CN112369404A - 一种肾脏保存液的改良方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肾脏保存液的改良方法，属于器官保存液技术领域，在HC‑A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜，淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。本发明改良方法在HC‑A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，可通过保护线粒体结构、提高钙酶活性、抑制细胞凋亡及氧化应激反应和炎性反应，减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤，提高HC‑A液保存离体肾脏的保存效果，延长其保存时间，从而提高肾脏移植的成活率，为临床寻找一种安全有效的供肾保存方法。

Description

一种肾脏保存液的改良方法
技术领域
本发明属于器官保存液技术领域，具体涉及一种肾脏保存液的改良方法。
背景技术
肾脏移植是目前治疗肾功能衰竭的最佳方法之一，而肾脏保存质量对肾脏移植效果有决定性作用，因此肾脏保存液的改进越来越受重视。国内器官保存液最成功的是HC-A液(高渗枸橼酸盐腺嘌呤溶液)，由第二军医大学附属长征医院与上海中心血站共同研发，在国外Ross液配方的基础上加以改良的，其成分均相同于Ross溶液。HC-A液改变的地方有3点：一是渗透压降为380mmol/kg，二是添加腺嘌呤0.38mmol/L，三是pH值调至7.0。这些改进根据当时有关肾脏低温能量代谢研究的进展以及中国人肾脏的生理特点从而获得了很大的成功。因此，HC-A液的特点为：加入腺嘌呤补充能量底物；液体粘滞度较低，离体灌注效果好；配置简单，使用方便，价格低廉。但随着对器官保存的进一步的认识及对于器官保存过程中及器官移植过程中的缺血-再灌注损伤认识的进一步深化，对器官保存液的发展提出了更高的要求。在移植供体严重短缺的情况下，解决这一问题的关键即是拓展供源，提高肾脏保存效果，改善移植肾的活力与质量，因此，研制出保存效果好且性价比高的肾保存液势在必行。
申请号为2016800501657的发明专利申请公开的是：包含(A)槲皮素、以及(B)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类的、脏器或组织的保存剂；包含该保存剂的脏器或组织的保存液；以及脏器或组织的保存方法，所述方法包括：在包含(A)槲皮素、以及(B)选自由果糖和蔗糖组成的组中的至少1种糖类的液体混合物中浸渍脏器或组织的工序。上述脏器或组织为心脏、肝脏、肾脏、胰腺或胰岛。申请号为2018800468554的发明专利申请公开的是：用于保存细胞、组织和/或器官的保存溶液，包括：(i)注射用水；(ii)至少一种糖；(iii)至少一种具有pH缓冲性质的组分；(iv)任选地至少一种具有钙转运阻断性质或抗钙作用活性的组分；(v)游离形式或盐形式的水杨酸，或阿司匹林；(vi)游离形式或盐形式的谷氨酸，或谷氨酰胺；条件是不存在乙酰胺，和/或如果存在阿司匹林，则不存在谷氨酰胺；如果存在谷氨酰胺，则不存在阿司匹林；上述器官是肝脏、肾脏、小肠和/或胰腺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肾脏保存液的改良方法，在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，可通过保护线粒体结构、提高钙酶活性、抑制细胞凋亡及氧化应激反应和炎性反应，减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种肾脏保存液的改良方法，在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜，淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
HC-A液中未加入抗氧自由基损害的活性物质，本发明发现在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物能够提高HC-A液保存离体肾脏的保存效果，延长其保存时间，从而提高肾脏移植的成活率，为临床寻找一种安全有效的供肾保存方法。这主要是因为灵芝提取物和淫羊藿提取物共同存在时，具有如下作用：1)能保护缺血再灌注肾脏线粒体结构的完整性，保护离体肾脏低温保存时肾皮质细胞能量代谢；2)提高肾皮质线粒体钙酶活性，防止钙超载；3)上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，从而上调Bcl-2/Bax的比值，减少肾小管上皮细胞的凋亡；4)提高离体肾组织抗氧化酶SOD活性，从而降低离体肾脏组织的细胞脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)的含量；5)下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及HMGB1含量，上调抗炎细胞因子IL-10含量。因此，在HC-A液中加入的灵芝提取物和淫羊藿提取物可通过保护线粒体结构、提高钙酶活性、抑制细胞凋亡及氧化应激反应和炎性反应，减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤。
优选地，灵芝提取物中至少含8wt％灵芝多糖，3wt％灵芝总三萜。
优选地，淫羊藿提取物中含淫羊藿苷、朝藿定A和/或朝藿定B和/或朝藿定C。
优选地，淫羊藿提取物中至少含55wt％淫羊藿苷，40wt％朝藿定。
优选地，一种肾脏保存液的改良方法，包括如下步骤：
S1：将灵芝提取物制备成浓度为1.0-3.5g/mL的灵芝提取液；
S2：将淫羊藿提取物制备成浓度为0.2-1.8g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在HC-A液中加入灵芝提取液和淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.3-7.8，消毒，即得改良肾脏保存液。
更优选地，HC-A液、灵芝提取液和淫羊藿提取液的体积比为100:1.5-3.0:1.5-3.0。
优选地，肾脏保存液是冷藏保存溶液。
本发明还公开了灵芝提取物联合淫羊藿提取物在预防或治疗人或非人动物的急性缺血性肾衰的药物的用途，灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜，淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
本发明还公开了灵芝提取物联合淫羊藿提取物在制备肾脏保存液中的用途，灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜，淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
本发明还公开了上述肾脏保存液在没有血液供应的情况下用于保存肾脏。
本发明还公开了上述一种防止再灌注后离体肾脏损伤或降低其严重性的方法，包括，将离体肾脏保存在权利要求1所述肾脏保存液中。
本发明由于采用了在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，因而具有如下有益效果：1)能保护缺血再灌注肾脏线粒体结构的完整性，保护离体肾脏低温保存时肾皮质细胞能量代谢；2)提高肾皮质线粒体钙酶活性，防止钙超载；3)上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，从而上调Bcl-2/Bax的比值，减少肾小管上皮细胞的凋亡；4)提高离体肾组织抗氧化酶SOD活性，从而降低离体肾脏组织的细胞脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)的含量；5)下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及HMGB1含量，上调抗炎细胞因子IL-10含量。因此，本发明提供一种肾脏保存液的改良方法，在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，可通过保护线粒体结构、提高钙酶活性、抑制细胞凋亡及氧化应激反应和炎性反应，减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤。
附图说明
图1为肾组织中SOD活力测定结果；
图2为肾组织中MDA含量测定结果；
图3为肾组织中TNF-α含量；
图4为肾组织中IL-1β含量；
图5为肾组织中HMGB1含量；
图6为肾组织中IL-10含量。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施示例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：
一种肾脏保存液的改良方法
原料及试剂：HC-A液，购自上海长征医院；灵芝提取物(灵芝康葆粉剂)，每100g含灵芝多糖10g、灵芝总三萜8g，购自福建仙芝楼生物科技有限公司；淫羊藿提取物，购自西安岳达植物科技有限公司，每100g含淫羊藿苷56g、朝藿定A 6g、朝藿定B19g、朝藿定C19g。
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为2.4g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为1.2g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在20mL HC-A液中加入0.48mL灵芝提取液和0.4mL淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.4，采用高温高压(l09℃，45min)消毒，即得改良肾脏保存液。
实施例2：
一种肾脏保存液的改良方法
原料及试剂：同实施例1。
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为2.4g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为1.2g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在20mL HC-A液中加入0.48mL灵芝提取液和0.5mL淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.4，采用高温高压(l09℃，45min)消毒，即得改良肾脏保存液。
实施例3：
一种肾脏保存液的改良方法
原料及试剂：同实施例1。
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为2.4g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为1.2g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在20mL HC-A液中加入0.48mL灵芝提取液和0.3mL淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.4，采用高温高压(l09℃，45min)消毒，即得改良肾脏保存液。
实施例4：
一种肾脏保存液的改良方法
原料及试剂：HC-A液，购自上海长征医院；灵芝提取物(灵芝康葆粉剂)，每100g含灵芝多糖10g、灵芝总三萜8g，购自福建仙芝楼生物科技有限公司；淫羊藿提取物，购自北京珅奥基医药生物科技有限公司，每100g含淫羊藿苷58g、朝藿定A 6g、朝藿定B11g、朝藿定C25g。
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为2.4g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为1.2g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在20mL HC-A液中加入0.48mL灵芝提取液和0.4mL淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.4，采用高温高压(l09℃，45min)消毒，即得改良肾脏保存液。
实施例5：
一种肾脏保存液的改良方法
原料及试剂：HC-A液，购自上海长征医院；灵芝提取物(灵芝康葆粉剂)，每100g含灵芝多糖10g、灵芝总三萜8g，购自福建仙芝楼生物科技有限公司；淫羊藿提取物，购自西安岳达植物科技有限公司，每100g含淫羊藿苷56g、朝藿定A 6g、朝藿定B19g、朝藿定C19g；二苯乙烯苷，购自上海瑞永生物科技有限公司。二苯乙烯苷属于何首乌的主要有效成分，其在HC-A液中的加入能够进一步缓解钙超载现象，这可能是因为二苯乙烯苷的加入能协助提高改良肾脏保存液对肾皮质线粒体钙酶活性，同时增益灵芝提取物和淫羊藿提取物对炎性反应，最终减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤。优选地，一种肾脏保存液的改良方法，包括如下步骤：
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为1.0-3.5g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为0.2-1.8g/mL的淫羊藿提取液；
S3：利用注射用水将二苯乙烯苷制备成浓度为2.5-10mg/mL的二苯乙烯苷液；
S4：在HC-A液中加入灵芝提取液、淫羊藿提取液和二苯乙烯苷液，用磷酸调节pH值至7.3-7.8，消毒，即得改良肾脏保存液。
更优选地，HC-A液、灵芝提取液和淫羊藿提取液的体积比为100:1.5-3.0:1.5-3.0:1.5-3.0。
在本实施例中，一种肾脏保存液的改良方法，包括如下步骤：
S1：利用注射用水将灵芝提取物制备成浓度为2.4g/mL的灵芝提取液；
S2：利用注射用水将淫羊藿提取物制备成浓度为1.2g/mL的淫羊藿提取液；
S3：利用注射用水将二苯乙烯苷制备成浓度为5mg/mL的二苯乙烯苷液；
S4：在20mL HC-A液中加入0.48mL灵芝提取液、0.4mL淫羊藿提取液和二苯乙烯苷液，用磷酸调节pH值至7.4，采用高温高压(l09℃，45min)消毒，即得改良肾脏保存液。
试验例1：
1.测定改良肾脏保存液的胶体渗透压和电解质
改良肾脏保存液的胶体渗透压和电解质的测定结果如表1，从表1中可以看出，实施例1-5改良肾脏保存液的胶体渗透压稍高于HC-A液，实施例1-5改良肾脏保存液中离子构成及各离子浓度与HC-A液相似。
表1改良肾脏保存液的胶体渗透压和电解质
Figure BDA0002721994780000051
2.测定改良肾脏保存液的稳定性
在4℃下保存7d后测定改良肾脏保存液的电解质，结果如表1。从表1中可以看出，实施例1-5改良肾脏保存液的电解质无明显变化，说明实施例1-5改良肾脏保存液在低温保存过程中各组分稳定。
表2改良肾脏保存液在4℃下保存7d后的电解质
Figure BDA0002721994780000061
试验例2：
改良肾脏保存液对大鼠离体肾脏低温保存的作用
一、实验动物
清洁级雄性SD大鼠，体重200±10g，购自广东省医学实验动物中心。
二、主要试剂
水合氯醛：购自国药集团化学试剂有限公司；
肝素钠注射液：购自常州千红生化制药股份有限公司，1.6mL肝素钠注射液(10000U)溶于100mL生理盐水中(100U/mL)，摇匀，置于0-4℃保存备用；
线粒体呼吸控制率试剂盒：购自上海杰美基因生物研究所；
考马斯亮兰贮备液、钙离子测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；
Bax、Bcl-2多克隆抗体：购自北京中杉生物技术有限公司；
MDA试剂盒、SOD试剂盒、TNF-α试剂盒、IL-1β试剂盒、抗炎因子IL-10试剂盒：购自美国R&D公司；
HMGB1试剂盒：购自德国IBL公司。
三、方法
1.实验动物离体肾脏单纯低温保存模型的建立
1.1实验分组：根据改良肾脏保存液的不同，实验分成HCA保存液组(K组)、实施例1改良肾脏保存液组(实施例1组)、实施例2改良肾脏保存液组(实施例2组)、实施例3改良肾脏保存液组(实施例3组)、实施例4改良肾脏保存液组(实施例4组)和实施例5改良肾脏保存液组(实施例5组)，每组12只；根据保存时间的不同，再随机分成24h组和72h组，每组6只。
1.2肾脏切取
采用大鼠肾脏原位灌注模型
供体术前不禁食不禁水。术前30min，采用10％水合氯醛按0.3mL/100g行腹腔内注射麻醉，3min后麻醉效果稳定开始手术；大鼠被固定于手术台上，用剃毛刀备腹部皮，沿腹中线切开并分离皮肤，之后切开腹直肌和腹膜，上至胸骨剑突，下到耻骨上缘，切口成大十字形，即中部向左右横向延长切开；分离腹主动脉，阻断其下方，在左肾下1.5cm处的腹主动脉插入留置针并固定，注射肝素钠1500U后，分别用HCA保存液和aFGF复方保存液行重力灌洗，流速12mL/min，压力7.84-9.81kPa，即80-100cm H2O柱，灌注时间在5min内。同时阻断近胸腔的腹主动脉，并在肾静脉平面下剪开下腔静脉，为灌注液的引流出口。当肾表面转变为苍白色且肾静脉引出液体清亮表示肾灌洗充分。灌洗完毕后，摘取肾脏分别于HCA保存液和改良肾脏保存液中4℃低温环境保存24h、72h。
2.肾脏组织病理学观察
2.1标本采集
肾脏经中部横切分为上下两部分，上半部分用于病理学观察。下半部分迅速置于液氮中保存，用于指标检测。
2.2肾脏组织病理学观察
在肾脏于4℃低温环境保存24h、72h后，按光镜病理要求取肾皮质标本，用10％中性甲醛固定。按常规制作石蜡切片后行HE染色，光镜观察。
病理科医生对检查结果进行单盲分析。光镜切片观察基本的形态学类型：胞浆空泡形成，基底膜裸露，细胞坏死，小管扩张和细胞脱落。根据上述病理形态分别进行评分：无异常或损伤波及不高于10％样本记为1分；轻度损伤10-20％样本记为2分；损伤波及25％-50％样本记为3分；损伤波及50-75％样本记为4分；损伤波及范围超过75％样本记为5分。累加后即为此样本得分，每例3个样本均参与评分，取其平均值作为该例病理检查最终得分，从而综合全面的评估肾损伤程度。
2.3各组肾脏组织病理评分结果见表3，可以看出，各组肾脏保存液24h肾皮质病理积分显著低于72h；实施例1-4组肾皮质病理积分均低于HC-A液组，这说明HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物有利于肾脏的保存；实施例5组肾皮质病理积分稍高于实施例1组，这说明二苯乙烯苷的加入对灵芝提取物和淫羊藿提取物的保存效果有增益的作用。
表3各组肾脏组织病理评分
Figure BDA0002721994780000081
3.肾组织线粒体呼吸控制率的测试
3.1分离肾细胞线粒体：在肾脏于4℃低温环境保存24h、72h后，准确称取肾肾皮质重量将其剪碎，净血，加9倍生理盐水制成匀浆，4℃、3000r/min离心10min，取上清液4℃、4000r/min离心15min，将沉淀与0.25mol/L蔗糖溶液混匀后4℃、4000r/min离心10min，沉淀物即为线粒体。
3.2方法：1)将线粒体呼吸控制率定量检测试剂介质液到加入反应玻璃槽，用微型磁力子搅拌，充分混匀，密封反应槽，记录氧浓度，起始饱和氧浓度值为0.24微摩尔分子氧/毫升(25℃)；2)注射加入待测的线粒体，然后加入线粒体呼吸控制率定量检测试剂IV态底物液开始IV态呼吸；3)加入线粒体呼吸控制率定量检测试剂III态底物液开始III态呼吸，氧浓度迅速下降下行斜线出现拐点时结束检测。
3.3线粒体呼吸控制率：呼吸控制率又称呼吸调节比，是指III态(加入ADP)的呼吸速率与IV态(ADP耗竭)的呼吸速率之比。正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。它是评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标之一。
3.4结果分析：肾脏低温保存期间线粒体呼吸控制率的测定结果如表4，可以看出，低温保存24h，实施例1-4组线粒体呼吸控制率均稍高于HC-A液组，亦即实施例1-5肾脏保存液对保存肾皮质线粒体完整性优于HC-A液；低温保存72h，实施例1-4组线粒体呼吸控制率均显著高于HC-A液组，亦即实施例1-5肾脏保存液对保存肾皮质线粒体完整性优于HC-A液；以上结果说明HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物能保护缺血再灌注肾脏线粒体结构的完整性和氧化磷酸化的耦联程度，保护离体肾脏低温保存时肾皮质细胞能量代谢，有利于肾脏的保存。此外，低温保存24h和72h，实施例5组线粒体呼吸控制率均稍高于实施例1，亦即实施例5肾脏保存液对保存肾皮质线粒体完整性优于实施例1肾脏保存液，这说明二苯乙烯苷的加入对灵芝提取物和淫羊藿提取物的保存效果有增益作用。
表4肾脏低温保存期间线粒体呼吸控制率
Figure BDA0002721994780000082
4.肾皮质线粒体中钙离子含量测定
4.1分离肾皮质线粒体制成线粒体匀浆：在肾脏于4℃低温环境保存24、72h后，准确称取肾肾皮质重量将其剪碎，净血，加9倍生理盐水制成匀浆，4℃、3000r/min离心10min，取上清液4℃、4000r/min离心15min，将沉淀与0.25mol/L蔗糖溶液混匀后4℃、4000r/min离心10min，沉淀物即为线粒体。将肾细胞线粒体制成每毫升含2-3mg线粒体蛋白的悬浮液，进行超声粉碎器粉碎，即线粒体匀浆。
4.2组织蛋白测定：采用考马斯亮兰试剂，试剂配置如表5，各个试管中加入试剂，混匀后静置10min，空白管调零于595nm处1cm光径测定各管吸光度，根据如下公式计算线粒体匀浆蛋白含量：
Figure BDA0002721994780000091
表5试剂配置表
Figure BDA0002721994780000092
4.3肾皮质线粒体中钙离子测定：试剂配置如表6，各个试管中加入试剂，混匀后静置10min，空白管调零于610nm处1cm光径测定各管吸光度，根据如下公式计算线粒体中钙钙离子含量：
Figure BDA0002721994780000093
表6试剂配置表
Figure BDA0002721994780000094
4.4结果分析：保存期间肾皮质线粒体中钙离子含量测定结果如表7，可以看出，低温保存24h，实施例1-4组肾皮质线粒体中钙离子含量稍低于HC-A液组；低温保存72h，实施例1-4组肾皮质线粒体中钙离子含量明显低于HC-A液组；以上结果说明HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物有利于缓解钙超载，这可能是因为灵芝提取物和淫羊藿提取物能提高肾皮质线粒体钙酶活性，有利于肾脏的保存。此外，低温保存24h和72h，实施例5组肾皮质线粒体中钙离子含量均低于实施例1，这说明二苯乙烯苷的加入能进一步缓解钙超载，这可能是因为二苯乙烯苷的加入能协助提高改良肾脏保存液对肾皮质线粒体钙酶活性，对灵芝提取物和淫羊藿提取物的保存效果有增益作用。
表7肾脏低温保存期间线粒体呼吸控制率
Figure BDA0002721994780000101
5.肾脏组织中Bcl-2、Bax表达的测定
5.1方法：1)取肾脏组织标本，经10％中性甲醛固定，石蜡包埋制片，石蜡包埋组织连续切片，厚4μm，石蜡切片脱蜡至水；2)去除内源性过氧化物酶，3％H2O2室温10min，蒸馏水洗3min×3；3)抗原修复预处理，加0.01M枸橼酸盐抗原修复液行微波修复10min×3次，解冻温度：98℃。待其冷却后，蒸馏水洗一遍，PBS液洗3min×3次；4)添加一抗，放置4℃冰箱孵育过夜。室温下再放置30min。PBS液洗3min×3次；5)添加二抗(通用型IgG抗体-HRP多聚体二抗)，37℃温箱孵育25min，PBS液洗3min×3次；6)DAB显色；7)苏木素轻度复染，常规脱水，透明；8)干燥后，封片，显微镜观察；9)图像数据处理：严格按试剂盒说明操作，DAB显色后显微镜下观察。采用去掉第一抗体的方法作为阴性对照，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。胞浆染色呈棕黄色为阳性细胞，每张切片于阳性表达区域选取5个高倍(×400)无重叠视野，应用图像分析系统计算平均吸光光度值(OD值)，并以此作为半定量参数反映Bcl-2和Bax表达。
5.2结果分析：肾脏组织中Bcl-2、Bax表达和Bcl-2/Bax如表8所示，低温保存24h，与HC-A液组比较，实施例1-4组肾脏组织中Bcl-2的表达增多，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax总体比例上调，Bcl-2/Bax＞1.5；低温保存72h，与HC-A液组比较，实施例1-4组肾脏组织中Bcl-2的表达增多，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax总体比例上调，Bcl-2/Bax＞1.2；以上结果说明HC-A液中灵芝提取物和淫羊藿提取物的加入能够上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达，从而上调Bcl-2/Bax的比值，进而减少肾小管上皮细胞的凋亡。此外，低温保存24h，与实施例1组比较，实施例5组肾脏组织中Bcl-2的表达增多，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax总体比例上调，Bcl-2/Bax＞1.9；低温保存72h，与实施例1组比较，实施例5组肾脏组织中Bcl-2的表达增多，Bax表达减弱，Bcl-2/Bax总体比例上调，Bcl-2/Bax＞1.5；以上结果说明二苯乙烯苷能够增益灵芝提取物和淫羊藿提取物的效果。
表8肾脏组织中Bcl-2、Bax表达和Bcl-2/Bax
Figure BDA0002721994780000111
6.肾组织中SOD、MDA的测定
6.1匀浆制备：在肾脏于4℃低温环境保存24h、72h后，准确称取肾肾皮质重量将其剪碎，净血，加9倍生理盐水制成匀浆，4℃、3000r/min离心10min，此上清即10％匀浆，取上清液0.1ml加生理盐水0.9ml，稀释成1％的匀浆待测。
6.2肾组织蛋白测定：按照4.2方法进行。
6.3肾组织中SOD活力测定：试剂配置如表9，各个试管中加入试剂，充分混匀，然后在37℃恒温水浴放置40min，在各管中加入显色剂2mL，混匀后静置10min，蒸馏水调零于550nm处1cm光径测定各管吸光度，根据如下公式计算SOD活性：
Figure BDA0002721994780000112
表9试剂配置表
Figure BDA0002721994780000113
6.4肾组织中MDA含量测定：0.1mL 10％肾皮质匀浆蛋白含量测定参考4.2方法，试剂配置如表10，各个试管中加入试剂，充分混匀，然后在95℃恒温水浴放置40min，取出后流水冷却，然后4000r/mi离心10min，移液器取上清至比色管，532nm处1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸广度值。根据如下公式计算MDA含量：
Figure BDA0002721994780000121
6.5结果分析：肾组织中SOD活力测定结果如图1所示，肾组织中MDA含量测定结果如图2所示。从图1和图2中可以看出：低温保存24h，实施例1-4组肾组织中SOD活力(＞100U/mg)明显高于HC-A液组，实施例1-4组肾组织中MDA含量(＜5nmol/mg)明显低于HC-A液组；低温保存72h，实施例1-4组肾组织中SOD活力(＞85U/mg)明显高于HC-A液组，实施例1-4组肾组织中MDA含量(＜7.5nmol/mg)明显低于HC-A液组；低温保存24h和72h，实施例5组中SOD活力和MDA含量分别与实施例1组相当。以上结果说明：HC-A液中灵芝提取物和淫羊藿提取物的加入能够提高离体肾组织抗氧化酶SOD活性，从而降低离体肾脏组织的细胞脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)的含量；二苯乙烯苷对灵芝提取物和淫羊藿提取物改善HC-A液抗氧化性的技术效果无不良影响。
7.肾组织中炎症因子水平的测定
7.1匀浆制备：在肾脏于4℃低温环境保存24、72h后，准确称取肾肾皮质重量将其剪碎，净血，加9倍生理盐水制成匀浆，4℃、3000r/min离心10min取上清，待测。
7.2炎症因子水平的测定：采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β、HMGB1、IL-10含量，以TNF-α的测定为例，具体步骤为：1)将所有试剂带到室温条件下进行样品试剂的准备，配比工作液，进行标准品的准备；2)清洗微孔板：用300μL的洗液静置于微孔板內30s，随后弃掉洗液，用吸水纸将微孔板拍干备用；3)加样：除标准孔外，每孔加入50μL缓冲液和50μL样本，加样时应保持连续不间断，加样过程在15min内完成；4)孵育：使用新的封板膜封板，300r/min震荡，室温下孵育2h；5)洗涤：将液体弃掉后每孔加入洗液300μL洗涤6次，用吸水纸拍干；6)孵育：使用新的封板膜封板，300r/min震荡，室温下孵育45min；7)加酶：每孔加入100μL辣根过氧化酶标记物；8)显色；每孔加入底物液100μL，混合均匀后，于室温下避光盈色15min；9)终止及测定：每孔加终止液100μL,终止反应，并于20min内在酶标仪上,450mn的波长依次测定各孔的光密度值。
7.3结果分析：肾组织中TNF-α、IL-1β、HMGB1、IL-10含量如图3-6所示，可以看出：低温保存24h，实施例1-4组肾组织中TNF-α、IL-1β、HMGB1含量明显低于HC-A液组，实施例1-4组肾组织中IL-10含量明显高于HC-A液组；低温保存72h，实施例1-4组肾组织中TNF-α、IL-1β、HMGB1含量明显低于HC-A液组，实施例1-4组肾组织中IL-10含量明显高于HC-A液组；低温保存24h和72h，实施例5组肾组织中TNF-α、IL-1β、HMGB1含量均低于实施例1组，实施例5组肾组织中IL-10含量高于实施例1组。以上结果说明：HC-A液中灵芝提取物和淫羊藿提取物的加入能够下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及HMGB1含量，上调抗炎细胞因子IL-10含量；二苯乙烯苷的加入能够进一步下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及HMGB1含量，上调抗炎细胞因子IL-10含量，增益灵芝提取物和淫羊藿提取物对炎性反应，最终减轻离体肾脏低温保存期的缺血损伤。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肾脏保存液的改良方法，在HC-A液中加入灵芝提取物和淫羊藿提取物，所述的灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜；所述的淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
2.根据权利要求1所述的一种肾脏保存液的改良方法，其特征是：所述的灵芝提取物中至少含8wt％灵芝多糖，3wt％灵芝总三萜。
3.根据权利要求1所述的一种肾脏保存液的改良方法，其特征是：所述的淫羊藿提取物中含淫羊藿苷、朝藿定A和/或朝藿定B和/或朝藿定C。
4.根据权利要求1所述的一种肾脏保存液的改良方法，其特征是：所述的淫羊藿提取物中至少含55wt％淫羊藿苷，40wt％朝藿定。
5.根据权利要求1所述的一种肾脏保存液的改良方法，其特征是：所述的改良方法包括如下步骤：
S1：将灵芝提取物制备成浓度为1.0-3.5g/mL的灵芝提取液；
S2：将淫羊藿提取物制备成浓度为0.2-1.8g/mL的淫羊藿提取液；
S3：在HC-A液中加入所述的灵芝提取液和淫羊藿提取液，用磷酸调节pH值至7.3-7.8，消毒，即得改良肾脏保存液。
6.根据权利要求5所述的一种肾脏保存液的改良方法，其特征是：所述的HC-A液、灵芝提取液和淫羊藿提取液的体积比为100:1.5-3.0:1.5-3.0。
7.灵芝提取物联合淫羊藿提取物在预防或治疗人或非人动物的急性缺血性肾衰的药物的用途，其特征是：所述的灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜；所述的淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
8.灵芝提取物联合淫羊藿提取物在制备肾脏保存液中的用途，其特征是：所述的灵芝提取物中含灵芝多糖和灵芝总三萜；所述的淫羊藿提取物中含淫羊藿苷和朝藿定。
9.权利要求1所述的改良方法获得的改良肾脏保存液在没有血液供应的情况下用于保存肾脏。
10.一种防止再灌注后离体肾脏损伤或降低其严重性的方法，包括，将离体肾脏保存在权利要求1所述的改良方法获得的改良肾脏保存液中。
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