胞外段(BCMA-EDC)氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA；
2)BCMA胞外段(BCMA-EDC)核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
ATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCCCAAAATGAATATTTTGACAGTTTGTTGCATGCTTGCATACCTTGTCAACTTCGATGTTCTTCTAATACTCCTCCTCTAACATGTCAGCGTTATTGTAATGCAAGTGTGACCAATTCAGTGAAAGGAACGAATGCG；
3)CD8α跨膜区(CD8αTM)氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
4)CD8α跨膜区(CD8αTM)核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；
5)BCMA胞内段(BCMA-ICD)氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
RKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARZ；
6)BCMA胞内段(BCMA-ICD)核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：
AGGAAGATAAACTCTGAACCATTAAAGGACGAGTTTAAAAACACAGGATCAGGTCTCCTGGGCATGGCTAACATTGACCTGGAAAAGAGCAGGACTGGTGATGAAATTATTCTTCCGAGAGGCCTCGAGTACACGGTGGAAGAATGCACCTGTGAAGACTGCATCAAGAGCAAACCGAAGGTCGACTCTGACCATTGCTTTCCACTCCCAGCTATGGAGGAAGGCGCAACCATTCTTGTCACCACGAAAACGAATGACTATTGCAAGAGCCTGCCAGCTGCTTTGAGTGCTACGGAGATAGAGAAATCAATTTCTGCTAGGTAA；
7)CD28跨膜区(CD28TM)氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV；
8)CD28跨膜区(CD28TM)核苷酸序列(SEQ ID NO.8)：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG；
9)BCMA(N81S)跨膜区(BCMA-TM)氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：
ILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLL；
10)BCMA(N81S)跨膜区(BCMA-TM)核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：
ATTCTCTGGACCTGTTTGGGACTGAGCTTAATAATTTCTTTGGCAGTTTTCGTGCTAATGTTTTTGCTA；
11)BCMA(N81S)胞内段(BCMA-ICD(N81S))氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：
RKISSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARZ；
12)BCMA(N81S)胞内段(BCMA-ICD(N81S))核苷酸序列(SEQ ID NO.12)：
AGGAAGATAAGCTCTGAACCATTAAAGGACGAGTTTAAAAACACAGGATCAGGTCTCCTGGGCATGGCTAACATTGACCTGGAAAAGAGCAGGACTGGTGATGAAATTATTCTTCCGAGAGGCCTCGAGTACACGGTGGAAGAATGCACCTGTGAAGACTGCATCAAGAGCAAACCGAAGGTCGACTCTGACCATTGCTTTCCACTCCCAGCTATGGAGGAAGGCGCAACCATTCTTGTCACCACGAAAACGAATGACTATTGCAAGAGCCTGCCAGCTGCTTTGAGTGCTACGGAGATAGAGAAATCAATTTCTGCTAGGTAA。
BCMA-CD8αTM的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、3、5依次连接所构成的氨基酸序列；BCMA-CD8αTM的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、4、6依次连接所构成的核苷酸序列；BCMA-CD28TM的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、7、5依次连接所构成的氨基酸序列；BCMA-CD28TM的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、8、6依次连接所构成的核苷酸序列；BCMA(N81S)的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、9、11依次连接所构成的氨基酸序列；BCMA(N81S)核苷酸序列为SEQ ID NO.2、10、12依次连接所构成的核苷酸序列。
将编码BCMA-CD8αTM、BCMA-CD28TM、BCMA(N81S)的核苷酸序列交由吉凯进行全基因合成。
实施例2比较3种融合蛋白在CHO细胞上的表达差异
1、实验方法
1.1)将携带包含荧光素酶(Luciferase)的3种融合蛋白(BCMA-CD28TM-luc、BCMA-CD8αTM-luc、BCMA(N81S)-luc)的慢病毒分别感染CHO细胞，加压筛选富集BCMA阳性细胞。向培养体系中加入γ分泌酶抑制剂(L411,575)0.5μM预处理细胞24h。使用PE-CD269染色，流式细胞检测CHO细胞表面BCMA表达水平。
1.2)为明确BCMA-CD28TM-luc和BCMA-CD8αTM-luc在CHO细胞上的表达差异是与融合蛋白自身结构有关，还是由慢病毒感染效率不同导致。我们将D-荧光素(D-Luciferin)加入培养体系，通过荧光素酶实验，检测不同细胞密度下，BCMA-CD28TM-luc细胞和BCMA-CD8αTM-luc细胞的生物荧光值，通过比较两者荧光素酶(Luciferase)表达量的差异，间接反应2种慢病毒的感染效率。
2、实验结果
流式细胞检测结果如图2所示，结果表明BCMA-CD8αTM成功在CHO细胞膜上过表达，平均荧光强度从147增至838，上调近6倍；加入γ分泌酶抑制剂预处理后，BCMA的荧光强度仅提升2.2倍。表明BCMA-CD8αTM可在CHO细胞膜上稳定、高效表达，且受γ分泌酶干扰较小。
荧光素酶实验结果如图3所示，结果显示多种细胞密度下2种BCMA融合蛋白生物荧光值接近，差异无统计学意义；仅在细胞密度为1×106时，BCMA-CD8αTM-luc组的生物荧光值才略高于BCMA-CD28TM-luc组。表明2种BCMA融合蛋白在CHO细胞上的表达差异，主要由融合蛋白结构决定，而与慢病毒感染效率无关。
实施例3表达BCMA-CD8αTM的CHO细胞对评价BCMA-CAR-T细胞识别、杀伤效果的影响
1、实验方法
将过表达BCMA-CD8αTM的CHO细胞按104/孔接种到细胞培养板中。次日，再将Mock-T、BCMA-CAR-T细胞按效靶比10:1、5:1、3:1加入对应的孔中，通过RTCA仪器实时监测贴壁细胞信号，间接反映CAR-T细胞对靶细胞的杀伤活性。CHO-BCMAmut代表CHO-BCMA-CD8αTM。
2、实验结果
RTCA仪器实时监测结果如图4所示，BCMA-CAR-T细胞可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8αTM的CHO细胞，但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应，表明构建的BCMA-CD8αTM，不但可以在CHO细胞膜上的稳定、高效表达，而且过表达BCMA-CD8αTM的靶细胞还可以被BCMA-CAR-T细胞特异性识别、杀伤。以上数据说明，成功构建了过表达BCMA-CD8αTM的CHO细胞，该细胞可作为工具细胞用于RTCA评估BCMA靶向CAR-T细胞杀伤活性。
实施例4比较3种融合蛋白在SKOV3细胞和K562细胞上的表达差异
1、实验方法
选择了2种BCMA阴性细胞系—SKOV3(贴壁细胞)和K562(悬浮细胞)，将携带BCMA-CD28 TM-luc，BCMA-CD8αTM-luc，BCMA(N81S)-luc的慢病毒分别感染这两株细胞，通过加压筛选富集BCMA阳性细胞。向培养体系中加入γ分泌酶抑制剂(L411,575)0.5μM预处理细胞24h。使用PE-CD269染色，流式细胞检测SKOV3细胞和K562细胞表面BCMA表达水平。
2、实验结果
流式细胞检测结果如图5所示，结果显示只有BCMA-CD8αTM可在SKOV3或K562细胞膜上成功过表达，平均荧光强度分别上调5倍、7倍，且膜表达的BCMA-CD8αTM受γ分泌酶影响较小，这与此前在CHO细胞中获得的实验结果相一致。提示BCMA-CD8αTM可在多种细胞表面稳定、高效表达。
实施例5表达BCMA-CD8αTM的SKOV3或K562细胞对评价BCMA-CAR-T细胞识别、杀伤效果的影响
1、实验方法
将SKOV3-BCMA-CD8αTM细胞按104/孔接种到细胞培养板中。次日，按效靶比5:1、3:1、1:1再将Mock-T、BCMA-CAR-T细胞加入对应的孔中，进行RTCA监测。K562-BCMA-CD8αTM是悬浮细胞，不能作为RTCA实验的靶细胞。但因其表达Luciferase，故可通过荧光素酶实验检测与BCMA-CAR-T细胞共孵育(0h、24h、48h或72h)后残余靶细胞的生物荧光值，间接反映BCMA-CAR-T细胞的杀伤活性。SKOV3-BCMAmut代表SKOV3-BCMA-CD8αTM。
2、实验结果
RTCA监测结果如图6所示，结果表明不同效靶比下，BCMA-CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8αTM的SKOV3细胞，但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应。
荧光素酶实验结果如图7所示，结果表明不同效靶比下，BCMA-CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8αTM的K562细胞。
以上数据说明，过表达BCMA-CD8αTM的靶细胞可以被BCMA-CAR-T特异性识别、杀伤，该效应既适用于贴壁细胞，也适用于悬浮细胞，具有一定的普适性。
实施例6检测BCMA-CD8αTM在U266细胞上的表达水平
1、实验方法
将携带BCMA-CD8αTM的慢病毒感染U266细胞，通过嘌呤霉素(Puromycin)加压筛选，富集阳性细胞。PE-CD269染色结合流式细胞分析，检测U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞表面BCMA的阳性表达率和平均荧光强度。同时，应用γ分泌酶抑制剂(L411,5750.5μM)，预处理上述2种细胞，24h后再次进行流式细胞检测，分析抑制γ分泌酶活性对膜表面BCMA表达的影响。
2、实验结果
流式细胞检测结果如图8所示，结果显示53.09％的母本U266细胞表面表达BCMA，平均荧光强度385。BCMA-CD8αTM过表达可将BCMA阳性率提升至96.89％，平均荧光强度上调至623。而且不论母本细胞还是BCMA-CD8αTM过表达细胞，应用L411,575抑制γ分泌酶活性，都可显著增强BCMA表达水平，平均荧光强度上调8倍以上。表明即使在γ分泌酶的影响下，BCMA-CD8αTM依然可以在U266细胞中稳定、高效表达。
实施例7流式细胞检测BCMA-CD8αTM对BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞TCR信号的影响
1、构建3×NFAT Response element-minIL-2P-EGFP Reporter系统
1)3×NFAT转录因子响应元件(3×NFAT Response element)的核苷酸序列：
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCTCGAGG；
2)最小IL-2启动子(minIL-2P)的核苷酸序列：
ACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAA；
3)EGFP的核苷酸序列：
GCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。
3×NFAT Response element-minIL-2P-EGFP Reporter系统的核苷酸序列包含3×NFAT转录因子响应元件、最小IL-2启动子、EGFP依次连接的核苷酸序列。
2、实验方法
将3×NFAT Response element-minIL-2P-EGFP Reporter的核苷酸序列克隆至pHAGE-EF1α载体，构建了携带Reporter系统的慢病毒穿梭质粒。将携带3×NFAT Responseelement-minIL-2P-EGFP Reporter系统的慢病毒感染Jurkat细胞，通过药物筛选结合单克隆分选，获得一株Reporter系统过表达的Jurkat细胞。命名为Jurkat-Reporter细胞。
将携带BCMA-CAR的慢病毒转导Jurkat-Reporter细胞获得BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞。将U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞按效靶比1:1或1:2.5分别与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共孵育。通过流式细胞检测EGFP表达水平，间接反映TCR信号活性的变化，并进行定量分析。
3、实验结果
流式细胞检测结果如图9所示，U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共孵育后，都可激活Reporter系统，增强EGFP表达，但该效应在BCMA-CD8αTM过表达的U266细胞中更显著。表明膜表达的BCMA-CD8αTM可被BCMA-CAR识别，从而激活TCR信号，影响T细胞的生物学功能。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括BCMA跨膜区、BCMA胞外段和/或BCMA胞内段；
优选地，所述BCMA跨膜区包括以下分子的跨膜区：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRζ、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD34、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40，CD137、ICOS、CD152、CD154、IgG1、IgG4、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1、GITR中的一种或多种；
优选地，所述BCMA跨膜区为CD8α跨膜区；
优选地，所述BCMA跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述BCMA胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述BCMA胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
优选地，所述融合蛋白的结构依次由BCMA胞外段、BCMA跨膜区和BCMA胞内段组成；
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、3、5依次连接所构成的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的融合蛋白的多核苷酸；
优选地，所述BCMA胞外段的编码核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；
优选地，所述BCMA胞外段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述BCMA跨膜区的核苷酸序列与SEQ ID NO.4所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；
优选地，所述BCMA跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述BCMA胞内段的核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；
优选地，所述BCMA胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述多核苷酸为SEQ ID NO.2、4、6依次连接所构成的DNA序列。
3.一种包括或表达权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的多核苷酸的载体；
优选地，所述载体包括克隆载体或表达载体；
优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体；
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体；
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。
4.一种靶细胞，其特征在于，所述靶细胞包括或表达权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体中的一种或多种；
优选地，所述靶细胞还包括可检测标记的核苷酸片段；
优选地，所述可检测标记包括Luciferase、GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种；
优选地，所述可检测标记为Luciferase；
优选地，所述靶细胞包括贴壁细胞、悬浮细胞；
优选地，所述靶细胞包括CHO、SKOV3、K562或U266；
优选地，所述靶细胞受γ分泌酶的干扰较小；
优选地，所述靶细胞能够诱导免疫细胞产生TCR信号；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞；
优选地，所述T细胞包括原初T细胞或Jurkat细胞；
优选地，所述T细胞为Jurkat细胞。
5.一种制备权利要求4所述的靶细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体引入靶细胞。
6.权利要求4所述的靶细胞或根据权利要求5所述的方法制备得到的靶细胞在制备评价靶向BCMA的细胞药效的产品中的应用；
优选地，所述产品为检验靶向BCMA的细胞识别、杀伤效果的产品；
优选地，所述靶向BCMA的细胞包括BCMA-CAR-T细胞、BCMA-CAR-NK细胞或BCMA-CAR-NKT细胞；
优选地，所述靶向BCMA的细胞为BCMA-CAR-T细胞。
7.一种体外评价靶向BCMA的细胞药效的方法，其特征在于，所述方法包括步骤1)：将权利要求4所述的靶细胞或根据权利要求5所述的方法制备得到的靶细胞与靶向BCMA的细胞共培养；
优选地，所述共培养的方法包括先将所述靶细胞接种到细胞培养器材中，随后向细胞培养器材中加入靶向BCMA的细胞；或先将靶向BCMA的细胞加入到培养器材中，随后向细胞培养器材中加入所述靶细胞；或将所述靶细胞和靶向BCMA的细胞同时加入到培养器材中；
优选地，所述共培养的方法为先将所述靶细胞接种到细胞培养器材中，随后向细胞培养器材中加入靶向BCMA的细胞；
优选地，所述培养器材包括培养板、培养瓶或培养皿；
优选地，所述培养器材为培养板；
优选地，靶向BCMA的细胞与靶细胞的效靶比选自1:1～20:1；
优选地，所述效靶比选自2:1～15:1；
优选地，所述效靶比为3:1、5:1、10:1。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤2)：共培养完成后，检测靶向BCMA的细胞对靶细胞的识别、杀伤效果；
优选地，所述检测的方法包括使用RTCA检测或流式细胞检测；
优选地，所述靶向BCMA的细胞包括BCMA-CAR-T细胞、BCMA-CAR-NK细胞或BCMA-CAR-NKT细胞；
优选地，所述靶向BCMA的细胞为BCMA-CAR-T细胞。
9.权利要求4所述的靶细胞或根据权利要求5所述的方法制备得到的靶细胞在评价体外靶向BCMA表达检测产品或方法中的应用。
10.权利要求4所述的靶细胞或根据权利要求5所述的方法制备得到的靶细胞在构建与BCMA相关的疾病模型中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9272002B2 (en) * | 2011-10-28 | 2016-03-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting |
| WO2020034081A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | Hrain Biotechnology Co., Ltd. | Bcma-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof |
| CN112778427A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-05-11 | 武汉思安医疗技术有限公司 | 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用 |
| CN113234174A (zh) * | 2015-08-11 | 2021-08-10 | 南京传奇生物科技有限公司 | 靶向bcma的嵌合抗原受体及其使用方法 |
| CN113286811A (zh) * | 2018-07-30 | 2021-08-20 | 南加利福尼亚大学 | 改善过继性细胞疗法的效力和安全性 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9272002B2 (en) * | 2011-10-28 | 2016-03-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting |
| CN113234174A (zh) * | 2015-08-11 | 2021-08-10 | 南京传奇生物科技有限公司 | 靶向bcma的嵌合抗原受体及其使用方法 |
| CN113286811A (zh) * | 2018-07-30 | 2021-08-20 | 南加利福尼亚大学 | 改善过继性细胞疗法的效力和安全性 |
| WO2020034081A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | Hrain Biotechnology Co., Ltd. | Bcma-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof |
| CN112778427A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-05-11 | 武汉思安医疗技术有限公司 | 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NCBI: "NC_000082.7", NCBI, pages 1 - 4 * |
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