CN105079014B - 淫羊藿苷或淫羊藿次苷ⅱ用于防治肾脏疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ的用途，具体涉及淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ或它们药学上可接受的盐在制备防治肾脏疾病特别是慢性肾脏疾病的产品中的用途。本发明发现淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ能够增加和招募EdU标签的肾脏内源性干细胞，调节TGFβ/Smad，CTGF，P－ERK1/2磷酸化水平，改善内皮细胞、肾小球基底膜及肾小管病理变化，减少蛋白尿，改善尿素氮及肌酐清除水平，延缓慢性肾脏疾病病理变化进展，降低肾功能障碍风险，从而可用于预防或治疗肾脏疾病。

Description

淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ用于防治肾脏疾病的用途

技术领域

本发明涉及淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ的用途，具体涉及淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ在制备防治肾脏疾病或者改善肾脏功能的产品中的用途。

背景技术

流行病学调查表明，中国成年人中慢性肾脏病的患病率达到10.8％，据此估计，现有成年慢性肾脏病患者1.2亿。慢性肾脏病高危人群主要包括糖尿病、高血压病人、65岁以上老年人、长期服用肾毒性药物者以及有慢性肾脏病家族史者。

慢性肾病的基本病理变化特征是肾小球系膜细胞增生和基质增多、肾小球基底膜增厚最终肾小球纤维化导致肾小球硬化。84％的患者为早期患者，也就是其主要病理变化分级为1期或2期患者，早期临床表现为蛋白尿。随着病理变化的进展，肾小球病理变化的数目弥漫性增加而失去功能，临床表现为血清尿素氮和或肌酐增加，逐步进展成为终末期肾病引起肾功能衰竭。

糖尿病所致肾脏损害已成为引起终末期肾病最重要的原因之一。糖尿病肾病引起的终末期肾病占整个肾脏替代治疗人群的40％～50％。临床研究表明，利用胰岛素严格控制血糖不足以完全阻断糖尿病肾病的发生，糖尿病发展到肾功能衰竭阶段，均需要依赖长期透析或肾移植治疗。虽然肾移植手术在泌尿外科得到广泛普及，但是由于存在肾源严重不足及免疫排斥等问题，不仅严重危害生活质量和健康寿命，而且极大地耗费医疗资金。因此，糖尿病肾病是严重威胁民众健康的一种慢性疾病，同时还给社会带来了沉重的负担。

目前针对慢性肾病还没有安全有效的防治药物，常用治疗策略主要是低蛋白饮食疗法，利用胰岛素等药物控制血糖和血压，低蛋白饮食，降脂及血管紧张素等药物的干预治疗。虽然这些治疗方案可以一定程度上减缓肾病的发展,但仍不能阻断慢性肾病的病理变化。因此，非常需要研究开发安全有效的慢性肾病防治药物。

发明内容

本发明的发明人经过长期研究发现，淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ能够增加和招募EdU标签的肾脏内源性干细胞，调节生长因子如TGFβ/Smad，CTGF及ERK1/2磷酸化水平，改善肾小球血管内皮细胞、肾小球基底膜及肾小管病理变化，减少蛋白尿，改善尿素氮及肌酐清除水平，防止或延缓慢性肾脏疾病病理变化进展，降低肾功能障碍风险，从而可用于预防或治疗肾脏疾病，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ或它们药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病、或者改善肾脏功能的产品中的用途。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的肾脏疾病为急性或慢性肾脏疾病。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的肾脏疾病选自肾小球肾炎(例如原发性肾小球肾炎、继发性肾小球肾炎)、肾盂肾炎、肾病综合征。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的继发性肾小球肾炎是由选自以下的原因所致：糖尿病、过敏性紫癜、高血压性肾动脉硬化、肾结石、肾脏毒性药物、多囊性肾病变、血管炎、膀胱及输尿管疾病、前列腺增生。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ与其它用于治疗糖尿病或肾脏疾病的药物联用。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ以单位剂量10-500mg的量使用。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述产品通过肠道或非肠道形式使用。

本发明第二方面涉及淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ或它们药学上可接受的盐在制备用于减少蛋白尿、改善尿素氮或肌酐清除水平、防止或延缓肾脏组织纤维化的产品中的用途。

本发明第三方面涉及产品或组合物，其含有有效量的淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂；所述产品或组合物用于预防和/或治疗肾脏疾病、或者改善肾脏功能、或者减少蛋白尿、改善尿素氮或肌酐清除水平、防止或延缓肾脏组织纤维化。

根据本发明任一项的产品或组合物，其中所述的肾脏疾病为急性或慢性肾脏疾病。

根据本发明任一项的产品或组合物，其中所述的肾脏疾病选自肾小球肾炎(例如原发性肾小球肾炎、继发性肾小球肾炎)、肾盂肾炎、肾病综合征。

根据本发明任一项的产品或组合物，其中所述的继发性肾小球肾炎是由选自以下的原因所致：糖尿病、过敏性紫癜、高血压性肾动脉硬化、肾结石、肾脏毒性药物、多囊性肾病变、血管炎、肾结核、红斑狼疮、膀胱及输尿管疾病、前列腺增生。

本发明还涉及预防和/或治疗肾脏疾病、或者改善肾脏功能的方法，所述方法包括给有需要的受试者有效量的淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐的步骤。

根据本发明任一项的方法，其中所述的肾脏疾病为急性或慢性肾脏疾病。

根据本发明任一项的方法，其中所述的肾脏疾病选自肾小球肾炎(例如原发性肾小球肾炎、继发性肾小球肾炎)、肾盂肾炎、肾病综合征。

根据本发明任一项的方法，其中所述的继发性肾小球肾炎是由选自以下的原因所致：糖尿病、过敏性紫癜、高血压性肾动脉硬化、肾结石、肾脏毒性药物、多囊性肾病变、血管炎、肾结核、红斑狼疮、膀胱及输尿管疾病、前列腺增生。

在本发明中，淫羊藿苷(Icariin)的CAS号为56692-02-5，其结构式如式Ⅰ所示，分子式C₃₃H₄₀O₁₅，分子量676.67。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ)的CAS号为113558-15-9，其结构式如式Ⅱ所示，分子式C₂₇H₃₂O₁₀,分子量514.54。

在本发明中，所述产品例如为药物、保健品或食品添加剂。

在本发明中，所述组合物例如为药物组合物。

在本发明中，所述哺乳动物例如为人、狗、猴、牛、马、猫、熊、羊、鼠等。

在本发明中，肾脏疾病主要临床表现包括水肿、蛋白尿、血尿，以及高血压、贫血、营养不良、心血管疾病等并发症，严重者可发展为肾功能衰竭。

在本发明中，所述肾小球肾炎分为原发性肾小球肾炎和继发性肾小球肾炎，其中所述的原发性肾小球肾炎包括轻微性肾小球病变、局灶性节段性病变(例如局灶性肾小球肾炎)、弥漫性肾小球肾炎(例如膜性肾病、增生性肾炎、硬化性肾小球肾炎)、未分类的肾小球肾炎。

在本发明中，所述增生性肾炎例如为系膜增生性肾小球肾炎、毛细血管内增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、新月体性和坏死性肾小球肾炎。

在本发明中，所述继发性肾小球肾炎通常是由选自以下的原因所致：糖尿病、过敏性紫癜、高血压性肾动脉硬化、肾结石、肾脏毒性药物、多囊性肾病变、多发性骨髓瘤、感染性心内膜炎、血管炎、肾结核、红斑狼疮、膀胱及输尿管疾病、前列腺增生。比较常见的继发性肾小球肾炎例如为狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、糖尿病肾病。

在本发明中，其中药学上可接受的盐包括但不局限于淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ与无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸和硝酸所成的盐以及与各种有机酸，如马来酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、棕榈酸等所成的盐。

本发明的含淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ的产品可通过肠道或非肠道途径给予需要的宿主如人。通过肠道给予的本发明产品可通过口服制剂的形式给予，口服制剂举例有：片剂，胶囊，颗粒剂，悬浮剂，缓释剂等。通过非肠道给予的本发明产品可以为注射剂，局部给药制剂如皮肤贴剂，或喷雾剂等形式。

通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的有效成分(淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ)。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将有效成分与一种或其他药物成分配伍制成多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

但应认识到，本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的药物组合物以有效成分(淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ)计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001－1000mg/kg体重/天，例如介于0.01－100mg/kg体重/天，例如介于0.01－10mg/kg体重/天。

附图说明

图1是淫羊藿苷在体内和体外转化成淫羊藿次苷Ⅱ的示意图及淫羊藿苷(上图)和淫羊藿次苷Ⅱ(下图)的HPLC图。

图2是淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对肾组织PAS染色+RECA免疫组化双染色各级肾小球病理变化比例的影响。A：正常肾小球，B：I级肾小球病变；C：IIa级肾小球病变，D：IIb级肾小球病变，E：III级肾小球病变。

图3是淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾脏肾小球内皮细胞标志物vWF表达影响。*表示与正常对照组相比有显著统计学差异，P<0.01；**表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.01。

图4是淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾组织脂质氧化产物MDA的影响。*表示与正常对照组相比有显著统计学差异，P<0.01；**表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.01。

图5是淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾脏TGFβ，P-Smad2+3，Smad2+3与CTGF蛋白水平表达影响。*表示与正常对照组相比有显著统计学差异，P<0.01；##表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.05；**表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.01。

图6是淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾组织EdU标签的内源性干细胞表达影响。*表示与正常对照组相比有显著统计学差异，P<0.01；##表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.05；**表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.01。

图7是淫羊藿次苷Ⅱ对肾脏中Ki67+细胞的影响。在糖尿病性肾病组织中(DM)，细胞增殖减弱,有较少ki67阳性细胞，而淫羊藿次苷Ⅱ显著提高肾脏中ki67阳性的细胞。*表示与正常对照组相比有显著统计学差异，P<0.01；##表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.05；**表示与糖尿病肾病组相比有极显著统计学差异，P<0.01。

图8是Nestin在肾脏修复过程中的表达。在正常肾脏和糖尿病肾脏中没有Nestin(绿色)的表达，而淫羊藿次苷Ⅱ治疗组有40％的肾小球表达。

图9是淫羊藿次苷Ⅱ治疗对干细胞标记物CD34/STRO-1与EdU标记阳性细胞表达影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的制备

参照Xia Q等(2010)文献(Xia Q,Xu D,Huang Z,Liu J,Wang X,Wang X,LiuS.Preparation of icariside II from icariin by enzymatic hydrolysismethod.Fitoterapia.2010；81(5):437-442.)的方法制备得到淫羊藿苷和淫羊藿次苷II。

淫羊藿苷制备：利用乙醇提取，利用大孔树脂纯化从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷。可获得大量淫羊藿苷(Icariin,ICA)。利用HPLC分析其纯度为98.0％。

淫羊藿次苷Ⅱ制备：

在体外利用葡萄糖苷酶(β-glucosidase)酵解，将淫羊藿中淫羊藿苷转化成淫羊藿次苷Ⅱ(IcarisideⅡ,ICAⅡ)，并按照文献方法进行提纯。利用HPLC分析其纯度为98.0％(如图1)。

制备得到的淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ用于以下各实施例。

实施例2淫羊藿次苷Ⅱ对糖尿病引起慢性肾脏疾病的防治效果

一、建立肾脏内源性干细胞标记的慢性肾脏疾病大鼠模型

慢性肾脏疾病主要是由糖尿病、高血压性肾动脉硬化，肾小球肾炎以及肾脏毒性药物引起。其中糖尿病大鼠慢性肾脏疾病模型是最常用而合理的模型之一。

发明人利用SD大鼠50只，出生后第2天腹腔注射EdU(胸腺嘧啶核苷类似物)(50mg/kg)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),制备携带EdU(+)-LRCs的实验大鼠)，饲养8周，随机分组设健康对照组NC(n＝10)，其余大鼠空腹状态下腹腔注射STZ(60mg/kg，ip)(SigmaChemical Co,St Louis,Missouri)建立糖尿病模型组(n＝40)，STZ注射72h后通过尾静脉检测血糖，空腹血糖浓度不小于300mg/dl者为建立糖尿病模型成功。确认糖尿病模型大鼠(n＝36)饲养8周，随机设糖尿病对照组DN(n＝8)、胰岛素治疗组Insulin(n＝8)、淫羊藿苷治疗组ICA(n＝8)、淫羊藿次苷Ⅱ组ICAⅡ(n＝8)。胰岛素治疗组胰岛素每次2-6个单位，一天两次腹腔注射，并早晚检测控制血糖。淫羊藿苷治疗组或淫羊藿次苷Ⅱ治疗组(ICA/或ICA II)按5mg/(kg·d)灌胃，1次/d(ICA、ICAⅡ浓度为5mg/ml)，其余对照组溶剂DMSO灌胃治疗1个月。尾静脉取血,血糖仪测随机血糖。代谢笼收集尿液,测定24小时尿量变化，检测24小时尿微量白蛋白。治疗结束后经过药物洗脱期两周后检测大鼠体重,水合氯酸麻醉后腹主动脉取血,收集血液,全自动生化分析仪检测肌酐、尿素氮。获取血液标本后处死大鼠取肾脏标本冷藏，开展相关组织病理学及分子生物学研究。相关实验试剂抗体购于Immobilon Western,Millipore,MA,USA，其中vWF抗体(ab6994,Abcam,Massachusetts,USA)，Ki67抗体以及二抗(Vector Laboratories,Burlingame,CA).

利用SPSS17软件统计学分析，实验结果数据利用平均值±标准差表示，One-wayANOVA和独立样本t检验用于数据统计学分析，P值<0.05为显著差异。

二、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对慢性肾脏疾病大鼠体重及血液生化指标的影响：

糖尿病肾脏病模型组大鼠体重较正常对照组显著降低，而胰岛素、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗组得到显著改善；胰岛素治疗组对血糖及糖化血红蛋白有显著改善，ICA组和ICAⅡ治疗组对血糖及糖化血红蛋白没有显著改善。DN组大鼠24-h尿蛋白量、血浆肌酐、尿素氮较正常对照组显著增加，胰岛素、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗组得到显著改善，而淫羊藿次苷Ⅱ治疗组较胰岛素和淫羊藿苷治疗组更有效。(表1)表1胰岛素、淫羊藿及淫羊藿次苷Ⅱ治疗对大鼠体重及血液生化指标的影响

*P<0.01，与NC组比较，^##P<0.05，与DN组比较，**P<0.01，与DN组比较.

三、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对慢性肾脏疾病大鼠肾小球病理学变化的效果

肾脏组织切片检测内皮细胞标记物RECA免疫组化染色和肾小球系膜细胞间质标记物PAS化学染色双染观察肾脏组织学病理变化：

肾组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。石蜡包埋，修块，切片(3μm)，标记实验编号；常规脱蜡；放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)中抗原热修复；0.3％过氧化氢甲醇溶液孵育20min封闭内源性过氧化物酶；滴加正常山羊血清封闭，室温30min；倾去血清，依次加一抗(内皮细胞标记物RECA1：200)(ab9774,Abcam,USA)、即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT-5001,迈新，中国)；DAB显色；肾小球系膜细胞间质标记物PAS化学染色；脱水，透明，中性树胶封片；在显微镜下观察，拍照。

观察发现，造模后DN组比较NC组正常肾小球比例明显减少，而病变肾小球比例明显增多。胰岛素、淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ治疗后正常肾小球数目明显增多(P<0.01)，I级肾小球病变与IIa级肾小球病变比例变化不明显，IIb级肾小球病变数目明显减少(P<0.01)，III级肾小球病变只在模型组与淫羊藿苷ICA组和ICAⅡ治疗组明显减少。淫羊藿次苷Ⅱ治疗组对肾脏病理变化的修复效果较胰岛素和淫羊藿苷组显著改善。(图2)(表2)

表2胰岛素、淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾脏肾小球病变的影响

*P<0.01，与NC组比较，**P<0.01，与DN组比较.

四、胰岛素、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ对慢性肾脏疾病大鼠肾小球内皮细胞病理学变化的效果：vWF免疫荧光染色研究内皮细胞。

肾组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。冰冻切片包埋剂(opti-mum cutting temperature compound，OCT)包埋后切片(5μm)。洗掉OCT，0.3％Triton-100打孔20min，PBS清洗3次，10％正常羊血清封闭30min，vWF抗体(ab6994,Abcam,Massachusetts,USA)与PBS1:500混合后4℃孵育过夜，次日倾去一抗加入荧光二抗(避光)1h，清洗后染DAPI，封片。观察发现(图3)模型组在肾小球vWF表达明显减少，胰岛素、淫羊藿苷与淫羊藿次苷Ⅱ治疗后显著改善，而淫羊藿次苷Ⅱ改善更加明显。

五、淫羊藿次苷Ⅱ对慢性肾脏疾病大鼠肾脏组织病理学变化机制的研究

5.1淫羊藿次苷Ⅱ治疗对肾组织脂质氧化产物MDA的影响：MDA作为脂质氧化的天然产物被广泛用作氧化应激指标。

全细胞蛋白提取试剂盒(P0033，碧云天，中国)提取肾脏组织蛋白，检测蛋白浓度并按实验分组标记。按MDA试剂盒(S0131，碧云天，中国)步骤检测后用酶标仪在532nm测定吸光度，公式换算MDA含量。得出数据表明(图4)，模型组的肾组织中MDA含量明显增高，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗后显著下降，而淫羊藿次苷Ⅱ改善更加明显。

5.2TGFβ/Smad/CTGF和P-ERK1/2信号通路与肾脏组织纤维化相关：

全细胞蛋白提取试剂盒提取蛋白，检测蛋白浓度并按实验分组标记。将样品放入钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭后加入一抗(TGFβ(ab66043,Abcam,USA)、P-Smad2+3(Ser423/425,Santa Cruz,USA)、Smad2+3(FL-425,Santa Cruz,USA)、CTGF(ab6992,Abcam,USA)、P-ERK1/2(ab76165,Abcam,USA))4℃过夜，次日加入二抗，电化学发光后通过Molecular Analyst图像分析软件分析每条条带的整合密度值(Integrated density value，IDV)。

肾组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。石蜡包埋，修块，切片(3μm)，标记实验编号；常规脱蜡；放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)中抗原热修复；0.3％过氧化氢甲醇溶液孵育20min封闭内源性过氧化物酶；滴加正常山羊血清封闭，室温30min；倾去血清，依次加一抗(β-catenin1：200)、即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT-5001,迈新，中国)；DAB显色；苏木素核染色；脱水，透明，中性树胶封片；在显微镜下观察，拍照。观察发现(图5)模型组在肾小球TGFβ，P-Smad2+3，Smad2+3，CTGF，P-ERK1/2蛋白水平表达明显增高，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗后显著改善，而淫羊藿次苷Ⅱ改善更加明显。。

六、淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ对大鼠肾脏EdU标记的内源性干细胞的影响：淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ增加肾脏中EdU标记的内源性干细胞：

肾脏组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。OCT包埋，冰冻切片(5μm)。洗掉OCT，invitrogen EdU染色试剂盒染色，清洗后染DAPI，封片。荧光显微镜观察发现(图6)在糖尿病大鼠肾组织皮髓质EdU标记内源性干细胞明显减少，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗后皮髓质EdU标记内源性干细胞数量增加，而淫羊藿次苷Ⅱ改善更加明显。

七、淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ促进慢性肾脏疾病大鼠修复过程中肾脏细胞的增殖：

Ki67是细胞增殖指标标记物：肾脏组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。OCT包埋，冰冻切片(5μm)。洗掉OCT，0.3％Triton-100打孔20min，PBS清洗3次，10％正常羊血清封闭30min，Ki67抗体与PBS1:200混合后4℃孵育过夜，次日倾去一抗加入荧光二抗(避光)1h，清洗后染DAPI，封片。观察发现(图7)模型组在肾组织皮髓质Ki67阳性细胞明显减少，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ治疗后明显增加，而淫羊藿次苷Ⅱ改善更加明显。

八、淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ促进慢性肾脏疾病大鼠修复中新生肾小球的形成：

Nestin原来是作为神经干细胞的标记物在神经研究领域得到广泛应用，近年来发现，其也是新生血管内皮细胞的标记物，在许多新生的血管中表达。进一步的研究发现其在新生的肾小球中强度表达，是新生肾脏肾小球的标记物之一。我们的前期研究发现，在小鼠肾脏的发育过程中，Nestin在肾小球中表达，之后逐渐减少，6周后在正常的肾脏中表达很低。而在肾脏修复过程中，新生的肾小球又重新表达(图8)。

肾脏组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。OCT包埋，冰冻切片(5μm)。洗掉OCT，0.3％Triton-100打孔20min，PBS清洗3次，3％正常马血清封闭30min，NESTIN抗体与3％正常马血清封闭1:500混合后4℃孵育过夜，次日倾去一抗加入荧光二抗(避光)1h，清洗后染DAPI，封片。观察发现，在正常肾脏和糖尿病肾脏中没有NESTIN的表达，而淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ治疗组有40％的肾小球表达。

九、淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ促进慢性肾脏疾病大鼠修复中血管的再生：

通过标记物CD34与STRO-1进一步证明淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ促进内源性干细胞的增加和血管的再生。CD34与STRO-1为干细胞特异性标记物，同时也是血管内皮的标记物：肾脏组织在2％甲醛和0.002％苦味酸溶于0.1M的PBS固定液中固定4小时，浸泡在30％蔗糖中4℃过夜。OCT包埋，冰冻切片(5μm)。洗掉OCT，0.3％Triton-100打孔20min，invitrogen life EdU试剂盒(Alexa Fluor488azide)Edu染色，PBS清洗3次，10％正常羊血清封闭30min，CD34/STRO-1抗体与PBS1:200混合后4℃孵育过夜，次日倾去一抗加入荧光二抗(避光)1h，清洗后染DAPI，封片。观察发现(图9)CD34/STRO-1与部分EdU+细胞位置重合，证明EdU标记阳性细胞为内源性干细胞。模型组肾组织CD34/STRO-1表达明显减少，淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ治疗后明显增加。

小结：

本发明证明淫羊藿苷或淫羊藿次苷Ⅱ能够增加和招募EdU标签的肾脏内源性干细胞，调节生长因子如TGFβ/Smad，CTGF及ERK1/2磷酸化水平，改善肾小球血管内皮细胞、肾小球基底膜及肾小管病理变化，减少蛋白尿，改善尿素氮及肌酐清除水平，防止或延缓慢性肾脏疾病病理变化进展，降低肾功能障碍风险，从而可用于预防或治疗肾脏疾病。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (6)

1.淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐作为唯一有效成分在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的产品中的用途；其中所述的肾脏疾病选自肾小球肾炎、肾盂肾炎、肾病综合征。

2.权利要求1的用途，其中所述肾小球肾炎为原发性肾小球肾炎或继发性肾小球肾炎。

3.权利要求2的用途，其中所述的继发性肾小球肾炎是由选自以下的原因所致：糖尿病、过敏性紫癜、高血压性肾动脉硬化、肾结石、肾脏毒性药物、多囊性肾病变、血管炎、肾结核、红斑狼疮、膀胱及输尿管疾病、前列腺增生。

4.淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐作为唯一有效成分在制备用于防止或延缓肾脏组织纤维化的产品中的用途。

5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述淫羊藿次苷Ⅱ与其它用于治疗糖尿病或肾脏疾病的药物联用。

6.权利要求1-4任一项的用途，其中所述淫羊藿次苷Ⅱ以单位剂量10-500mg的量使用。