CN114525306A - 一种cd7-car-t细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CD7‑CAR‑T细胞的制备方法及应用。具体地，本发明提供了一种制备CD7‑CAR‑T细胞的方法，调整表达CD7阻断分子的慢病毒和表达CD7‑CAR的慢病毒的转染顺序和转染时间，提高了转染效率，增强了CAR‑T细胞的细胞毒性。本发明还提供了利用该方法制备的CD7‑CAR‑T细胞及其应用。

Description

一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用。
背景技术
T细胞来源的恶性肿瘤代表着一种典型的血液系统恶性肿瘤，在儿童和成人患者中都具有很高的复发率和死亡率，目前尚无非常有效的治疗手段。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤，大约占成人急性淋巴细胞白血病病例的25％和儿童急性淋巴细胞白血病病例的15％左右。T-ALL在临床上的症状主要有感染、贫血、发热、异常出血等，T-ALL进展很快，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统和睾丸等组织器官，如果没有及时有效的治疗方法，患者发病后很快就会死亡。目前，对于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的治疗策略主要包括强化化疗，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，抗病毒治疗和分子靶向治疗。但是，强化化疗通常不能阻止疾病治疗后的复发。对于那些在初次治疗后复发的患者，补救性化疗方案的缓解率大约只有20-40％。另外，虽然造血干细胞移植可能是目前唯一可以治愈的方案，但是也会伴有移植物抗宿主病带来的生命危险。
近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法显示出非常显著的临床疗效，作为一种新型的过继性免疫治疗技术，被用于治疗多种实体肿瘤和血液肿瘤，其中疗效最显著的是针对B细胞来源的淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗。CAR-T疗法是通过基因修饰患者的T淋巴细胞，以主要组织相容性复合物非依赖性的方式靶向和消除恶性肿瘤。有效应用该技术的关键之一是选择一个合适的靶点来构建对应的CAR分子。最佳的靶抗原应该只在肿瘤细胞表达，不在正常细胞表达，或者也可以表达在那种正常细胞短暂缺失后，临床上有应对方案的细胞上。
CD7分子在大多数的T细胞血液肿瘤细胞上是高表达的。CD7是由T、NK细胞和它们的前体细胞表达的跨膜糖蛋白，结合其配体K12/SECTM1后刺激T细胞活化。然而，CD7分子似乎未在T细胞发育或功能中起关键作用，因为破坏鼠T细胞的祖细胞中的CD7分子后，不影响正常T细胞发育和体内平衡，并且对T细胞效应功能不会有影响。重要的是，CD7曾作为抗体靶标用于治疗T细胞淋巴瘤，并且靶向CD7后患者未出现严重的不良反应。因此，CD7分子可能是一个针对T细胞血液肿瘤的非常合适的治疗靶点。但是用CD7-CAR-T细胞靶向治疗T细胞急性淋巴细胞白血病依然面临着很大的问题，这是因为正常的效应T细胞和T细胞肿瘤都表达CD7抗原会导致CD7-CAR-T细胞的自相残杀，CD7-CAR-T细胞很难在体外制备成功。
因此，本领域迫切需要开发新的CD7-CAR-T细胞的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用。
具体地，本发明提供了一种基于人源化CD7纳米抗体序列的CD7-CAR-T细胞制备方法。
本发明还提供了用PA007CD和PA107CD载体构建的CD7-CART细胞对CD7阳性肿瘤细胞的体外杀伤结果。
在本发明的第一方面，提供了一种制备CD7-CAR-T细胞的方法，包括步骤：
(i)提供一含T细胞的待处理样本，
(ii)分选并活化所述样本中包含的T细胞，从而得到激活的T细胞，
(iii)将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞，从而得到CD7被阻断的T细胞，和
(iv)将用于表达CD7-CAR的第二病毒载体导入到所述CD7被阻断的T细胞，从而得到所述CD7-CAR-T细胞，
其中，所述T细胞与激活剂共孵育12-36h后，较佳地，18-30h，更佳地，22-26h，将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞。
在另一优选例中，所述的导入第一病毒载体与导入第二病毒载体之间间隔36-60h，较佳地，间隔42-54h，更佳地，间隔46-50h。
在另一优选例中，在步骤(iii)中，包括步骤：
(a)在适合转染的条件下，将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体与所述激活的T细胞共培养36-60h，较佳地，42-54h，更佳地，46-50h，从而得到第一转染混合液；
(b)去除所述第一转染混合液中的第一病毒载体，从而得到CD7被阻断的T细胞。
在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括去除步骤(ii)中所添加的激活剂的步骤。
在另一优选例中，在步骤(b)中，去除所述第一转染混合液中的第一病毒载体和激活剂。
在另一优选例中，在步骤(iv)中，包括步骤：
(c)在适合转染的条件下，将用于表达CD7-CAR的第二病毒载体与所述CD7被阻断的T细胞共培养12-36h，较佳地，18-30h，更佳地，22-26h，从而得到第二转染混合液；
(d)去除所述第二转染混合液中的第二病毒载体，从而得到所述CD7-CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述的第一病毒载体和第二病毒载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的共培养在36-38℃的条件下进行。
在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的第一病毒载体与T细胞的数量比(感染复数)为1:0.05-0.4。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的第二病毒载体与T细胞的数量比(感染复数)为1:0.5-4。
在另一优选例中，利用缓冲液清洗所述T细胞，从而去除病毒载体。
在另一优选例中，所述的样本为外周血单个核细胞。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，利用激活剂进行所述的分选和活化。
在另一优选例中，所述的激活剂为靶向CD3和CD28的磁珠。
在另一优选例中，所述磁珠为美天妮Transact(具有易去除可降解且激活效果好的特点)。美天妮Transact即为实施例中使用的靶向CD3和CD28的磁珠。
在另一优选例中，所述的T细胞与激活剂比例为1×106个：5-20ul。
在另一优选例中，将所述靶向CD3/CD28的磁珠与T细胞孵育12-36h，较佳地，18-30h，更佳地，22-26h后，将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞。
在另一优选例中，在步骤(iv)之后，还包括步骤：
(v)在适合T细胞扩增的条件下，对所述CD7-CAR-T细胞进行扩大培养。
在另一优选例中，所述的CD7-CAR的抗原结合结构域包括一个或多个CD7纳米抗体。
在另一优选例中，所述的CD7纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在另一优选例中，所述的CAR还包含ICOS来源的跨膜区和/或ICOS来源的胞内共刺激区。
在另一优选例中，所述的CAR包含ICOS来源的胞内共刺激区和4-1BB来源的胞内共刺激区。
在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：
L-VHH-H-TM-C-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为信号肽序列；
VHH为包含一个或两个CD7纳米抗体的抗原结合结构域；
H为铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述CAR的结构如图1所示。
在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述L为CD8来源的信号肽。
在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述的VHH包括两个CD7纳米抗体，较佳地，所述的两个CD7纳米抗体通过连接肽相连，更佳地，所述的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的CD7纳米抗体包括人源化的纳米抗体和骆驼源纳米抗体，优选为人源化的纳米抗体。
在另一优选例中，所述的VHH为一个人源化的CD7纳米抗体。
在另一优选例中，所述的H为来源于选自下组的蛋白的铰链区：Fc、CD8、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为Fc片段，优选地，所述的Fc片段为人IgG4 Fc片段。
在另一优选例中，所述的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：ICOS、CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM为ICOS来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述ICOS来源的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ICOS、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的C为ICOS和/或4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述ICOS来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
在另一优选例中，所述4-1BB来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在另一优选例中，所述CAR(优选地为C端)还包括细胞自杀元件。
在另一优选例中，所述的CAR与细胞自杀元件通过自剪切元件相连接。
在另一优选例中，所述细胞自杀元件与所述CAR的CD3ζ通过T2A连接。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、EGFRt、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞自杀元件为tEGFR。
在另一优选例中，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
在另一优选例中，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在另一优选例中，所述CAR为PA107CD CAR(即申请号201911150678.7的中国专利申请中的名称为PA3-17的CD7 CAR)。
在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的结构如下式II所示：
L’-VHH’-ER(II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L’为信号肽序列；
VHH’为包含两个CD7纳米抗体的结合区；
ER为内质网滞留序列。
在另一优选例中，所述L’的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述L’的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述VHH’的两个CD7纳米抗体通过连接肽相连，更佳地，所述的连接肽如SEQ ID NO:8所示。
在另一优选例中，所述VHH’的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在另一优选例中，所述VHH’的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述VHH’为骆驼源的纳米抗体。
在另一优选例中，所述ER的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一优选例中，所述ER的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述方法制备的CD7-CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述CD7-CAR-T细胞中，至少80％，较佳地90％，更佳地95％，最佳地98％的内源性CD7表达被阻断。
在本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第二方面所述的CD7-CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在本发明的第四方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第二方面所述的CD7-CAR-T细胞或本发明第三方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的CD7-CAR和CD阻断分子的载体结构图。
图2显示了本发明的CD7-CART的制备流程图。
图3显示了检测T细胞表面的CD7分子表达(使用FITC通道的CD7抗体检测CD7分子表达)、CD7-CART的转染效率(使用PE通道的CD3抗体检测T细胞表达，使用APC通道的FC抗体检测CAR的表达)的流式图。
图4显示了CD7-CAR-T细胞对过表达CD7的293T细胞的细胞毒性。
图5显示了CD7-CAR-T细胞对天然表达CD7的急性淋巴白血病细胞(CEM)的细胞毒性。
图6显示了CD7-CAR-T细胞与293T-CD7细胞孵育后细胞因子分泌情况。
图7显示了CD7-CAR-T细胞与CEM细胞孵育后细胞因子分泌情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用。具体地，本发明的方法通过调整表达CD7阻断分子的慢病毒和表达CD7-CAR的慢病毒的转染顺序和转染时间，提高了转染效率，增强了CAR-T细胞的细胞毒性。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明是要提供一种基于人源化CD7纳米抗体序列构建的CD7-CAR-T细胞制备方法，由于CD7-CAR-T细胞的制备过程中涉及两种慢病毒的转染，一种是将表达在T细胞表面的CD7抗原锚定在细胞内质网或高尔基体中的PA007CD病毒，另一种是可以在T细胞表面表达CD7-CAR的PA107CD慢病毒。发明人发现两种慢病毒使用的先后顺序，转染的时间间隔等因素会直接影响最终CART细胞的质量。本发明阐述了在T细胞分选活化后24小时转染PA007CD慢病毒，48小时后清洗去除PA007CD慢病毒及激活剂，然后转染PA107CD慢病毒24小时后再次清洗去除PA107CD慢病毒的CD7-CAR-T制备方法。使用此种方法制备的CD7-CAR-T细胞具有较高的CAR转染效率，较好的细胞活率，通过体外功能实验证明，本申请制备的CD7-CAR-T细胞能特异性杀伤CD7阳性的靶细胞并分泌较高的特异性细胞因子。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
本申请的序列表中提供了CD7阻断分子(PA007CD)、CD7-CAR(PA107CD)及其元件的序列，各个序列所代表的含义如下表1所示。
表1序列表中各个序列的名称
序列 名称
SEQ ID NO:1 CD7阻断分子碱基序列
SEQ ID NO:2 CD7阻断分子氨基酸序列
SEQ ID NO:3 sp(信号肽)碱基序列
SEQ ID NO:4 sp(信号肽)氨基酸序列
SEQ ID NO:5 CD7纳米抗体(VHH6)的碱基序列
SEQ ID NO:6 CD7纳米抗体(VHH6)的氨基酸序列
SEQ ID NO:7 (G4S)4碱基序列
SEQ ID NO:8 (G4S)4氨基酸序列
SEQ ID NO:9 ER碱基序列
SEQ ID NO:10 ER氨基酸序列
SEQ ID NO:11 PA107CD碱基序列
SEQ ID NO:12 PA107CD氨基酸序列
SEQ ID NO:13 HuVHH6(CD7纳米抗体人源化序列)氨基酸序列
SEQ ID NO:14 Fc(人IgG4 Fc序列，铰链区)氨基酸序列
SEQ ID NO:15 ICOS-tran(ICOS跨膜区序列)氨基酸序列
SEQ ID NO:16 ICOS(ICOS胞内区序列)氨基酸序列
SEQ ID NO:17 41BB(41BB胞内区序列)氨基酸序列
SEQ ID NO:18 CD3ζ氨基酸序列
SEQ ID NO:19 T2A氨基酸序列
SEQ ID NO:20 tEGFR(截短的EGFR序列)氨基酸序列
嵌合抗原受体(CAR)
CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD7的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与ICOS和/或4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”是指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。作为本发明的优选方式，所述抗原结合结构域包含一个或多个特异性识别CD7的纳米抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本发明的CAR中的胞内结构域包括ICOS和/或4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。
本发明还提供了靶向CD7的CAR-T细胞，除非特别说明，本发明的CAR-T细胞表面的CD7表达是被阻断的，较佳地，被本发明第二方面所述的CD7阻断分子所阻断。
自杀基因开关
为进一步控制CAR-T细胞非肿瘤靶向和细胞因子释放综合征等不良，本发明中的CART细胞皆带有自杀基因开关，在外源性药物的作用下，可以有效清除体内的CAR-T细胞，阻断未知的或不可控的远期毒性，以保证患者的安全。
本发明中所用自杀基因开关可以为HSV-TK、iCasp9、CD20、mTMPK等。比较而言，HSV-TK、iCasp9和CD20对T细胞的清除能力等同，但是iCasp9和CD20的清除较迅速，HSV-TK清楚速度较慢。
iCasp9自杀基因包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性接头连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。当加入小分子后，能够促使其二聚话，从而诱导细胞的凋亡，而对未携带自杀基因的正常细胞无效用。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(del ivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104-1×107个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD7，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD7的CAR-T细胞引起抗表达CD7的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括CD7纳米抗体、Fc片段、跨膜区、和ICOS胞内区、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或ii i)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明方法制备的CD7-CAR-T细胞具有较高的CAR转染效率，较好的细胞活率。
(b)本发明方法制备的CD7-CAR-T细胞能特异性杀伤CD7阳性的靶细胞并分泌较高的特异性细胞因子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
CD7-CAR和CD7阻断分子的制备
利用本领域的常规技术手段构建CD7阻断分子，结构如图1所示，氨基酸序列如SEQID NO:2所示。将上述CD7阻断分子插入到慢病毒载体中，然后通过慢病毒包装技术，制备CD7阻断慢病毒，即PA007CD。
利用本领域的常规技术手段构建CD7-CAR，结构如图1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。将上述CD7-CAR插入到慢病毒载体中，然后通过慢病毒包装技术，制备CD7-CAR慢病毒，即PA107CD。
实施例2
CD7-CAR-T细胞的制备
由于人正常T细胞中有90％以上表达CD7抗原，所以在制备CD7-CAR-T细胞的过程中需要将T细胞表面的CD7抗原阻断在胞内，否则会出现CD7-CAR-T识别自身抗原CD7而造成的自杀现象。
使用CD7阻断慢病毒(PA007CD)转染T细胞，使得T细胞表达的CD7被阻断在内质网或高尔基体中无法呈递到T细胞表面，然后再使用CD7-CAR慢病毒(PA107CD)进行T细胞转染，制备出CD7-CAR-T细胞。
在此实施例中，使用来源于供者的单采血样，使用Ficoll采用密度梯度离心方法得到单个核细胞(PBMC),再使用CD4/CD8双磁珠从单个核细胞中富集出T细胞，在得到T细胞后使用激活剂(Transact)对T细胞进行活化，在活化后的第二天(活化24小时后)根据前期的验证结果选用合适的PA007CD病毒数目进行T细胞的转染，具体比例为MOI(感染复数)＝0.05-0.4，在此MOI的条件下T细胞表面CD7分子可以被完全阻断且对后期的PA107CD病毒转染影响较小，在PA007CD慢病毒转染48h后离心去除残留激活剂和PA007CD慢病毒后再加入PA107CD慢病毒进行转染，PA107CD转染时的用量也是根据前期的验证结果选用了合适的病毒数目，具体比例为MOI(感染复数)＝0.5-4，此MOI的选择保证了转染效率，转染24h后离心去除残留PA107CD慢病毒并开始CAR-T细胞的扩增培养。制备流程图如图2所示。
实施例3
T细胞表面的CD7分子表达、CD7-CART的转染效率
在CD7-CAR-T细胞的制备过程中，T细胞表面CD7的表达率，CAR阳性细胞的比例(转染效率)是CD7-CAR-T细胞的重要考察指标。在先转染PA007CD病毒后需阻断T细胞表面的CD7分子表达，接着转染PA107CD就可以成功制备出CD7-CAR-T细胞。使用此方法制备的3批CD7-CAR-T，收样时细胞CD7分子表达及转染效率统计如表2所示。
表2细胞表面CD7分子表达及转染效率
细胞批号 LZ012019122101 ZL012019123001 ZZY12020010701
CD7分子表达 0.20 1.05 0.99
转染效率 37.80 18.86 11.56
流式图如图3所示。
结果显示，在转染PA007CD病毒后T细胞表面的CD7分子已接近被完全阻断，表达量在1％左右，此时转染PA107CD慢病毒制备CD7-CAR-T减少细胞的自杀现象，可以有效的保证CD7 CAR-T细胞的活率，显著提高细胞的制备成功率。
实施例4
CD7-CAR-T细胞对过表达CD7的293T细胞的细胞毒性
一个重要地检测CD7-CAR-T细胞生物学效力的方法是检测CD7-CAR-T细胞与CD7阳性靶细胞共孵育后，CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。
构建了CD7过表达的293T细胞(293T-CD7)作为靶细胞，评估CD7-CAR-T细胞的体外杀伤功能。利用实施例2制备的LZ012019122101、ZL012019123001、ZZY12020010701，三组CD7-CAR-T进行的杀伤实验，效靶比分别为20:1，10:1,5:1。293T细胞为CD7阴性靶细胞。
结果如图4所示，通过下面3组细胞的杀伤结果可以看出CD7-CAR-T细胞对293T-CD7细胞(CD7阳性)具有显著的特异性杀伤作用，而对293T细胞(CD7阴性)不具有特异性杀伤，说明实施例2制备的CD7-CAR-T细胞在体外可以对过表达CD7阳性的293T-CD7细胞产生特异的细胞毒性，而对CD7阴性的293T细胞不具有特异的细胞毒性。
实施例5
CD7-CAR-T细胞对天然表达CD7的急性淋巴白血病细胞(CEM)的细胞毒性
利用实施例2制备出的CD7-CAR-T细胞对急性淋巴白血病细胞(CEM)进行体外杀伤实验，效靶比分别为1:1,1:10,1:50,1:100。T细胞为对照效应细胞。
结果如图5所示，与对照的T细胞相比，CD7-CART细胞对CEM都具有显著的特异性杀伤作用，说明实施例2制备的CD7-CART细胞在体外对CD7阳性的CEM细胞具有显著的细胞毒性。
实施例6
CD7-CAR-T细胞与293T-CD7细胞孵育后细胞因子分泌情况
分析了CD7-CAR-T细胞与293T-CD7细胞孵育后细胞因子的释放情况，选择效应细胞与靶细胞共孵育效靶比为1:1组的杀伤上清,检测细胞因子IL-2,IFN-γ，Granzyme B的分泌。
结果如图6所示，CD7-CAR-T细胞与293T共孵育后基本不会有细胞因子的产生，而CD7-CAR-T细胞与293T-CD7细胞孵育后，有明显的细胞因子释放升高。说明制备的CD7-CAR-T细胞可以CD7阳性的293T-CD7细胞特异性激活。
实施例7
CD7-CAR-T细胞与CEM细胞孵育后细胞因子分泌情况
进一步分析了CD7-CAR-T细胞与CEM细胞共孵育后细胞因子的释放情况，CD7-CAR-T细胞与靶细胞孵育的效靶比分别为1:10,1:50,1:100,T细胞组作为对照组，检测细胞因子IL-2,IFN-γ，Granzyme B的分泌。
结果如图7所示，T细胞与靶细胞共孵育后基本不会有细胞因子的产生，而CD7-CAR-T细胞与CEM细胞孵育后，有明显的细胞因子释放升高。进一步证明了制备的CD7-CAR-T细胞可以被CD7阳性肿瘤细胞特异性激活。
小结：本发明的主要内容是用一种新型的转染方法成功制备出转染效率较高，细胞活性较好的CD7-CAR-T细胞，并通过一系列的体外功能实验证明了制备的CD7-CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤细胞具有显著的特异的杀伤。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司
博生吉安科细胞技术有限公司
<120> 一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用
<130> P2020-0474
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccccatgg acgtgcagct gcaggaaagc ggaggaggac tggtgcaggc aggaggatct 120
ctgaggctgt cttgcgcagt gtccggatac ccctacagca gctactgcat gggttggttc 180
agacaggccc caggaaagga gagagaggga gtggccgcta tcgatagcga cggaagaacc 240
agatacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcc aggacaacgc caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaaccg gatgaagccc gaggacaccg ccatgtacta ttgcgccgct 360
cgcttcggac ctatgggttg cgtggatctg agcaccctga gctttggcca ttggggacag 420
ggaacccagg tcaccgtgtc catcactgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga 480
ggaggaggaa gcggaggagg aggatctatg gacgtgcagc tgcaggagag cggaggagga 540
ctggtgcagg caggaggatc tctgagactg tcttgcgccg tgtccggata cccttacagc 600
agctactgca tgggctggtt caggcaggct ccaggaaagg agagagaggg agtggcagcc 660
atcgatagcg acggcagaac cagatacgcc gatagcgtga agggcaggtt caccatcagc 720
caggacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgaacc ggatgaagcc cgaggatacc 780
gccatgtact attgcgccgc caggttcgga cctatgggtt gcgtggacct gagcacactg 840
agcttcggcc attggggaca gggaacacag gtcaccgtgt ccatcaccga gcagaagctg 900
atcagcgagg aggacctgaa ggacgagctg tga 933
<210> 2
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Val Gln Leu Gln Glu
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
180 185 190
Ala Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg
195 200 205
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp
210 215 220
Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
225 230 235 240
Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys
245 250 255
Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met
260 265 270
Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly
275 280 285
Thr Gln Val Thr Val Ser Ile Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
290 295 300
Asp Leu Lys Asp Glu Leu
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<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcccc 66
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtcttgcg cagtgtccgg atacccctac agcagctact gcatgggttg gttcagacag 120
gccccaggaa aggagagaga gggagtggcc gctatcgata gcgacggaag aaccagatac 180
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ctgcagatga accggatgaa gcccgaggac accgccatgt actattgcgc cgctcgcttc 300
ggacctatgg gttgcgtgga tctgagcacc ctgagctttg gccattgggg acagggaacc 360
caggtcaccg tgtccatcac t 381
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser
100 105 110
Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ile Thr
115 120 125
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct 60
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagcagaagc tgatcagcga ggaggacctg aaggacgagc tg 42
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Asp Glu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccccatgc aggtgcagct ggtggaaagc ggaggaggac tggtgcagcc aggaggatct 120
ctgagactgt cttgcgccgc cagcggctac ccctacagca gctactgcat gggttggttc 180
agacaggccc caggacaggg actggaagca gtggcagcca tcgatagcga cggcagaaca 240
cgctacgccg attccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggataccg cagtgtacta ttgcgccgcc 360
cgctttggac ctatgggttg cgtggacctg agcacactga gcttcggcca ttggggacag 420
ggaacactgg tgacagtgtc cagcgagagc aaatacggcc ctccttgccc tccttgccca 480
gccccagaat ttgagggagg acctagcgtg ttcctgttcc ctcccaagcc caaggacacc 540
ctgatgatca gccggacccc agaagtcacc tgcgtggtgg tggacgtgtc tcaggaagac 600
cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 660
cccagagagg agcagttcca gagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcat 720
caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcctagc 780
agcatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccta gagagcctca ggtgtacaca 840
ctgccccctt ctcaggagga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacttg cctcgtgaag 900
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acagtggaca aaagtcgctg gcaggagggc aacgtgttca gttgcagcgt gatgcacgag 1080
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gccgtcaaca ccgccaagaa gagcagactg accgacgtga ccctgaagag aggcaggaag 1320
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ttcagcagaa gcgccgacgc tccagcctat cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag 1500
ctgaacctgg gcaggagaga ggagtacgac gtgctggaca agaggagagg cagagaccca 1560
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aaggacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagag gagaagaggc 1680
aagggacacg acggactgta ccagggactg agcacagcca ccaaggacac atacgacgcc 1740
ctgcacatgc aggctctgcc tcctagatga 1770
<210> 12
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
275 280 285
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser
100 105 110
Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly
1 5 10 15
Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu
20
<210> 16
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 20
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
50 55 60
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
85 90 95
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
115 120 125
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
130 135 140
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
145 150 155 160
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
180 185 190
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
195 200 205
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
210 215 220
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
225 230 235 240
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
260 265 270
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
275 280 285
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
290 295 300
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
340 345 350

Claims (10)

1.一种制备CD7-CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一含T细胞的待处理样本，
(ii)分选并活化所述样本中包含的T细胞，从而得到激活的T细胞，
(iii)将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞，从而得到CD7被阻断的T细胞，和
(iv)将用于表达CD7-CAR的第二病毒载体导入到所述CD7被阻断的T细胞，从而得到所述CD7-CAR-T细胞，
其中，所述T细胞与激活剂共孵育12-36h后，较佳地，18-30h，更佳地，22-26h，将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)中，包括步骤：
(a)在适合转染的条件下，将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体与所述激活的T细胞共培养36-60h，较佳地，42-54h，更佳地，46-50h，从而得到第一转染混合液；
(b)去除所述第一转染混合液中的第一病毒载体，从而得到CD7被阻断的T细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，还包括去除步骤(ii)中所添加的激活剂的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iv)中，包括步骤：
(c)在适合转染的条件下，将用于表达CD7-CAR的第二病毒载体与所述CD7被阻断的T细胞共培养12-36h，较佳地，18-30h，更佳地，22-26h，从而得到第二转染混合液；
(d)去除所述第二转染混合液中的第二病毒载体，从而得到所述CD7-CAR-T细胞。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的第一病毒载体与T细胞的数量比(感染复数)为1:0.05-0.4。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述的第二病毒载体与T细胞的数量比(感染复数)为1:0.5-4。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iv)之后，还包括步骤：
(v)在适合T细胞扩增的条件下，对所述CD7-CAR-T细胞进行扩大培养。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
9.一种权利要求1所述方法制备的CD7-CAR-T细胞。
10.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求9所述的CD7-CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。
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