CN103651332A - 一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，在人精液基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中添加有一定浓度的二十二碳六烯酸，二十二碳六烯酸的加入能改善精子冷冻保护剂的应用效果；本发明还公开了上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法，该方法工艺简单。

Description

一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂及其制备方法

技术领域

本发明属于人精液冷冻保护剂技术领域，具体涉及一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂及其制备方法。

背景技术

精子是带有遗传物质的特殊细胞。精液经过技术处理，在冷冻保护剂的保护下，经过一定的降温程序，保存在超低温（液氮中），精子呈现玻璃样的冻结，不会出现原生质脱水，其本来结构受到保护，所以解冻后的精子仍能复苏，恢复活力。冷冻状态的精子代谢活动受到明显抑制，其生命处于静止状态，从而达到能长期保存的目的。

精子冷冻保护剂是精子冷冻技术的最重要物质。目前最常用的精子冷冻保存剂是含甘油和卵黄的复合型冷冻液，由甘油、卵黄、单糖、枸橼酸钠等组成。冷冻保护剂根据作用机理分为渗透性冷冻保护和非渗透性冷冻保护，甘油属于渗透性冷冻保护剂，非渗透性冷冻保护剂有果糖、蔗糖、卵黄、白蛋白等。渗透性冷冻保护剂渗入细胞内，降低细胞内外渗透压的差距，当细胞外冻结时，减轻细胞皱缩的程度和速度；还能与细胞内水分及电解质结合，导致水合结构蛋白的稳定，发挥抗冻作用。非渗透性冷冻保护剂不能进入细胞，通过维持细胞膜的稳定起保护作用，冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞发生皱缩，从而减少细胞内的冰晶形成。

人精子膜的脂类含量约占50%以上。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。细胞膜是由脂类构成的双分子层结构，膜脂类具有亲水和疏水的两部分，为脂肪酸。脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸多含2个以上的双键，称多不饱和脂肪酸，由于多不饱和脂肪酸中双键位置的不同，其构型则完全不同、功能也不同。因此，细胞膜中脂肪酸成分的不同，直接影响着细胞膜的结构、流动性和通透性，影响着膜上功能蛋白的构象和功能发挥。

研究表明，二十二碳六烯酸具有调节膜相关的生理过程、抗肿瘤抗炎、促进细胞生长、防止心脑血管疾病、有利于大脑视网膜形成、免疫调节和基因表达等很多重要的生理调节功能。作为细胞膜膜脂的重要组成成分，二十二碳六烯酸对细胞膜结构、流动性、相转变、信号转导、物质运输、离子交换、能量传递以及酶活性大小等方面具有重要的调节作用。

人精子膜含有大量脂类，其中二十二碳六烯酸起着非常重要作用，二十二碳六烯酸属于非渗透性冷冻保护剂，在维持细胞膜稳定性方面发挥保护作用。

目前，还未有人将二十二碳六烯酸用于人精液冷冻保护剂中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，二十二碳六烯酸的加入能改善精子冷冻保护剂的应用效果。

本发明的目的还在于提供上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法，该方法工艺简单。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，在人精液基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有二十二碳六烯酸。

本申请发明人经过研究表明，正常生育力男性精子二十二碳六烯酸含量明显高于不育男性，此种差别可能与人精子的功能学密切相关。所以，本申请发明人得到启发，在人精子冷冻保护剂中加入二十二碳六烯酸以降低人精子的冷冻损伤，从而提高人精子的功能。

本发明所述基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂主要由以下浓度的组分组成：甘油15%（体积百分含量），甘氨酸13g/L，卵黄20%（体积百分含量），葡萄糖15g/L，柠檬酸三钠二水13g/L。

评价精子冷冻水平的最重要和最常用的指标就是精子冻融复苏后的活力，具有前向运动能力的精子百分率最具代表性，因此，本申请发明人设计并实施了实验研究，在目前常用的基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂配方中加入二十二碳六烯酸，组成多个不同配比的配方，应用于人精子冷冻，观察精子冻融复苏后的活力和功能是否改善。本申请发明人不仅观察了比较冷冻前后的前向运动精子百分率，还观察比较了冷冻前后精子正常形态率、存活率、DNA完整率，这些指标能够较好地评价精子功能以及精子生理和毒理安全性。通过大量试验，本申请发明人发现：

本发明所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中优选添加有0.15-5.0g二十二碳六烯酸。

本发明所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中更优选添加有0.15-1.25g二十二碳六烯酸。

本发明所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中进一步优选添加有0.30-0.63g二十二碳六烯酸。

当在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加0.15-1.25 g二十二碳六烯酸时，冷冻后复苏精子的前向活动率、存活率、正常形态率和DNA完整率均有所升高，尤其当二十二碳六烯酸浓度在0.30-0.63g/L时，冷冻后复苏精子的前向活动率、存活率、正常形态率和DNA完整率均明显高于对照组，具有显著性差异（P<0.05）。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法，含以下步骤：

（1）制备基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂；

（2）在基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中加入二十二碳六烯酸，混匀后，冷冻保存即可。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂加入一定量的二十二碳六烯酸（二十二碳六烯酸浓度在0.30-0.63g/L），对人精子冷冻效果有明显改善，复苏后的人精子功能学参数：前向活动率、存活率显著高于对照组（未添加二十二碳六烯酸），且正常形态率和DNA完整率也明显高于对照组，提示对人精子质量保护更具有良好的安全性。

附图说明

图1是实施例1-6和对照实施例（甘氨酸甘油复合型人精液冷冻保护剂）冷冻精液复苏后检测精子前向活动率、存活率、正常精子形态率和精子DNA完整率结果，其中7指对照实施例甘氨酸甘油复合型人精液冷冻保护剂，2-6依次指二十二碳六烯酸+甘氨酸甘油复合型人精液冷冻保护剂中二十二碳六烯酸浓度分别为5.00g/L、2.50g/L、1.25g/L、0.63g/L、0.30g/L、0.15g/L。

具体实施方式

第一部分实施例和对照实施例人精液冷冻保护剂组分及制备方法

实施例1 

本实施例提供的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，在人精液基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有二十二碳六烯酸，其中在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有5.00g二十二碳六烯酸， 1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂主要由以下浓度的组分组成：甘油15%（体积百分含量），卵黄20%（体积百分含量），葡萄糖15g/L，柠檬酸三钠二水13g/L，甘氨酸13g/L。

上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法如下：

（一）基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂的制备（100mL）

（1）称量1.5g葡萄糖和1.3g柠檬酸三钠二水，加消毒的纯净水至65mL；

（2）加入15mL甘油完全混匀；

（3）加入1.3g甘氨酸，完全溶解后用0.45微米微孔滤器过滤；

（4）加入20mL新鲜卵黄（无病原蛋）：清洗鸡蛋，去壳，刺破卵膜，用注射器吸取卵黄；

（5）所制成的悬浮液置56℃水浴中40分钟，经常搅拌；

（6）检测溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之间；

（7）溶液送细菌培养，要求无菌；

（8）冷藏保存。

（二）添加二十二碳六烯酸

其中二十二碳六烯酸组分的含量为5.00g/L，二十二碳六烯酸购自sigma公司，纯度大于等于98%，二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备过程如下：

（1）将甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂37℃水浴解冻；

（2）二十二碳六烯酸从冰箱内取出，置37℃恒温试管架内20分钟；

（3）分别取二十二碳六烯酸5.00mg加入10mL甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂，制成二十二碳六烯酸含量为5.00g/L的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂；

（4）在超净台中将溶液以0.4mL分装，-70℃保存备用。

实施例2

本实施例提供的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，在人精液基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有二十二碳六烯酸，其中在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有2.50g二十二碳六烯酸， 1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂主要由以下浓度的组分组成：甘油15%（体积百分含量），甘氨酸13g/L，卵黄20%（体积百分含量），葡萄糖15g/L，柠檬酸三钠二水13g/L。

上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法如下：

（一）基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂的制备（100mL）

（1）称量1.5g葡萄糖和1.3g柠檬酸三钠二水，加消毒的纯净水至65mL；

（2）加入15mL甘油完全混匀；

（3）加入1.3g甘氨酸，完全溶解后用0.45微米微孔滤器过滤；

（4）加入20mL新鲜卵黄（无病原蛋）：清洗鸡蛋，去壳，刺破卵膜，用注射器吸取卵黄；

（5）所制成的悬浮液置56℃水浴中40分钟，经常搅拌；

（6）检测溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之间；

（7）溶液送细菌培养，要求无菌；

（8）冷藏保存。

（二）添加二十二碳六烯酸

其中二十二碳六烯酸组分的含量为2.50g/L，二十二碳六烯酸购自sigma公司，纯度大于等于98%，二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备过程如下：

（1）将甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂37℃水浴解冻；

（2）二十二碳六烯酸从冰箱内取出，置37℃恒温试管架内20分钟；

（3）分别取二十二碳六烯酸2.50mg加入10mL甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂，制成二十二碳六烯酸含量为2.50g/L的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂；

（4）在超净台中将溶液以0.4mL分装，-70℃保存备用。

实施例3

与实施例1不同的是，在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有1.25g二十二碳六烯酸。

实施例4

与实施例1不同的是，在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有0.63g二十二碳六烯酸。

实施例5

与实施例1不同的是，在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有0.30g二十二碳六烯酸。

实施例6

与实施例1不同的是，在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂中添加有0.15g二十二碳六烯酸。

对照实施例

卵黄-甘油-柠檬酸盐型人精液冷冻保护剂的制备方法如下：

（一）基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂的制备（100mL）

（1）称量1.5g葡萄糖和1.3g柠檬酸三钠二水，加消毒的纯净水至65mL；

（2）加入15mL甘油完全混匀；

（3）加入1.3g甘氨酸，完全溶解后用0.45微米微孔滤器过滤；

（4）加入20mL新鲜卵黄（无病原蛋）：清洗鸡蛋，去壳，刺破卵膜，用注射器吸取卵黄；

（5）所制成的悬浮液置56℃水浴中40分钟，经常搅拌；

（6）检测溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之间；

（7）溶液送细菌培养，要求无菌；

（8）在超净台中将溶液以0.4mL分装，-70℃保存备用。

第二部分实施例和对照实施例人精液冷冻操作和检测指标

（一）实施例和对照实施例冷冻保护剂加入精液方法及冷冻程序

（1）37℃水浴解冻实施例和或对照实施例冷冻保护剂；

（2）1份体积实施例或对照实施例冷冻保护剂加入到2份体积精液中，逐滴加入同时旋转试管；

（3）加入冷冻保护剂后，混合液分装在精子冷冻管，在30-35℃孵育5min；

（4）液氮蒸汽法冷冻。

（二）检测指标及操作

评价精子冷冻水平的最重要和最常用的指标就是精子冻融复苏后的活力，具有前向运动能力的精子百分率最具代表性，因此，本申请发明人设计并实施了实验研究，在目前常用的精子冷冻保护剂配方中加入二十二碳六烯酸，组成多个不同配比的配方，应用于人精子冷冻，观察精子冻融复苏后的活力和功能是否改善。我们不仅观察比较冷冻前后的前向运动精子百分率，还观察比较冷冻前后精子正常形态率、存活率、DNA完整率，这些指标能够较好地评价精子功能以及精子生理和毒理安全性。

本发明申请人为研究不同二十二碳六烯酸浓度配比的精子冷冻保护剂的冷冻效果，经过预实验探索，确定采用完全随机区组设计结合重复测量设计，以30例取自自愿者的精液样本为实验对象，每例样本均分为7份，分别使用实施例1-6不同二十二碳六烯酸浓度的保护剂（二十二碳六烯酸浓度分别为：实施例1：5.00g/L；实施例2：2.50g/L；实施例3：1.25g/L ；实施例4：0.63g/L ；实施例5：0.30g/L ；实施例6：0.15g/L）和对照实施例（甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂作为对照组）进行精子冷冻，采用计算机自动分析技术观察冷冻前后多个精液参数，并在精子冻融复苏后的多个时间点反复观察比对精子活力状况。

具体的试验过程如下：

精液加入二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂后，分别检测冷冻前和复苏后的人精子以下功能学参数：前向活动率、存活率、正常形态率和DNA完整率，计算复苏率。

（1）前向活动率的检测：采用西班牙产全自动计算机辅助精子分析系统检测人精子浓度和活力，结果见图1。

（2）存活率的检测：解冻冻存的人精子膨胀液，使用前充分混匀；取1mL膨胀液置于微量离心管中，37℃温热5min；取100微升充分混匀的精液加入膨胀液中，混匀；37℃孵育5min，然后取10微升加到洁净载玻片上，覆盖22mm×22mm盖玻片，使用相差显微镜在×400倍视野下，计数未膨胀（死的精子）和膨胀（活的精子）精子百分率，得出人精子的存活率，结果见图1。

（3）精子形态学参数的检测：按照WHO第五版的方法涂片，然后全自动染片机按照改良巴氏染色程序进行染色，西班牙产全自动智能精子形态分析系统进行精子形态学多种参数的检测，结果见图1。

（4）DNA完整率的检测：采用精子染色质结构试验（SCSA），能够预示体内和体外的受精失败。方法：精液液化并计数，取液化精液1.0mL加于离心管内，1000g离心5min，去除精浆。加1mL稀释洗涤液，充分混匀。500g离心5min，去上清液，如此共洗涤3次；最后一次洗涤完毕，弃上清液，用稀释洗涤液调整精子浓度为50×10⁶/mL。取5-10μL悬浮液于清洁载玻片上涂片，晾干，滴加数滴固定液固定10min，后将玻片直立于吸水纸上以除去固定液；滴加数滴新鲜配制的吖啶橙工作液染色5min，流水冲洗，晾干；荧光显微镜高倍镜下观察。计数200条精子中绿色、红色和橙黄色精子数，其中绿色为DNA双链精子，红色为DNA单链精子，橙黄色为DNA双链不稳定精子。计算出绿色荧光DNA双链精子的百分率，结果见图1。

图1中的数据分析结果表明：实施例4和实施例5冷冻复苏后精子活力明显高于实施例1-3以及实施例6和对照实施例（P<0.05），精子形态学指标和精子DNA完整率明显优于其它配方（P<0.05）。所以，一定浓度范围的二十二碳六烯酸能改善精子冷冻保护剂的应用效果。尤其是当二十二碳六烯酸浓度为0.30-0.63 g/L时，冷冻复苏后精子活力明显偏高。

 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，其特征是：在人精液基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中添加有二十二碳六烯酸。

2.根据权利要求1所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，其特征是：所述基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂主要由以下浓度的组分组成：甘油15%（体积百分含量），甘氨酸13g/L，卵黄20%（体积百分含量），葡萄糖15g/L，柠檬酸三钠二水13g/L。

3.根据权利要求1或2所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，其特征是：所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中添加有0.15-5.0 g 二十二碳六烯酸。

4.根据权利要求3所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，其特征是：所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中添加有0.15-1.25 g 二十二碳六烯酸。

5.根据权利要求1或2所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂，其特征是：所述二十二碳六烯酸的浓度为在1L基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中添加有0.30-0.63 g 二十二碳六烯酸。

6.权利要求3所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油复合型人精液冷冻保护剂的制备方法，其特征是含以下步骤：

（1）制备基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂；

（2）在基础冷冻保护剂甘氨酸-甘油复合型冷冻保护剂中加入二十二碳六烯酸，混匀后，冷冻保存即可。

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