CN107496933A

CN107496933A - 一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物及其制备方法

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Publication number: CN107496933A
Application number: CN201710718048.XA
Authority: CN
Inventors: 王玉成; 邵荣光; 张代铭; 郑忠辉; 甄永苏; 周磊; 武临专; 苗庆芳; 白晓光; 何红伟; 张国宁; 王菊仙; 张胜华; 弓建华
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS; Shandong Xinhua Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS; Shandong Xinhua Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2037-08-21
Also published as: CN107496933B

Abstract

本发明提供了一种用于胰腺癌治疗的抗体药物偶联物及其制备方法，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明的抗体药物偶联物，通过利用抗EGFR单克隆抗体，采用作用机制明确的细胞毒分子美登素衍生物DM1为效应分子，以稳定型硫醚接头SMCC(4‑(马来酰亚胺基)环己烷羧酸N‑琥珀酰亚胺基酯)为偶联接头，构建了一种靶向EGFR以胰腺癌为适应症的抗体药物偶联物(LR‑DM1)。本发明对抗体药物偶联物进行了系统的体内外活性评价，与裸抗体相比，LR‑DM1在抗原水平和细胞水平具有与裸抗体相当的亲和力，并且能够被靶细胞进行有效内化。

Description

一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物及其制备方法

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物及其制备方法。

背景技术

根据国际癌症研究中心的报告，恶性肿瘤患者的数量正以每年3％～5％的速率递增，预计到2020年，全球将会有2000万癌症新发病例，死亡人数将达到1200万。在过去的30年中，我国恶性肿瘤死亡率呈显著上升趋势，已成为城乡居民的主要死因。近年来，癌症的发生趋势更加严峻，因罹患恶性肿瘤发生死亡的患者比例增长迅速，其中，胰腺癌等恶性肿瘤上升趋势显著。胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，预后极差，5年生存率低于5％。胰腺癌的发病具有很强的隐蔽性，早期诊断十分困难，多数情况下，患者确诊后，病情已发展至中晚期，这也给胰腺癌的治疗带来了很大的障碍，因此，胰腺癌又被称为“癌中之王”。

目前，胰腺癌的治疗策略主要分为三种：手术治疗、放射治疗、药物治疗。然而这些手段均存在一定的局限性。例如，由于胰腺癌发病的高度隐匿性，通常确诊时，病情已发展至中晚期，加之胰腺在解剖学上所处的位置较为复杂，周围存在着腹腔动脉、肠系膜动脉与静脉、肝动脉与门静脉等大血管，大大增加了胰腺癌手术治疗的难度和风险。

细胞毒药物治疗主要通过细胞毒类药物，抑制细胞增殖，没有针对肿瘤组织的特异靶点，只是肿瘤细胞增殖活跃肿瘤细胞对于细胞毒类药物具有相对敏感性，例如吉西他滨。即使增值率高，对化疗药物敏感，但由于少部分不敏感非增殖细胞的存在，在敏感细胞被杀灭后，原来处于非增殖状态的细胞重新进入增殖状态，常常造成肿瘤的复发。此外，增殖活跃的正常细胞也不可避免受到细胞毒化疗药物的杀伤，产生毒性，临床表现为骨髓抑制、胃肠道反应、肺毒性、心脏毒性、肝毒性、肾毒性、脱发、致癌等毒副作用。

虽然EGFR为多种癌症的检测靶点，但是目前以EGFR为靶点的抗胰腺瘤药物主要有小分子激酶抑制剂，在胰腺癌临床用药中，小分子激酶类抑制，如酪氨酸激酶抑制，发展的相对较为成熟。但是在胰腺癌靶向治疗方面，如今获批上市用于胰腺癌治疗的小分子靶向抑制剂为厄洛替尼，其在临床使用过程中发现，作用时间有限，由于酪氨酸激酶区域的二次点突变，从而导致病人对厄洛替尼产生耐药，这些患者使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗后，50％的病人会发生T790M突变，而在未曾接受过此治疗的患者中却很少发生此类突变。另外还有一种抗体类药物应用于肿瘤的治疗中，但是尚无以胰腺癌为适应症的单克隆抗体药物上市。

抗体药物偶联物(ADC)目前有应用于急性骨髓性白血病或乳腺癌等肿瘤的治疗中，但是ADC药物研究并不成熟，不同类型肿瘤存在不同的问题，例如抗体与肿瘤细胞表达的抗原特异性不高或者系统稳定性差，仍会带来系统性的毒性作用，无法有效提高总体生存率；同时抗体分子能够携带的效应分子较低，造成效能不高，杀伤力较低，不能达到杀灭肿瘤细胞的目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于胰腺癌治疗的抗体药物偶联物及其制备方法，对EGFR表达阳性的肿瘤细胞普遍具有较强的细胞增殖抑制活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物，由抗体、细胞毒性药物和偶联接头组成，所述抗体药物偶联物具有式I所示的结构：

其中，为抗EGFR单克隆抗体；

n＝2～6。

优选的，所述抗EGFR单克隆抗体的轻链具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

优选的，所述抗EGFR单克隆抗体的重链具有如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

优选的，所述抗体为人源化抗体。

优选的，n＝3～5。

本发明提供了所述的抗体药物偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1)将4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC与二甲基亚砜混合，得到偶联接头溶液；

2)将抗体与所述步骤1)得到的偶联接头溶液混合进行置换反应5～8h，得到偶连接头修饰的抗体溶液；

3)美登素衍生物和二甲胺混合，得到美登素衍生物二甲胺溶液；

4)将所述步骤3)得到的美登素衍生物二甲胺溶液滴加入所述步骤2)中得到的偶连接头修饰的抗体溶液中进行加成反应，得到抗体药物偶联物。

优选的，所述步骤2)混合时以抗体的质量为基准，所述4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC的质量为抗体质量的13～18倍。

优选的，以抗体的质量为基准，所述步骤4)美登素衍生物二甲胺溶液的添加质量为抗体质量的4～7倍。

优选的，所述步骤2)置换反应和所述步骤4)加成反应时伴随搅拌；搅拌的转速为500～700rpm。

优选的，所述步骤2)置换反应和所述步骤4)加成反应时温度优选为23～28℃。

本发明提供了一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物(ADC)。由抗体、细胞毒性药物和偶联接头组成，其中抗体的生物性质对抗体与靶细胞表面抗原的结合、抗体内化等ADC进入靶细胞的关键环节起决定性作用，肿瘤细胞特异性高表达的表面抗原作为抗体靶标，保证抗体与细胞表面抗原之间具有较高的亲和力。细胞毒性药物是ADC发挥药物活性的核心元件，具有极高的活性，同时与抗体偶联因此要具有可化学可修饰性，同时所述药物还具有水溶性，以确保弹头药物可被抗体携带进入细胞并发挥其效能。偶联接头需要具有循环系统稳定性，保证ADC到达靶细胞之前在循环系统中不发生裂解，避免释放出细胞毒分子产生毒副作用；同时在进入靶细胞之后，偶联接头需进行快速有效的断裂，以释放细胞毒分子来发挥应有的药理活性。

本发明通过利用抗EGFR单克隆抗体，采用作用机制明确的细胞毒分子美登素衍生物DM1为效应分子，以稳定型硫醚接头SMCC(4-(马来酰亚胺基)环己烷羧酸N-琥珀酰亚胺基酯)为偶联接头，构建了一种靶向EGFR以胰腺癌为适应症的抗体药物偶联物(LR-DM1)。本发明对抗体药物偶联物进行了系统的体内外活性评价，结果表明，与裸抗体相比，LR-DM1在抗原水平和细胞水平具有与裸抗体相当的亲和力，并且能够被靶细胞进行有效内化。体外细胞增殖抑制结果表明，LR-DM1对EGFR表达阳性的肿瘤细胞普遍具有细胞增殖抑制活性并且与EGFR表达量存在一定的相关性，IC₅₀可达到纳摩尔水平，其中针对人胰腺癌Capan-2细胞的抑制活性达到了7.19nM。以人胰腺癌细胞Capan-2建立的裸鼠移植瘤为模型，对LR-DM1进行了体内药效学评价，通过活体成像结果证明了药物在体内具有良好的靶向聚集作用；在为期24天的单次给药试验中，各剂量组肿瘤生长抑制作用明显，均优于阳性对照吉西他滨，10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg剂量组的肿瘤生长抑制率分别为50.0％、67.1％、77.9％；在单次给药的基础上，进行了为期40天的多次给药试验，各LR-DM1给药剂量组均表现出良好的肿瘤生长抑制作用，并且呈现出一定的剂量依赖关系。

此外，急性毒性试验结果表明，LR-DM1的LD50在300mg/kg～400mg/kg，高于给药剂量的10倍，治疗指数较高，安全性良好；通过对单次及多次给药的主要脏器及组织的病理切片进行分析，发现在治疗过程中，LR-DM1无显著的毒性蓄积作用。

本发明提供了所述的抗体药物偶联物的制备方法，所述方法能够制备得到一种稳定性好、成品率高的抗体药物偶联物。本发明提供的方法重复性好，方便简便。

附图说明

图1为实施例1中细胞毒性药物合成工艺流程；

图2为实施例2中SMCC与ADC合成工艺流程；

图3为实施例3中不同肿瘤细胞EGFR表达量；

图4为实施例4中LR-DM1体外细胞增殖抑制活性；

图5为实施例5中LR-004和LR-DM1与EGFR抗原的亲和活性；

图6为实施例6中LR-004和LR-DM1与Capan-2细胞亲和活性；

图7为实施例6中LR-004和LR-DM1与MIAPaCa2细胞亲和活性；

图8为实施例7中细胞免疫荧光法分析LR-DM1与MIA-PaCa2和Capan-2的结合活性；

图9为实施例8中细胞免疫荧光法分析MIA PaCa2对LR-DM1的内吞作用；

图10为实施例9中细胞免疫荧光法分析Capan-2细胞对LR-004和LR-DM1的内化作用；

图11为实施例10中急性毒性实验体重变化；

图12为实施例10中单次给药肿瘤生长抑制曲线；

图13为实施例10中单次给药各剂量组主要脏器病理切片；

图14为实施例11中多次给药肿瘤生长抑制曲线；

图15为实施例11中LR-DM1多次给药病理切片；

图16为实施例12中不同浓度的LR-DM1与西妥昔单抗对肿瘤生长抑制作用曲线；

图17为实施例13中LR-004对肿瘤的抑制作用；

图18为实施例13中LR-DM1对肿瘤的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供了一种用于胰腺癌治疗的抗体药物偶联物，由抗体、细胞毒性药物和偶联接头组成，具有式I所示的结构：

其中，为抗EGFR单克隆抗体；

n＝2～6。

本发明中，所述抗EGFR单克隆抗体的轻链优选具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述抗EGFR单克隆抗体的重链优选具有如序列表中SEQ ID No.2所示的重链可变区。所述抗体优选为人源化抗体。所述抗体的分子量为153kDa。所述抗EGFR单克隆抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。所述抗EGFR单克隆抗体是特异性结合于人类EGFR的N端部分的重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体。所述单克隆抗体可使用本领域中已知的方法在CHO细胞中制得。

本发明中，优选n＝3～5，更优选为n＝4。

本发明中，所述细胞毒性药物为美登素衍生物。所述偶联接头为4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC。美登素衍生物的-SH基与SMCC的双键发生加成反应，通过-S-C-键连接。与SMCC的活性酯与抗体的-NH₂之间发生竞争反应，形成酰胺键。

3)将美登素衍生物和二甲胺混合，得到美登素衍生物二甲胺溶液；

本发明将4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC与二甲基亚砜混合，得到偶联接头溶液。

本发明中，偶联接头溶液的摩尔浓度优选为20mmol/L。所述偶联接头溶液的配置方法为称取6.68mgSMCC溶解于1000μL溶剂二甲基亚砜DMSO中。溶剂DMSO能够增加SMCC的溶解性。

本发明中，4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC的来源没有限制，采用本领域技术人员所熟知的SMCC即可。

本发明中，所述SMCC的制备方法，如图2所示，接头分子4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯(SMCC)的合成采用一锅法进行，首先将反式-4-氨甲基环己甲酸与顺丁烯二酸酐在室温条件下搅拌反应，再将N-羟基琥珀酰亚胺用三氟乙酸酐活化，之后与反式-4-氨甲基环己甲酸和顺丁烯二酸酐的反应产物共同搅拌，反应液经处理后，乙醚重结晶得到接头分子SMCC产品。具体包括以下步骤：

1)在氩气保护下，将反式-4-氨甲基环己甲酸和顺丁烯二酸酐按照摩尔比为1:1的比例溶于250mL无水DMF中，反应体系呈悬浊状，室温搅拌反应6h，反应结束后，体系变为澄清。

2)反应结束后，将反应液冷却至0℃，加入2,4,6-三甲基吡啶(27.8mL，210mmol)，搅拌均匀，滴加过程中，维持体系温度在0℃。

3)另取一500mL三颈瓶，氩气保护下，将NHS(46g，400mmol)溶于250mL无水DMF中，冷却体系至0℃，逐滴加入TFAA(55.6mL，400mmol)，滴加过程中维持体系在0℃，滴加完毕后，搅拌1h，滴加2,4,6-三甲基吡啶(52.8mL，400mmol)，滴加完毕，维持0℃，搅拌30min。

4)将3中的反应液，氩气保护下，向2中的反应体系滴加，滴加过程中维持体系温度低于0℃，滴加完毕后，0℃搅拌1h，之后升至室温搅拌过夜。(HPLC监测条件：乙腈/水，5％-98％，20min，230nm，产物在11min左右出峰)

5)反应结束后，加入500mL二氯甲烷和1mol/LHCl 500mL洗涤，收集有机相，有机相再用1mol/LHCl(250mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥。

6)过滤除去硫酸镁，减压蒸除溶剂，残余用200mL乙醚打浆，最终得到白色粉末状固体30g。

得到偶连接头后，本发明将抗体溶液与所述偶联接头溶液混合进行置换反应5～8h，得到偶连接头修饰的抗体溶液。

本发明中，所述抗体的质量浓度为2.5mg/mL。本发明中，所述混合前优选更换抗体的缓冲液。所述缓冲体系为1×PBS。所述更换的方法优选为采用超滤更换。所述超滤更换的方法如下：将5mg/mL的抗体加入到截留分子量为30kDa的滤膜上，在4500rpm，4℃离心20min，离心完成后，向抗体中加入1×PBS2mL，重复上述操作2～3次，最终将抗体溶液稀释至4mL，得到抗体溶液。

本发明中，所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方法即可。

本发明中，所述混合时以抗体的质量为基准，所述4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC的质量优选为抗体质量的13～18倍，更优选为15倍。

本发明中，所述置换反应的时间优选为6～7h。所述置换反应的温度优选为23～28℃，更优选为25℃。所述置换反应优选伴随搅拌进行。所述搅拌的方法没有特殊限制采用人工或仪器搅拌即可。所述搅拌的转速优选为500～700rpm，更优选为600rpm。本发明中，所述置换反应的反应方程式如图2所示。抗体与偶联接头通过形成酰胺键连接，形成修饰后的抗体。

本发明中，所述置换反应结束后，将修饰后的抗体溶液离心，离心结束后取上清液，将修饰后的抗体溶液超滤，更换缓冲体系为1×PBS(0kDa MWCO，4500rpm，20min，4℃离心，离心完成后，加入1×PBS 2mL，重复上述操作3次，最终将裸抗体溶液稀释至4mL。所述离心的温度优选为4℃，所述离心的转速优选为15000rpm，所述离心的时间为15min。

本发明将美登素衍生物和二甲胺混合，得到美登素衍生物二甲胺溶液。

本发明中，所述美登素衍生物(DM1)的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。本发明中，所述DM1的制备方法如图1所示。首先以甲硫代甲磺酸酯和3-巯基丙酸为起始原料反应得到中间体8b(甲硫代3-巯基丙酸)，中间体8b(甲硫代3-巯基丙酸)再与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应得到活性酯中间体9b(甲硫代3-巯基丙酸琥珀酰亚胺酯)，中间体9b(甲硫代3-巯基丙酸琥珀酰亚胺酯)再与N-甲基-L-丙氨酸发生缩合反应得到中间体5b(N-甲基-L-丙氨酰基-3(2-甲基二硫代)-丙酰胺)；由固体发酵提取获得安丝菌素，安丝菌素经三甲氧基氢铝锂还原，得到关键中间体P0(美登醇)，P0(美登醇)与5b(N-甲基-L-丙氨酰基-3-(2-甲基二硫代)-丙酰胺)在二环己基碳二亚胺与无水氯化锌的作用下经过酯化反应再通过分离得到关键前体2b(N(2’)-去乙酰基-N(2’)-(3-(2-甲基二硫代-1-氧丙基)-美登素)；最后，关键前体2b经过二硫苏糖醇还原得最终目标分子DM1。

本发明中，以抗体的质量为基准，所述美登素衍生物二甲胺溶液的添加质量优选为抗体质量的4～7倍，更优选为5倍。

本发明中，所述登素衍生物二甲胺溶液的摩尔浓度优选为3～8mmol/L，更优选为5mmol/L。

得到修饰后的抗体溶液和美登素衍生物二甲胺溶液后，本发明将所述美登素衍生物二甲胺溶液加入所述修饰后的抗体溶液中进行加成反应，得到抗体药物偶联物。

本发明中，所述加入的方法优选为滴加。所述滴加的速度优选为3～5滴/min，更优选为4滴/min。每滴的体积优选为0.01～0.02ml。

本发明中，所述加成反应时温度优选为23～28℃，更优选为25℃。所述加成反应的时间优选为3～5h，更优选为4h。

本发明中，所述置换反应优选伴随搅拌进行。所述搅拌的方法没有特殊限制采用人工或仪器搅拌即可。所述搅拌的转速优选为500～700rpm，更优选为600rpm。本发明中，所述加成反应的反应方程式如图2所示。美登素衍生物的-SH基与SMCC的双键发生加成反应，通过-S-C-键连接。

本发明中，所述反应结束后，优选将反应溶液离心，取上清液，使用AKTAPurifier10蛋白质纯化系统对样品进行纯化，收集所需抗体蛋白组分。所述离心的温度优选为4℃，所述离心的转速优选为15000rpm，所述离心的时间优选为15min。

本发明中，制备得到的抗体药物偶联物在制备治疗和预防胰腺癌的药物中的应用。用法：采用静脉注射给药的方式，给药剂量10～20mg/kg，每周给药一次。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于胰腺癌治疗的抗体药物偶联物及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1安丝菌素的发酵

安丝菌素发酵所用菌株为珍贵束丝放线菌Actinosynnema pretiosum ATCC31565，中国医学科学院医药生物技术研究所提供。

纯化材料：Diamonsil C18(5μm250mm×4.6mm)色谱柱(DiKMA)

色谱乙腈(Thermo Fisher)，色谱甲醇(Thermo Fisher)。

珍贵束丝放线菌Actinosynnema pretiosum ATCC 31565菌株的固体种子培养基见表1，固体发酵培养基见表2。

表1固体种子培养基

表2固体发酵培养基

1.2珍贵束丝放线菌ATCC 31565的种子活化及培养

准备固体平板准备：将ISP2固体培养基置于微波炉中进行加热至完全融化，之后置于室温冷却至50℃，保证其流动性良好，在超净台中，将融化好的培养基倒入平皿制成平板，每个直径为9cm的平皿中倒入25mL，随后冷却至室温使其凝固。

种子活化及培养：将原先保存于25％甘油中冻存于-80℃的珍贵束丝放线菌ATCC31565孢子混悬液置于室温，待其融化后，轻柔振摇冻存管，待孢子混悬均匀后，取少量孢子混悬液滴加至ISP2种子固体培养基并涂布均匀，28℃恒温倒置培养。

1.3安丝菌素的发酵

准备固体平板：将Actinosynnema pretiosum ATCC 31565固体发酵培养基置于微波炉中进行加热至完全融化，之后置于室温冷却至50℃，保证其流动性良好，在超净台中，将融化好的培养基倒入平皿制成平板，每个直径为9cm的平皿中倒入25mL，随后冷却至室温使其凝固。

种子活化及发酵：将原先保存于25％甘油中冻存于-80℃的珍贵束丝放线菌ATCC31565孢子混悬液置于室温，待其融化后，轻柔振摇冻存管，待孢子混悬均匀后，取少量孢子混悬液滴加至ISP2种子固体培养基并涂布均匀，28℃恒温倒置培养3-4天，可观察到固体培养基表面产生均匀的黄色孢子。用适量无菌水滴于平板获取孢子制成包子混悬液，在每个发酵培养基中加入100μL孢子(孢子数量高于106个)混悬液并涂布均匀，28℃恒温培养8天。

1.4安丝菌素提取及分离纯化

将发酵8天的固体培养基均匀切成小块，置于5L三角瓶中，按培养基体积2倍量的比例加入乙酸乙酯，封口避光静置12h，静置期间每3h振摇一次，使固体培养基小块在乙酸乙酯中均匀分布，充分萃取，收集有机相。继续加入乙酸乙酯，重复上述操作。萃取三次后，合并有机相，减压蒸除溶剂，得安丝菌素膏状粗提物。

用乙酸乙酯对粗提物进行复溶，4000rpm离心15min，取上清液，沉淀用乙酸乙酯洗涤5次，收集有机相并与之前的上清合并，减压浓缩，蒸除溶剂后，对粗提物用100-200目硅胶制样，对样品进行柱层析分离。层析分离条件：采用Buchi中压正相分离系统，200-300目硅胶正相分离柱，采用石油醚/乙酸乙酯体系对样品进行梯度洗脱，洗脱时，先用石油醚完全浸润层析柱，之后采用30％EA 0.5L，45％EA 0.5L，60％EA 0.5L，70％EA 0.5L，80％EA1L，90％EA 1L的梯度进行洗脱。收集所需组分进行TLC检测。对收集组分进行浓缩，减压蒸除溶剂，得深棕色泡沫状固体，对固体进行HPLC检测，HPLC检测方法为：色谱系统Agilent1260，色谱柱为Diamonsil C18(5μm250mm×4.6mm)，流动相为乙腈-水：40％-65％，25min，流速1mL/min，检测波长230nm，检测结果安安丝菌素总含量为90.98％。

实施例2

1实验仪器

熔点用梅特勒-托利多MP70型熔点仪测定，温度未经校正；2F-2D暗箱式紫外分析仪(巩义予华)；中压Flash柱层析分离仪器(Companion Rf200，Teledyne ISCO)。质谱用Autospee Ultima-Tof型质谱仪；核磁共振氢谱和碳谱在Varian Mercury-400、INOVA-500、INOVA-501和SYS-600MHz型质谱仪上测定，四甲基硅烷(TMS)为内标。

2实验试剂

化学试剂：若无特殊说明，所有试剂均为市售CP或AR级，不经处理直接使用。

层析硅胶：青岛海洋化工厂硅胶，100-140目及200-300目。

TLC薄层板：美国Merck公司硅胶60GF254铝箔板，监测手段为紫外灯显示，I2显色。

3实验操作

3.1DM1的制备(图1所示)

1)8b的合成

将7b 3-巯基丙酸(5.06g，47mmol)溶于150mL水中，冰浴搅拌5min。将CH3SO2SCH3(6.54g，52mmol)溶于75mL绝对无水乙醇中，冰浴下向7b的水溶液中缓慢滴加，滴加完毕后室温搅拌过夜(检测反应TLC二氯甲烷:甲醇＝20:1)。反应完毕后，混合体系用400mL饱和食盐水溶液稀释，乙醚(150mL×3)萃取，合并有机相，有机相用150mL饱和食盐水洗涤后，无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，减压蒸除溶剂后，得到白色固体8b6.5g，产物无需纯化直接进行下一步反应。

2)9b的合成

反应在Ar保护下进行。将8b(6.5g，42.7mmol)溶于50mL无水二氯甲烷中，搅拌均匀，体系成悬浊状。加入EDCI(12.1g，63.3mmol)搅拌，体系由悬浊变为澄清后，搅拌10min。加入N-羟基琥珀酰亚胺(7.17g，62.3mmol)混合体系在Ar保护下搅拌过夜。反应结束后，浓缩反应体系，加入100mL乙酸乙酯，有机相用50mmol/LpH＝6.0磷酸钾缓冲溶液(50mL×3)洗涤，收集有机相，有机相用50mL饱和食盐水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥。干燥结束后，旋蒸除去溶剂，得油状物9b9.33g，粗品无需纯化直接进行下一步反应。

3)5b的合成

配制200mL乙二醇二甲醚水溶液(乙二醇二甲醚：水＝1:1)，将N-甲基-L-丙氨酸(3.85g，37.4mmol)溶于100mL乙二醇二甲醚水溶液中。向反应体系中加入14.5g三乙胺，剧烈搅拌5min。将9b(9.33g，37.4mmol)溶于80mL乙二醇二甲醚水溶液中，至于恒压滴液漏斗中向反应体系中缓慢滴加，10min内滴完，滴加过程中，反应体系逐渐变黄，滴加完毕后搅拌过夜。反应结束后，浓缩反应体系到约100mL，加入25mL去离子水，并用6mol/LHCl调节pH＝2.0，体系变浑浊。用乙酸乙酯萃取(80mL×3)，合并有机相，有机相用25mL饱和食盐水溶液洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥。浓缩滤液，得到黄色油状物5.32g浓缩有机相后对样品进行柱层析分离，流动相为PE:EA＝1:1，收集所需组分，合并浓缩，得到白色固体1.12g。

4)P0美登醇的制备

LiAlH(OMe)₃的制备

取250mL三颈瓶，配温度计、磁子、50mL恒压滴液漏斗、三通、橡胶塞、Ar气球，搭好反应装置，用Ar气反复置换三颈瓶内的空气。用一次性针管抽取1MLiAlH4的四氢呋喃溶液(54mL，54mmol)加入三颈瓶中。向恒压滴液漏斗中加入30mL无水四氢呋喃(30mL)和无水甲醇(6.6mL，162mmol)。将装置置于-50℃冷阱中搅拌，待内温降至-40℃后，开始缓慢滴加无水甲醇的四氢呋喃溶液，滴加过程中有气体放出，维持内温-30℃～-40℃。滴加完毕后，搅拌反应1h，得到澄清LiAlH(OMe)₃溶液，保持内温-30℃～-40℃备用。

P0的制备

取500mL三颈瓶，配温度计、磁子、250mL恒压滴液漏斗、三通、橡胶塞、Ar气球，搭好装置，反复用Ar置换三颈瓶内的空气。将2000mg安丝菌素完全溶于50mL无水四氢呋喃中。用一次性针管，将安丝菌素的四氢呋喃溶液转移至500mL三颈瓶中，磁力搅拌，低温冷却使内温降至-40℃。用一次性长针管吸取新制的LiAlH(OMe)₃溶液(60mL，38.4mmol)置于恒压滴液漏斗中，滴加时注意控制内温，保持内温维持在-30℃～-40℃，滴加完毕后，-40℃搅拌5h。反应完全后，取18mL去离子水，经恒压滴液漏斗向反应体系内缓慢滴加，滴加过程中，维持内温-30℃～-40℃，滴加完毕，搅拌10min。将88％的甲酸2000mg和180mL乙酸乙酯均匀混合，加入恒压滴液漏斗中，向反应体系内缓慢滴加，滴加过程中，快速搅拌，维持内温-30℃～-40℃，滴加完毕，搅拌10min，升至室温，抽滤，滤饼用二氯甲烷淋洗(30mL×5)，滤液35℃减压蒸除溶剂，得淡黄色P0固体粗品约1.5g。(通常情况下，直接进行下一步反应，若柱层析，流动相CH₂Cl₂:CH₃OH＝50:1)。收率：84.4％，熔点：205-208℃。

MS-ESI(m/z):565.3(M+H⁺)。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.07(d,J＝1.8Hz,1H),6.80(d,J＝1.8Hz,1H),6.46–6.43(m,1H),6.43–6.39(m,1H),6.13(d,J＝10.8Hz,1H),5.52(dd,J＝15.3,9.2Hz,1H),4.48–4.29(m,1H),4.11(q,J＝7.2Hz,1H),3.97(s,3H),3.53–3.43(m,3H),3.34(s,3H),3.19(s,3H),2.59(d,J＝9.9Hz,1H),2.40–2.19(m,2H),2.16–1.99(m,2H),1.67(s,3H),1.41–1.16(m,6H),0.83(s,3H).

¹³C-NMR(151MHz,CDCl₃)δ(ppm)171.90,155.50,152.71,142.18,140.10,138.77,133.23,126.86,125.03,123.60,118.46,112.61,88.90,81.04,75.61,75.10,66.58,63.12,60.37,56.60,56.50,46.94,37.69,35.98,35.55,35.40,15.71,14.50,11.11.

5)L-DM1SSMe的合成

将P0(1500mg，2.65mmol)，5b(3775mg，15.93mmol)完全溶于100mL无水二氯甲烷中，Ar保护下搅拌。将DCC(3446mg，16.73mmol)溶于30mL无水二氯甲烷中，之后将DCC的二氯甲烷溶液加入反应体系，Ar保护下继续搅拌30min。向反应体系中加入1mol/LZnCl₂的乙醚溶液(3.5ml，3.5mmol)，加入ZnCl₂后体系出现黄色浑浊，室温搅拌反应过夜。反应结束后，向体系中加入100mL乙酸乙酯，搅拌后抽滤，滤液用饱和NaHCO₃溶液洗涤(50mL×3)，收集有机相，有机相用NaCl饱和溶液洗涤(30mL×3)，收集有机相，无水硫酸钠干燥。干燥后，过滤除去硫酸钠，滤液中加入硅胶对样品进行柱层析分离，流动相CH₂Cl₂:CH₃OH＝60:1，最终得到淡黄色固体750mg。

收率：36.1％，熔点：169-171℃。

MS-ESI(m/z):784.4(M+H⁺),806.4(M+Na⁺)。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ(ppm)6.80(d,J＝1.8Hz,1H),6.69(d,J＝11.2Hz,1H),6.61(d,J＝1.8Hz,1H),6.33(s,1H),5.64(dd,J＝15.4,9.1Hz,1H),5.38(d,J＝6.9Hz,1H),4.75(dd,J＝12.1,3.0Hz,1H),4.31–4.20(m,1H),4.09(q,J＝7.1Hz,1H),3.96(d,J＝6.2Hz,4H),3.65(d,J＝12.9Hz,3H),3.58–3.39(m,3H),3.34(d,J＝5.1Hz,4H),3.21(s,3H),2.84(s,3H),2.24(s,3H),1.61(s,3H),1.25(ddt,J＝21.8,9.4,4.4Hz,12H),0.78(s,3H).

¹³C-NMR(151MHz,CDCl₃)δ(ppm)170.84,170.69,168.78,155.89,152.39,142.03,140.98,139.25,133.26,127.59,125.28,122.09,118.66,113.08,88.43,80.78,78.12,74.12,67.15,59.91,56.62,56.54,52.37,46.54,38.77,36.11,35.54,33.44,32.35,32.00,30.65,22.48,15.48,14.54,13.29,12.07.

6)DM1的合成

在Ar保护下，将DM1SSMe(320mg，0.41mmol)溶于甲醇/乙酸乙酯混合溶液中(甲醇:乙酸乙酯＝3:2)，搅拌均匀，之后向其中加入DTT(154mg，1mmol，磷酸钾缓冲液50mL)的磷酸钾缓冲溶液(50mmol/L磷酸钾2mmol/L EDTApH＝7.5缓冲液)，加入完毕后，室温搅拌反应10h。反应结束后，反应液用100mL0.2mol/L磷酸钾缓冲液洗涤(pH＝6.0)，洗涤结束后，混合液用乙酸乙酯萃取(150mL×5)，萃取结束后，合并有机相，并用150mL饱和食盐水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥。干燥结束后，浓缩样品，对样品进行柱层析分离(CH₂Cl₂:CH3OH＝60:1)，最终收集所需组分，合并，减压蒸除溶剂得到白色粉末280mg。

收率：92.5％，熔点：190-192℃。

MS-ESI(m/z):738.4(M+H⁺),760.4(M+Na⁺)

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)6.82(d,J＝1.7Hz,1H),6.72(d,J＝11.1Hz,1H),6.67(d,J＝1.7Hz,1H),6.44(dd,J＝15.3,11.2Hz,1H),6.24(s,1H),5.64(dd,J＝15.4,9.1Hz,1H),5.42(q,J＝6.8Hz,1H),4.77(dd,J＝12.0,3.1Hz,1H),4.36–4.23(m,1H),3.98(s,3H),3.74–3.63(m,1H),3.51(d,J＝9.0Hz,1H),3.36(s,3H),3.21(s,3H),3.11(d,J＝12.6Hz,1H),3.05–3.00(m,1H),2.85(s,3H),2.82–2.68(m,3H),2.65–2.50(m,2H),2.19(dd,J＝14.4,3.0Hz,1H),1.72–1.67(m,1H),1.66(d,J＝6.1Hz,3H),1.43(s,3H),1.37–1.26(m,6H),0.89–0.83(m,1H),0.80(s,3H).

¹³C-NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)170.74,170.69,168.73,155.95,152.16,142.12,140.90,139.46,133.34,127.52,125.22,122.26,118.79,113.13,88.47,80.86,78.19,74.11,67.22,59.92,56.64,52.34,46.57,38.88,37.69,36.08,35.48,32.39,30.70,26.92,19.79,15.52,14.59,13.41,12.08。

3.2SMCC的制备

1)在氩气保护下，将反式-4-氨甲基环己甲酸(15.7g，100mmol)和顺丁烯二酸酐(9.8g，100mmol)溶于250mL无水DMF中，反应体系呈悬浊状，室温搅拌反应6h，反应结束后，体系变为澄清。

4)将3中的反应液，氩气保护下，向2中的反应体系滴加，滴加过程中维持体系温度低于0℃，滴加完毕后，0℃搅拌1h，之后升至室温搅拌过夜。(HPLC监测条件：乙腈/水，5％-98％，20min，230nm，产物在11min左右出峰)。

5)反应结束后，加入500mL二氯甲烷和1mol/L HCl 500mL洗涤，收集有机相，有机相再用1mol/LHCl(250mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥。

6)过滤除去硫酸镁，减压蒸除溶剂，残余用200mL乙醚打浆，最终得到白色粉末状固体30g。收率：89.8％，熔点：160-162℃。

MS-ESI(m/z):357.5(M+Na⁺)。

1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.71(s,2H),3.39(d,J＝7.0Hz,2H),2.83(s,4H),2.65–2.50(m,1H),2.26–2.06(m,2H),1.85–1.65(m,3H),1.53(qd,J＝13.2,3.3Hz,2H),1.06(qd,J＝13.1,3.4Hz,2H)。

经质谱检测，LR-DM1的平均偶联率为3.6，即平均每个抗体分子上连接约3.6个细胞毒效应分子。

实施例3

体外细胞增殖抑制活性实验，具体的检测EGFR表达量的方法如下：

1)收集实验所需的经过处理的细胞SU86.86(胰腺癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、AsPC-1(胰腺癌细胞)、Capan-2(胰腺癌细胞)、A549(肺癌细胞)、Caco-2(结肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HCT-116(结肠癌细胞)，用预冷的1×PBS缓冲液冲洗细胞样品，加入适量的细胞裂解液celllysis buffer(Cell Signaling Technology)，裂解液中按1:100加入Protease Inhibitor Cocktail(Calbiochem,Novagen,Novabiochem)。立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30min。裂解后，于4℃，12,000rpm离心15min，收集上清于新的EP管中。用BCA试剂盒测定蛋白含量。将样品与5×上样缓冲液按1:4混合，煮沸10min，离心取上清。总蛋白的上样量为15μg。用移液枪吸取处理好的样品，缓慢加至加样孔内。开始电泳，待样品完成浓缩步骤，由80V调至120V。

2)电泳结束后，转膜。剪取对应大小的PVDF膜(Millipore Corp.,Bedford,MA,USA)，在甲醇中浸泡1min后，置于蒸馏水中。凝胶要尽量放正，用玻璃棒去除气泡(小心操作，注意勿将凝胶弄碎)。根据蛋白marker判断上样的顺序，并将PVDF膜完全覆盖于凝胶上。转印膜上依次叠放浸润好的三层滤纸和一层海绵，合上转膜夹。根据目的蛋白性质设定转膜电流及转膜时间，开始转膜，一般转膜时间为在200mA下转膜2h。

3)配制5％脱脂奶粉封闭，摇床孵育0.5h以上或孵育过夜。根据蛋白marker指示的分子量，裁剪PVDF膜。PVDF膜放入杂交袋中，加入用1％BSA稀释好的一抗溶液(稀释比例视抗体的具体浓度而定)，4℃摇床过夜或常温下2h。次日用PBST缓冲液冲洗3次，每次10min。之后加入用1％BSA稀释好的二抗溶液(稀释比例为1:3000)，摇床孵育1h。PBST缓冲液冲洗3次，每次10min。膜上滴加ECL发光液(Millipore)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统凝胶成像仪捕获图像。

不同肿瘤细胞EGFR表达量见图3。由图3所示，肿瘤细胞EGFR表达量跟颜色直接关系，颜色深说明EGFR表达量较高，SU86.86代表胰腺癌细胞，由图3可知，胰腺癌细胞中大量表达EGFR。

实施例4

结合实施例3中获得的肿瘤细胞EGFR表达量的结果，对这些肿瘤细胞具体为细胞SU86.86(胰腺癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、AsPC-1(胰腺癌细胞)、Capan-2(胰腺癌细胞)、A549(肺癌细胞)、Caco-2(结肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HCT-116(结肠癌细胞)，进行了裸抗体LR-004及抗体药物偶联物LR-DM1的体外细胞增殖抑制活性评价，具体步骤如下：1)根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的贴壁肿瘤细胞以200μL/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24h后加药，每个浓度设3复孔。并设相应浓度的PBS缓冲液对照及无调零细胞孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48h。

2)取出培养板，每孔先加入200μL1×PBS缓冲液，再加入50％(m/v)的三氯乙酸50μL固定细胞，使三氯乙酸的终浓度为10％，4℃放置1h。再放入4℃冰箱中1h。

3)弃去固定液，用蒸馏水洗涤5次，室温下自然风干。

4)干燥结束后，每孔加入磺酰罗丹明溶液100μL，室温下放置10-30min。

5)弃去上清液，用1％醋酸洗涤5次，室温下空气中干燥。

6)加入150μL/孔Tris溶液，平板振荡器上振荡5min。

7)酶标仪检测吸光值(OD)，用空白对照调零。波长515nm。

8)根据公式计算肿瘤细胞生长抑制率：

根据各浓度抑制率，采用Logit法计算半数抑制浓度IC₅₀。重复上述实验2—3次，求出2—3次实验的IC₅₀平均值作为最终值。

结果如图4所示。

由图4可知，LR-DM1的活性与EGFR的表达量存在一定的相关性，EGFR表达量相对较高的肿瘤细胞系对ADC样品更为敏感。裸抗体对于细胞的抑制作用则十分有限，在细胞增殖活性测定的最高给药浓度0.5mg/mL的浓度下，裸抗体对所有被测细胞的抑制率均小于50％(表3)。在所有被测细胞中，胰腺癌细胞Capan-2对于ADC样品最为敏感，ADC样品对于Capan-2细胞的IC₅₀达到了7.19nM。

表3 LR-DM1体外细胞增殖抑制活性

实施例5

为了验证裸抗体LR-004及ADC样品LR-DM1对于EGFR抗原以及靶细胞的亲和力，首先采用了ELISA的方法对裸抗体及ADC样品进行了抗原水平的亲和活性测定。

1)抗原包被：取EGFR抗原原液(200μg/mL，100×)，用PBS缓冲液稀释至2μg/mL。将EGFR稀释液加入到96孔板中，50μL/孔，4℃包被过夜，PBS缓冲液洗板3次。

2)每孔加入封闭液(PBS:2％BSA)250μL，37℃孵育1h。

3)用PBST缓冲液(含0.05％Tween20的PBS缓冲液)洗板3次。取LR-004和LR-DM1，将起始浓度调整成为1μmol/L。向96孔板中，每孔加入100μL用PBS缓冲液连续4倍稀释的抗体。每个样品平行做两份，PBS缓冲液为阴性对照，37℃孵育2h。

4)用PBST缓冲液洗板3次，每孔种加入用封闭液1:10000倍稀释的HRP标记的抗人F(ab’)2二抗100μL，37℃孵育1h。

5)显色反应：PBST缓冲液洗板3次，蒸馏水洗2次。每孔加入新鲜配制的TMB底物溶液100μL，37℃孵育10min，至显出蓝色。

6)终止反应：每孔加入等体积1MH₂SO₄，颜色变黄。30min内在450nm处测定吸光值(OD450)。

用EGFR抗原包被酶标板，比较不同浓度的LR004裸抗体与LR-DM1 ADC样品与EGFR抗原的亲和力，结果如图5所示。由图5可知，LR-004和LR-DM1与EGFR抗原的亲和力相当。

实施例6

细胞水平考察裸抗体LR-004和ADC样品LR-DM1对EGFR表达阳性的胰腺癌细胞的亲和活性。采用MIA PaCa2和Capan-2细胞分别铺细胞板，比较不同浓度下LR-004和LR-DM1与细胞的亲和力。具体测定抗体与细胞亲和力的方法步骤如下：

1)细胞固定：将两种细胞按4×10⁴/孔的密度接种至96孔培养板，培养24h后PBS缓冲液润洗2次，加入预冷的4％甲醛50μL(PBS配置)于4℃，固定30min。固定好的细胞PBS缓冲液润洗3次，每次5min。

2)采用BSA封闭非特异性结合位点。每孔加入200μL的1％BSA/PBS溶液，4℃封闭过夜。

3)PBST缓冲液(PBS中加入0.05％的Tween-20)润洗3次，每次5min，200μL/孔。分别加入不同浓度的LR-004和LR-DM1抗体(PBS稀释)，50μL/孔，每个浓度设3个平行孔。37℃孵育2h。

4)PBST缓冲液洗板5次，每次3min，然后加入抗人IgG(1:2000稀释)，50μL/孔，于37℃孵育1h。

6)终止反应：每孔加入等体积1M H₂SO₄，颜色变黄。30min内酶标仪在450nm处测定吸光值。

结果如图6所示。由图6可以看出，LR004和LR-DM1与MIA PaCa2和Capan-2分别具有基本相当的亲和力。

实施例7

采用细胞免疫荧光法测定了抗体和ADC样品的结合活性，以及内吞活性。

1)细胞固定：将两种细胞按4(10⁴/孔的密度接种至96孔培养板，培养24h后PBS缓冲液润洗2次，加入预冷的4％甲醛50μL(PBS配置)于4℃，固定30min。固定好的细胞PBS缓冲液润洗3次，每次5min。

6)终止反应：每孔加入等体积1MH₂SO₄，颜色变黄。30min内酶标仪在450nm处测定吸光值。

相同浓度的ADC样品分别与MIA PaCa2和Capan-2共同孵育，用FITC标记的抗人IgG二抗进行免疫反应，在荧光显微镜下可以观察到，LR-DM1可以与MIA PaCa2和Capan-2细胞表面受体结合，在细胞膜呈现出较强的绿色荧光，更加直观的证明了ADC样品与靶细胞的结合作用(图7)。

实施例8

将ADC样品与MIA PaCa2在不同条件下共同孵育，之后用FITC标记的抗人IgG二抗进行免疫反应，再用Hoechst33342对细胞核进行复染料。结果显示，在4℃下LR-DM1仅结合在细胞表面，在37℃温育24h后，在细胞质中可以观察到较强的绿色荧光，表明ADC样品LR-DM1可被靶细胞内吞进入细胞质中。细胞可对ADC分子进行有效的内吞，这是决定ADC发挥杀伤作用的关键(图8)。

将LR-004和LR-DM1直接用荧光素标记，与Capan-2细胞37℃恒温孵育24h后，用台盼蓝处理细胞，淬灭细胞外荧光后，荧光显微镜观察，结果显示，LR-004与LR-DM1作用于细胞后，Capan-2细胞中均出现了较强的绿色荧光，这表明，Capan-2对LR-004和LR-DM1都体现出了较好的内吞活性(图9)。

实施例9

选择胰腺癌Capan-2细胞进行裸鼠移植瘤模型的建立，对ADC样品进行体内活性评价

对Capan-2荷瘤裸鼠进行急性毒性评价。选用体重在18-22g的BALB/cnu/nu品系雌性裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)2只，建立Capan-2移植瘤传代模型；将人胰腺癌Capan-2细胞接种于裸鼠右腋下，每只接种1×10⁷个细胞。饲养裸鼠至瘤块体积生长为1000mm³左右时，采用颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，于超净台无菌条件下取出皮下生长的瘤块，修剪去除瘤块包膜及外周部分存在的坏死组织，将整个剥离瘤块在生理盐水中剪成体积约2mm³大小的瘤块，并用套管针将小瘤块移植于每只裸鼠右腋皮下，火棉胶粘住切口。饲养接种后的裸鼠至瘤块生长至约200mm³时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，在尽可能保证每组平均值不出现较大差异的情况下，每组挑选3只移植瘤裸鼠。将LR-DM1按照100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg设置给药剂量组。给药剂量组裸鼠均按照设定剂量采用尾静脉注射方式给药。给药后对荷瘤裸鼠SPF级动物实验室进行隔离饲养，持续14天，实验饲养期间，每日对实验裸鼠进行观察，记录实验过程中裸鼠的体重变化。

当给药剂量小于等于300mg/kg时，所有实验动物均存活，且生存状态良好，在实验过程中，300mg/kg及以下剂量组实验动物平均体重均呈现平稳增加的趋势(图11)。

表4 LR-DM1对Capan-2荷瘤裸鼠急性毒性结果

同时结果如表4所示，300mg/kg以下剂量组，所有荷瘤小鼠均存活，400mg/kg剂量组有一只存活，而500mg/kg以上剂量组所有试验动物全部死亡，初步推测，ADC样品的半数致死剂量(LD₅₀)约在300～400mg/kg。

实施例10

以Capan-2荷瘤裸鼠为试验模型，在单次给药的药效学评价试验中设置了10mg/kgLR-DM1、15mg/kg LR-DM1、20mg/kg LR-DM1、20mg/kg吉西他滨、空白对照五个试验组，每组7只试验动物，通过尾静脉注射的方式对试验动物进行给药处理，之后进行为期24天的饲养和观察，记录荷瘤小鼠的肿瘤体积变化情况，绘制肿瘤生长曲线。

结果表明(图12)，在给药初期(10天之内)，与空白对照和吉西他滨组相比，10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg三个剂量组对肿瘤的生长均表现出了较强的抑制作用。而在大约10天之后，随着给药剂量的不同，对肿瘤生长的抑制作用开始出现分化，呈现一定的剂量的依赖性，高剂量20mg/kg剂量组对肿瘤生长继续保持较强的抑制作用直至第20天，15mg/kg剂量组对肿瘤的生长抑制作用有所减弱，10mg/kg剂量组的肿瘤体积则出现了较为明显的反弹。

在第24天试验终止后，将各组试验小鼠处死后剥离肿瘤瘤块，对其瘤重进行测量，结果如图所示(图13)，三个给药剂量组对荷瘤小鼠具有明显的肿瘤生长抑制作用，而且呈现一定的剂量依赖关系，随着给药剂量的增大，肿瘤生长抑制效果也越明显。并根据公式：

对抑瘤率进行了计算，结果如表所示(表5)，20mg/kg、15mg/kg、10mg/kg剂量组的抑瘤率分别达到了77.90％、65.11％、50.00％。上述结果证明，ADC样品在单次给药试验中，可对肿瘤的生长产生明显的抑制作用，并且呈现一定的剂量依赖性。综合急性毒性的试验结果，ADC样品的半数致死剂量为300～400mg/kg，而治疗组的最高给药剂量为20mg/kg，半数致死剂量为治疗给药剂量的10倍，ADC样品具有较高的治疗指数。

表5单次给药各剂量组肿瘤抑制率

剂量组	瘤重(g)	抑制率(％)
			对照组	0.86	-
20mg/kg吉西他滨组	0.73	15.12
			10mg/kg LR-DM1	0.43	50.00
15mg/kg LR-DM1	0.30	65.11
			20mg/kg LR-DM1	0.19	77.90

单次给药试验结束，采集各LR-DM1给药剂量组试验小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、骨组织标本，进行病理切片的分析。结果表明(图14)，与空白对照组相比，各剂量组的心肌细胞、肝细胞的细胞核未见显著变化，脾脏红髓与白髓细胞聚集紧密未见疏松，肺泡腔支气管未见增厚，肾小球远曲小管均形态正常，小肠基底膜及绒毛上皮细胞未出现显著性差异，骨组织中骨密度、有核红细胞、巨核细胞均正常，所有比对结果均表明，与空白对照相比，各给药剂量组均未出现显著的毒性聚集，显示出ADC在对荷瘤小鼠进行治疗的过程中安全性良好，无病理性毒性蓄积。

实施例11

同样以Capan-2荷瘤裸鼠为模型，进行了为期40天的多次给药试验，多次给药试验中设置了LR-DM1 10mg/kg、LR-DM1 20mg/kg、LR-004 20mg/kg、吉西他滨20mg/kg以及空白对照五个试验组。同样采用尾静脉注射的给药方式，连续三次给药，每次给药间隔1周，从第一次给药开始，SPF级动物房饲养40天，记录肿瘤体积变化情况，并绘制肿瘤生长曲线。结果表明(图10)，在给药期间，各给药剂量组对肿瘤的生长具有持续且非常显著的抑制作用，与裸抗体和空白对照相比，距第一次给药3周(21天)内，LR-DM1两个剂量组的肿瘤生长被完全抑制。在给药三周(21天)之后，10mg/kg剂量组略有反弹，而20mg/kg剂量组仍然保持对肿瘤生长显著的抑制作用。多次给药试验进行至40天时，两个给药剂量组与裸抗LR-004、吉西他滨组、空白对照组相比，肿瘤生长被明显抑制，而且20mg/kg LR-DM1剂量组对肿瘤生长的抑制作用强于10mg/kg LR-DM1剂量组。

多次给药试验结束后，仍然采集各LR-DM1给药剂量组试验小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、骨组织标本，进行病理切片的分析，结果表明(图11)，以空白对照组为标准，给LR-DM1治疗的各剂量组的小鼠的心肌细胞、肝细胞细胞核为发生明显的改变，脾脏红髓与白髓细胞聚集状态紧密未见疏松，肺泡腔支气管厚度正常，肾小球及远曲小管形态均保持正常，小肠绒毛上皮细胞形态变异，骨组织中骨密度、有核红细胞、巨核细胞形态未发生显著改变，所有比对结果均表明，与空白对照相比，裸抗体及ADC各给药剂量组均未出现显著的毒性聚集。多次给药的结果证实了在对荷瘤小鼠进行多次给药治疗的过程中，ADC安全性良好，未发现理性毒性蓄积。

通过对单次给药和多次给药的病理切片结果进行对比分析，发现LR-DM1在治疗过程中并未引起试验动物主要脏器和组织的显著异常改变，未表现出显著的毒性蓄积作用。

实施例12

西妥昔单抗为如今已经上市的用于EGFR表达阳性实体肿瘤的抗体类肿瘤治疗药物。以Capan-2荷瘤裸鼠为模型，设置了LR-DM1 10mg/kg、LR-DM1 20mg/kg、西妥昔单抗20mg/kg以及空白对照四个试验组。待移植瘤生长至约200mm³时，采用尾静脉注射的给药方式，连续三次给药，每次给药间隔1周，从第一次给药开始，SPF级动物房饲养40天，记录肿瘤体积变化情况，并绘制肿瘤生长曲线。结果表明(图16)，在给药期间，LR-DM1各给药剂量组对肿瘤的生长具有持续且非常显著的抑制作用，且显著强于阳性对照西妥昔单抗。

实施例13

分别以BALB/c nu/nu品系雌性裸鼠建立HCT-116结肠癌细胞荷瘤小鼠、A549肺癌细胞荷瘤小鼠、Capan-2胰腺癌细胞荷瘤小鼠模型，待移植瘤生长至约200mm³时，每组8只随机分组，以20mg/kgLR-004剂量，尾静脉注射方式，每周对实验模型两次给药持续3周，从第一次给药时起持续观察28天，记录肿瘤体积变化情况。实验结束后，对各组试验小鼠进行脱颈处理，以肿瘤体积计算抑瘤率，结果表明(图17)，在给药期间，LR-004对各荷瘤动物模型均具有肿瘤生长抑制作用。

分别以BALB/c nu/nu品系雌性裸鼠建立HCT-116结肠癌细胞荷瘤小鼠、A549肺癌细胞荷瘤小鼠、Capan-2胰腺癌细胞荷瘤小鼠模型，待移植瘤生长至约200mm³时，每组8只随机分组，以20mg/kgLR-DM1剂量，尾静脉注射方式给药一次，观察21天记录肿瘤体积变化情况。实验结束后，对各组试验小鼠进行脱颈处理，以肿瘤体积计算抑瘤率，结果表明(图18)，在给药期间，LR-DM1对各荷瘤动物模型均具有显著肿瘤生长抑制作用，并且对于胰腺癌Capan-2荷瘤小鼠作用最为敏感。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物及其制备方法

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

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<211> 1267

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Leu Gly Leu Asn Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu

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Tyr Leu Tyr Ser

1265

Claims

1.一种用于治疗胰腺癌的抗体药物偶联物，由抗体、细胞毒性药物和偶联接头组成，其特征在于，所述抗体药物偶联物具有式I所示的结构：

其中，为抗EGFR单克隆抗体；

n＝2～6。

2.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗EGFR单克隆抗体的轻链具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗EGFR单克隆抗体的重链具有如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。

5.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，n＝3～5。

6.权利要求1～5任意一项所述的抗体药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤2)混合时以抗体的质量为基准，所述4-(马来酰亚胺甲基)-环己甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯SMCC的质量为抗体质量的13～18倍。

8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，以抗体的质量为基准，所述步骤4)美登素衍生物二甲胺溶液的添加质量为抗体质量的4～7倍。

9.根据权利要求6～8任意一项所述制备方法，其特征在于，所述步骤2)置换反应和所述步骤4)加成反应时伴随搅拌；搅拌的转速为500～700rpm。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述步骤2)置换反应和所述步骤4)加成反应时的温度为23～28℃。