CN109893531A - 甘草次酸在制备治疗肺动脉高压药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘草次酸(18β－glycyrrhetinic acid)作为治疗肺动脉高压药物的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时，剂量为160μM的苦豆碱可以显著抑制人肺动脉平滑肌细胞的增殖和DNA合成，阻滞细胞由G0/G1期进入S期，显著降低RhoA－ROCK信号通路相关蛋白的表达，证明甘草次酸对肺动脉高压具有治疗作用。

Description

甘草次酸在制备治疗肺动脉高压药物中的用途

技术领域

本发明涉及甘草次酸的应用，特别涉及甘草次酸作为治疗肺动脉高压药物的用途。

背景技术

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一组以肺动脉压力、肺血管阻力进行性增高，最终导致右心衰竭为特征的临床综合征。肺动脉高压的临床判断标准是人体在安静状态下的肺动脉平均压大于25mmHg，运动状态下的肺动脉平均压大于30mmHg。该类疾病主要可以分为动脉型肺动脉高压、左心相关疾病所致肺动脉高压、肺部疾病和低氧所致肺动脉高压、慢性血栓栓塞性肺动脉高压和由血液系统疾病、代谢性疾病等疾病所致等几种类型。目前肺动脉高压常巧药物只能改善症状，但不能延缓其发展过程，其发病机制复杂，预后差，因此深入研究其发病机制、病理生理、分子生物学等方面的研究进展，探索新的治疗手段，对进一步提高肺动脉高压患者的治疗效果和生活质量具有重要的意义。

目前研究认为血管收缩、血管重构和原位血栓是肺动脉高压发生、发展的重要病理生理基础。其中，血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板等细胞的异常状态都与疾病的形成有关；血管收缩因子和血管舒张因子、促进增殖因子和抑制增殖因子、促凝物质和抗凝物质等多种血管活性物质的失衡促进其发生；而遗传因素在部分肺动脉高压发病机制中的作用更日益受到重视。

甘草(leguminosae)是一种传统的中草药，在宁夏有大量的野生和人工种植资源，几百年来，它已被广泛用于中药的实践中。甘草含有主要的生物活性三萜糖苷甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)，具有多种药理活性，如抗氧化，抗癌和抗炎活性。已经在动物的各种条件下证明了甘草次酸在改善肺功能方面的生物学作用；例如甘草次酸通过抑制炎症减轻小鼠的辐射诱导的肺损伤和肺纤维化。甘草次酸对心血管系统的药理作用是本课题组长期以来一直关注的科学问题，我们前期的研究发现：甘草次酸对野百合碱诱导的肺动脉高压具有保护作用。然而甘草次酸是否对肺动脉平滑肌细胞的增殖具有抑制作用，其作用机制如何，目前未见报道。将其发展为治疗肺动脉高压药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对甘草次酸的药理作用研究，提供甘草次酸在制备治疗肺动脉高压药物中的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供甘草次酸在制备治疗肺动脉高压药物中的用途，所述肺动脉高压为肺动脉平滑肌细胞增值引起；所述甘草次酸的结构式如式(1)所示：

具体地，所述肺动脉高压为20ng/ml PDGF-BB刺激人肺动脉平滑肌细胞24h后诱导形成的肺动脉高压。

具体地，所述甘草次酸单次应用剂量为不引起中枢抑制的剂量。

优选地，所述甘草次酸单次应用剂量为40μM。

优选地，所述甘草次酸单次应用剂量为80μM。

优选地，所述甘草次酸单次应用剂量为160μM。

具体地，所述甘草次酸单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞40-160μM。

具体地，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

优选地，所述剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。

具体地，所述的甘草次酸作为唯一活性成分在制备肺动脉高压药物中的用途。

本发明提供的甘草次酸作为治疗肺动脉高压药物的用途具有以下有益效果：

(1)甘草次酸能显著抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖和DNA合成，阻滞细胞由G0/G1期进入S期；

(2)甘草次酸能抑制RhoA-ROCK信号通路相关蛋白的表达。

实验结果表明甘草次酸具有治疗肺动脉高压作用，可用于制备肺动脉高压的治疗药物。

附图说明

图1：甘草次酸对人肺动脉平滑肌细胞的增殖率影响图。

图2：甘草次酸对人肺动脉平滑肌细胞的DNA合成影响图。

图3：甘草次酸对人肺动脉平滑肌细胞的细胞周期影响图。

图4：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中RhoA蛋白表达水平的影响(与正常组比较：p＞0.05，与模型组比较：p＞0.05(x±s，n＝6))。

图5：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中ROCK1蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。

图6：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中ROCK2蛋白表达水平的影响(与正常组比较：p＞0.05，与模型组比较：p＞0.05(x±s，n＝6))。

图7：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。

图8：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中P27kip1蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。

图9：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中Bax蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。

图10：甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞中Bcl-2蛋白表达水平的影响(与正常组比较：##p＜0.01，与模型组比较：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(x±s，n＝6))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，实施例中所用的苦豆碱均为前述的式(1)所示的化合物。

实施例1

甘草次酸作为治疗肺动脉高压药物的用途，

其中，甘草次酸单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞160μM，药物的剂型为溶液剂型。

实施例2

甘草次酸作为治疗肺动脉高压药物的用途，

其中，甘草次酸单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞160μM，药物的剂型为粉针剂型。

实施例3

甘草次酸作为治疗肺动脉高压药物的用途，

其中，甘草次酸单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞160μM，药物的剂型为粉针剂型。

实施例1至3的效果可以通过下面的动物实验及其结果得到证实：

一、实验材料

1.1细胞

人肺动脉平滑肌细胞(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)

1.2主要药品与试剂

甘草次酸(购自上海源叶生物有限公司)，西地那非(购自辉瑞制药有限公司，S42045)，DMEM(购自美国Gibco公司，11965092)，胎牛血清(购自美国Gibco公司，C2027010)，胰蛋白酶(购自美国Gibco公司，15050065)，CCK-8(北京索莱宝科技有限公司，M8180-250)，二甲基亚砜(DMSO)(购自美国Sigma公司D8418)，BrdU(购自RocheSwitzerland)，细胞凋亡与周期检测试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)，全蛋白提取试剂盒、蛋白含量测定试剂盒(购自南京凯基生物技术股份有限公司，KGP2100、KGPBCA)，TEMED(购自美国Sigma公司，T8090)，过硫酸铵(AP)(购自美国Sigma公司，A8090)，10％SDS(上海Tongshan公司，P61014)，30％丙烯酰胺(购自上海Double-Helix，P31031)，蛋白上样缓冲液5×(购自北京TransGen Biotech，P62114)，化学发光底物(购自美国Advansta公司，K-12045-D10)，抗体RhoA(Cat NO：ab-187027)，ROCK1(Cat NO：ab-45171)，ROCK2(Cat NO：ab-125025)，MYPT1(磷酸T853)(Cat NO：ab-59203)，MYPT1(Cat NO：ab-32519)，Bax(CatNO：ab-182733)，Bcl-2(Cat NO：ab-32124)和p27kip1(Cat NO：ab-62364)购自AbcamBiotechnology公司(MA，USA，Cat NO：AB-129068)。

1.3主要仪器

超净台(SW-CJ-2FD，苏州省安泰技术有限公司)，二氧化碳培养箱(美国ThermoScinentific)，立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，离心机(Hypothermia,Z323K，西门子公司)，水浴箱(constant temperature,DK-420S，上海Jinghong实验设备公司)，酶标仪(Model 550，美国Thermo scientific)，BH-N I C-B型倒置显微镜(日本OlympusOptical公司)，激光共聚焦显微镜(TCS-SP，德国LEICA)，电子分析天平(AL104瑞士，Mettler-Toleclo Group公司)，低温冰箱(BCD-215KCM，中国海尔)，冰箱(994-80。C，德国Thermo)，雪花制冰机(SIM-F124，日本三洋公司)，超纯水系统(Milli-Q Academic A10，美国Millipore公司)，干燥箱(9140，上海Jinghong实验设备公司)，漩涡仪(8K-Ⅱ，上海手术器械厂)。

1.4细胞复苏

从液氮罐中取出细胞冻存管(注：应带防护眼镜和手套)迅速放入盛有37℃的水浴锅中，不停摇动,尽快解冻剪开纱布口袋，取出冻存管，用酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，移至离心管中，加入培养液，并吹打细胞用吸管吸出细胞悬液加入到的培养瓶中,置于37℃培养箱中静息培养。用完全培养液培养，第二天更换一次培养液用完全培养

1.7传代培养

细胞融合后，去除旧的培养液，加入适量的胰酶观察，细胞收缩后加1ml培养基终止消化去除消化液，移入10ml离心管1000rpm离心10min。取新的培养瓶，将离心完成的细胞弃含有胰酶的上清，用培养基吹打混悬后转入，补足培养液，显微镜下观察记录放入培孵箱培养。传代细胞从第三代开始可将完全培养液换为含小牛血清的完全培养液培养，隔天更换一次培养液。人肺动脉平滑肌细胞至少可以传六代以上，并且从第二代开始细胞即可冻存。取生长良好的一代细胞进行后续试验。

1.8细胞观察

细胞接种后每天于倒置显微镜下观察细胞的生长情况,包括细胞的形态、大小、融合状况、有无污染等，并照相留作参考。

1.9实验细胞的培养

取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化，用血球计数仪计数，按所需密度接种于细胞培养板/瓶中。隔天更换次培养液，直到达到融合。换成无血清培养液饥饿，使细胞同步化。然后收取细胞进行相关检测。液培养，往后每隔一天更换一次培养液。

二、实验过程

(一)CCK-8法检测甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs的增殖的影响

1.1实验步骤

(1)消化和铺板：胰酶消化对数期肺动脉平滑肌细胞，终止后离心收集,调整细胞悬液浓度，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。每孔加入体积为100ul，铺板时使待测细胞调密度至5000-10000/孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)给药：5％CO2，37℃烘箱孵育，次日细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入20μM、40μM、80μM、160μM浓度梯度的甘草次酸，每孔100ul。

(3)5％CO₂，37℃孵育12h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

(4)向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

(5)将培养板在培养箱内孵育4h。

(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

(7)同时设置调零孔(培养基、CCK-8)和对照孔(细胞、培养液、CCK-8)。

活力计算：

细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

其中：A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度；

A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；

A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。

1.2实验结果：不同浓度甘草次酸对人肺动脉平滑肌细(HPASMCs)细胞增殖活力有影响。CCK-8法检测不同浓度的甘草次酸(20-160μM)对HPASMCs的毒性。浓度为20-160μM的甘草次酸对HPASMCs的增殖率有明显影响(p＞0.05)。这一结果表明，实验浓度的甘草次酸对的HPASMCs的增殖率有明显影响(图1)。

(二)BrdU法检测甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs的DNA合成的影响

2.1实验步骤：

(1)试剂配制：

BrdU标记液：用无菌培养基1:100稀释(bottle 1)(终浓度为100为μMBrdU)。96孔板，细胞如果按100μl/孔接种，需要1ml BrdU标记液，如果按200μl/孔接种，需要2ml BrdU标记液。未溶解的BrdU标记液(1000×)：2-8℃避光可保存数月。溶解的BrdU标记液：2-8℃避光可保存数周。长期保存的BrdU标记液，需分装保存于-20℃。

Anti-BrdU-POD贮存液：用1.1ml双蒸水溶解Anti-BrdU-POD(bottle 3)10min并混匀，置于2-8℃避光可保存数月，长期保存应分装保存至-20℃.

Anti-BrdU-POD工作液：用抗体稀释液(bottle 4)1:100稀释Anti-BrdU-POD贮存液。一个96孔板，用10ml抗体稀释液(bottle 4)稀释100μl，Anti-BrdU-POD工作液临用前配制，无法贮存。

洗液：用双蒸水1:10稀释Washing buffer concentrate(bottle 5),一个96孔板，用90ml双蒸水稀释10ml Washing buffer concentrate(bottle 5)，于2-8℃可保存几周。

(2)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96孔板，5×103/孔，终体积为100μl/孔，37℃孵育。

(3)细胞培养时间取决于特定的实验方法和用于测定的细胞种类。对于大多数的实验方案，孵育时间一般在24-120h。

(4)细胞按100μl/孔培养，按10μl/孔加入BrdU标记液，37℃继续解育细胞2-24h，细胞按200μl/孔培养，按20μl/孔加入BrdU标记液。一般2h标记时间己足够。延长孵育时间将会増加BrdU渗入细胞DNA的总量，导致吸光度值和灵敏度增加(本实验为2h)。

(5)移去标记液，轻扣或者吸取弃去标记液。在标记结束后可中断测定过程，如果不再继续测定，移去标记液，细胞可置于2-8℃一周。

(6)200μl/孔加入FixDenat solution(bottle 2)15-25℃孵育30min。

(7)通过弹掉或轻扣充分移去FixDenat solution。

(8)按照100μl/孔加入Anti-BrdU-POD工作液，在15-25℃孵育约90min。

(9)移去抗体结合物并且用200μl-300μl/孔洗液清洗每孔，清洗3次。

(10)移去洗液。

(11)100μl/孔加入Substrate solution。

(12)15-25℃孵育5-30min直至颜色已足够光度检测。不加终止液：用酶标仪测定样品吸光度，波长370nm(参照波长492nm)，允许在不同时间点重复测定(如5、10、20min)。酶作用底物的最佳反应时间取决于不同的细胞种类。加终止液：每孔加入25μl的1mM硫酸终止反应，300rpm振荡约1min，在酶标仪450nm波长处检测OD值(参考波长为的690nm)，即BrdU检测值。检测需在加入终止液后5min内进行。

2.2实验结果：

DNA的合成与细胞周期及细胞增殖密切相关，故此我们通过BrdU渗入法来研究甘草次酸对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞DNA合成的影响。BrdU检测DNA合成结果表明：与正常相比PDGF-BB刺激HPASMCs后24小时，细胞增殖显著(p＜0.01)；苦豆碱20μM、40μM、80μM、160μM)干预2h后的BrdU结果显示，较未加入甘草次酸的模型组，加入甘草次酸的组别增殖量均下降，体现出对PDGF-BB诱导的HPASMCs增殖的抑制作用，并且加入甘草次酸的浓度越高，增殖数量越小，抑制增殖的效应越显著，意味着这种抑制作用呈现出浓度依赖性(p＜0.01，p＜0.05)。并且160μM浓度的甘草次酸抑制HPASMCs DNA合成效果最佳(p＜0.01)(图2)。

(三)流式细胞术检测甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs细胞周期的影响

3.1实验步骤：

(1)细胞培养于六孔板，造模和给药：5％CO2，37℃烘箱孵育，至细胞单层铺满孔底，正常对照组更换新鲜培养基，其余各组更换含有20ng/ml的PDGF-BB的新鲜培养基，继续培养12h。12h后正常对照组和模型组更换新鲜培养基，给药组依次加入20μM、40μM、80μM、160μM浓度梯度药物的新鲜培养基。

(2)倒置显微镜下观察细胞融合达80％后消化细胞，离心并收集细胞，800rpm/min,5min，弃上清，用预冷的PBS将细胞重悬1次，再次离心，1000rpm/min，5min，—般一个样本所需的细胞可用6孔板培养。

(3)加入1ml提前配制好并预冷的70％乙醇(无水乙醇+PBS配制)，于4℃固定过夜。在细胞固定时一定要用移液枪轻轻吹打并涡旋摇晃将细胞吹开，吹成单细胞。

(4)次日再次离心，1500rpm/min，5min，弃上清。

(5)再次用1ml的PBS洗细胞一次，离心，1500rpm/min，5min，弃上清，收集细胞。

(6)按照每个样本需要：加入0.5mlPI/RNase染色缓冲液，缓慢并充分重悬细胞，4℃避光孵育30分钟。配制好的溴化乙锭染色液短时间可以保存在4℃，本实验现配现用。染色后立即上机检测各周期时相细胞所占百分比。

流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数万个细胞，结果用Modfit细胞周期拟和软件分析，上机前用200目的筛网是将粘在一起的细胞团滤掉的，避免造成堵塞机以及出现多倍体干扰影响实验结果。

3.2实验结果

流式细胞术检测细胞周期发现甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs增殖具有抑制作用：细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞周期的阻滞可影响细胞增殖。我们采用PI染色后通过流式细胞仪检测甘草次酸对细胞周期的影响。PDGF-BB刺激24h后HPASMCs处于G0/G1百分比减小(图3，p＜0.05)，S期细胞百分比增加(图3，p＜0.01)。与对照组相比160μM甘草次酸干预24小时后可使细胞G0/G1百分比增加(图3，p＜0.05)，S期细胞百分比增加(图3，p＜0.01)，G2/M对期细胞百分比无明显影响(图3，p＞0.05)。结果表明甘草次酸可阻滞G0/G1期细胞向S期过渡。

(四)Western blot检测苦豆碱对PDGF-BB诱导的HPASMCs中Rho A、ROCK1、ROCK2、t-MYPT1、p-MYPT1、p27kip1、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

4.1实验步骤

(1)蛋白提取(全程低温操作)

细胞准备：将HPASMCs接种于60mm的培养皿中，细胞融合达80％时，饥饿12h使其同步化。每个培养皿中加入5ml含有20ng/ml PDGF-BB的新鲜培养基，正常对照组加入新鲜培养基，放入培养箱培养24h后正常组和模型组更换新鲜培养基，给药组加入0.5mM苦豆碱继续培养24h。将各组细胞从培养箱取出，用预冷的PBS洗3遍，使用胰酶消化下细胞，转移至1.5ml的EP管中，离心。(1000rpm离心10min，4℃)弃上清，沉淀加入1mL预冷的PBS混悬，再次离心，条件同上。上述操作重复2次(沉淀即细胞)。

按说明书配制细胞裂解液：按需配制：每1ml冷Lysis Buffer中，加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂以及5μl 100mM PMSF，冰上保存待用。注意现用现配。

裂解细胞：细胞经2次离心后，弃上清，向纯细胞中加入60μl裂解液，混匀后置于摇床上，4℃环境下摇晃30分钟(摇床转速调至最大)。

离心分离：各组EP管配平置于4℃离心机内离心，为20000rpm离心5min。小心吸取上清液转移至预冷的EP管中，标记好置于在-80℃冰箱保存。

(2)蛋白浓度测定及蛋白变性处理

按照下表1中标示加入各个试剂，然后再向各个酶标孔中分别加入200μl配制的BCA工作液。

表1各个酶标孔中加入工作液的量

孔号	0	1	2	3	4	5	6	7
									蛋白标准溶液(μl)	0	1	2	4	8	12	16	20
去离子水(μl)	20	19	18	16	12	8	4	0
									对应蛋白含量(μg)	0.0	0.5	1.0	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0

①提前将酶标仪条件设置为37℃孵育30min、每间隔10sec震荡1次、吸光度为562nm，预热完成后将酶标板放入酶标仪中，检测OD值。

②测得每孔吸光度数据后，以蛋白含量(μg)为纵坐标、吸光值为横坐标，绘制标准曲线。

(3)样本蛋白含量测定

每1μl提取的蛋白原液加入19μl Lysis Buffer将样本稀释20倍，混匀之后，每孔加入样本稀释液20μl，再加入BCA工作液200μl，充分混匀并且保证无气泡。

提前将酶标仪条件设置为37℃孵育30min、每间隔10sec震荡1次、吸光度为562nm，预热完成后将酶标板放入酶标仪中，检测OD值。

依据之前绘制的标准曲线纵坐标上OD值，对应到横坐标上蛋白含量，除以20μl的总体积，再乘以稀释倍数，便得到样品浓度(μg/μl)。

调整各样本蛋白浓度：根据测得的样品蛋白浓度，按照比例加入预冷的LysisBuffer，与5×Loading Buffer以4:1的比例混合，调整样本蛋白浓度为5ug/μl，然后震荡混匀、封口，在沸水中煮10min，冷却分装后-80℃分装保存，避免反复冻融。

(4)配制浓缩胶和分离胶

清洗玻璃板，流动水洗，双蒸水冲洗晾干，之后用甲醇充分擦拭干净。

将玻璃板放入夹子中对齐夹紧并固定，然后开始配制分离胶。

根据蛋白的分子量按照下表2配制8％/12％分离胶：

表2分离胶配方表

组分	8％凝胶	12％凝胶
			去离子水	4.8ml	3.3ml
30％丙烯酰胺	2.7ml	4.0ml
			4×Tris/SDS分离胶缓冲液(PH 8.8)	2.5ml	2.5ml
10％APS	0.1ml	0.1ml
			TEMED	4μl	4μl

按顺序配制凝胶时加入APS和TEMED后立即涡旋混匀并开始后续操作：

用1000μl的移液枪将8％/12％分离胶从两块玻璃板之间的空隙的一侧缓慢加入，加至玻璃板3/4高度处停止，留下剩余空间，然后再用甲醇覆盖在分离胶顶部，目的是压平凝胶的水平线、排尽空气，室温静置至凝胶和甲醇之间出现清晰的反光线时倒去甲醇，用滤纸尽量吸去剩余水分。

紧接按照下表3配制浓缩胶：

表3浓缩胶配方表

组分	5％凝胶
		去离子水	3.4ml
30％丙烯酰胺	0.85ml
		4×Tris/SDS分离胶缓冲液(PH 8.8)	0.65ml
10％APS	50μl
		TEMED	5μl

按顺序配制凝胶时加入APS和TEMED后立即涡旋混匀并开始后续操作：

用1000μl的移液枪将浓缩胶加入两块玻璃板之间至溢出，迅速插入专用的梳子，静置在4℃冰箱可过夜。

待浓缩胶全部凝聚之后，除去梳子。

(5)电泳

连接电泳装置，将玻璃胶板固定于电泳槽中，从内槽加入新鲜配置的5×Tris-甘氨酸-SDS缓冲液至2刻度处，确保缓冲液没过凝胶加样孔，外槽加入回收利用的电泳液至电泳槽的4刻度处。

用10μl的移液枪在凝胶的加样孔中加入10μl样本，再在两边的孔中加入5μl的蛋白Marker。

加样后连接电源开始电泳，以恒压70V电泳至蛋白Marker染料颜色之间跑开后将电压调整至120V继续电泳，待蛋白Marker染料前端到达凝胶底部后结束电泳。

(5)转膜

在电泳结束前的30min，提前将硝酸纤维素膜(NC膜)和转膜滤纸放置于转膜液中浸泡待用。

电泳结束后，转膜夹子黑面朝下，在上面垫一层海绵垫，再垫一层滤纸，将所需条带及内参铺在滤纸上，将NC膜置于上面，再放一层滤纸和一张海绵垫，形成三明治形式，赶走气泡并夹紧。放置于转膜槽，夹子的黑面对应转膜槽的黑面，透明面对应转膜槽的红面，加入转膜液至溢出，放入冰盒降温。

设定转膜电流为200m A，转膜时间为2h。

孵育一抗、二抗：转膜结束后取出NC膜进行修剪，弃去凝胶。

封闭：将奶粉溶于PBST配制成5％封闭液，将NC膜置于封闭液中室温放置2小时。

孵育一抗：孵育一抗：封闭完成后，取出NC膜，弃去封闭液。然后用适宜浓度的一抗在摇床上孵育NC膜(兔抗Rho A抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释、兔抗ROCK1抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释、兔抗ROCK2抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释、兔抗p-MYPT1抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释、兔抗MYPT1抗体用5％脱脂奶粉溶液按1：500稀释)，4℃过夜，注意排除气泡。复温2小时，小心取出NC膜弃去一抗，PBST洗3遍，每次10min。

孵育二抗：将山羊抗兔IgG二抗用5％脱脂奶粉溶液以1:2000的比例混合，用涡旋振荡器混匀后室温下孵育NC膜2h。

二抗孵育结束后，取出NC膜弃去二抗，用PBST洗3遍，每次15min。

曝光显影：

配制显色液：将ECL化学发光底物反应液中的试剂A和试剂B以1:1比例混合，摇匀待用。

将NC模放入多功能分子成像系统的托盘上，滴加配制好的ECL反应液100μl，孵育2min，设置曝光时间为Auto，然后拍照记录实结果。

结果分析：使用Quantity One图像分析系统对实验结果中的目标蛋白条带的累积灰度值进行测量分析，同时通过与内参β-actin灰度值对比以校正误差。

4.2实验结果

甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs中Rho A、ROCK1、ROCK2、t-MYPT1、p-MYPT1、p27kip1、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：根据Western bolt的结果显示，与正常组相比，模型组HPASMCs的Rho A、ROCK1、ROCK2、Bcl-2、t-MYPT1/p-MYPT1蛋白表达明显增高(图4,5,6,7,10，p＜0.01，p＜0.05)，p27kip1、Bax蛋白表达显著降低(图8,9，p＜0.01)；与模型组相比，甘草次酸组可明显改善PDGF-BB诱导的HPASMCs中的Rho A、ROCK1、ROCK2、Bcl-2、t-MYPT1/p-MYPT1蛋白表达增多现象(图4,5,6,7,10，p＜0.01，p＜0.05)，提高p27kip1、Bax蛋白表达(图8,9，p＜0.01)。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.甘草次酸在制备治疗肺动脉高压的药物中的用途，其特征在于：所述肺动脉高压为肺动脉平滑肌细胞增值引起；所述甘草次酸的结构式如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为不引起中枢抑制的剂量。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为40－160μM。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为40μM。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为80μM。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为160μM。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：甘草次酸单次应用剂量为人肺动脉平滑肌细胞40－160μM。

8.根据权利要求1－7任一项所述的用途，其特征在于：药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。