CN105746494B - 一种含有d-海藻糖的人类精子冷冻保护剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有D‑海藻糖的人类精子冷冻保护剂及其制备方法。本发明主要是解决现有人类精子慢速冷冻保护剂存在的精子活动力下降和复苏率偏低的技术问题。本发明的技术方案是：一种含有D‑海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：葡萄糖1.5‑1.6g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.0‑2.5g和去离子水60ml。其制备方法是：1)在去离子水中加入葡萄糖、柠檬酸三钠二水合物和D—海藻糖制得混合液；2)再加入甘油和甘氨酸；3)过滤器过滤；4)加入卵黄；5)放入水浴箱中孵育；6)检测溶液的pH值；7)进行无菌检测；8)进行精子存活试验检测；9)放入的试管中在–70℃下保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂及其制备方法，它属于一种用于人类精子的超低温冷冻保存剂及其生产方法。
背景技术
人类精子冷冻技术是生殖医学中的重要领域，精子的活动能力与男性生育力明显相关，在人类精子保存工作中，冷冻保护剂配制，直接决定了复苏后精子的质量。人类精子的冷冻按照精子数量的多少分为快速冷冻和慢速冷冻方法，快速冷冻方法主要用于精子数量极少的标本，采用玻璃化冷冻方法达到快速降温的目的。而对于冷冻精子数量多，精液量大的标本，只能采用慢速冷冻达到冷冻目的，这也是人类精子库大量冷冻保存精液的方法。
多年来，科学家一直在探索，不断提高精子的复苏率，众多学者对精子冷冻保护剂做了大量研究。冷冻保护剂按照添加甘油的多少分三类：单一甘油型、甘油复合型、无甘油型。人类精子库应用较多的是甘油复合型。在精子冷苏过程中，细胞内冰晶的形成及溶液效应是精子损伤的主要原因，甘油是一种渗透型保护剂，与精液混合后，能很快渗入精子细胞内，降低细胞内液冰点，减少冰晶的形成，达到保护精子膜的作用，已经报道的保护剂成份不一，冷冻效果存在差异。最常采用的冷冻保护液配方为WHO《人类精液检查与处理实验手册(第五版)》推荐的基准配方。该基准配方可以满足一般需求，但采用该配方冷冻的精子复苏率较低，导致捐精志愿者合格率很低，维持在10％左右，为了提高捐精合格率，各精子库在不断的改进冷冻方法和冷冻保护剂。
发明内容
本发明的目的是解决现有人类精子慢速冷冻保护剂存在的精子活动力下降和复苏率偏低的技术问题，提供一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：
葡萄糖1.5-1.6g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.0-2.5g和去离子水60ml。
一种制备上述的含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂的方法，其包括下列步骤：
1)在60ml的无菌去离子水中加入1.5-1.6g的葡萄糖、1.3g的柠檬酸三钠二水合物和2.0-2.5g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；
2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均匀后再加入1.3g的甘氨酸，搅匀；
3)上述步骤中的物质完全溶解后用0.22μm的细孔过滤器过滤；
4)在过滤后的溶液中加入20ml的新鲜鸡蛋卵黄；
5)将加入鸡蛋卵黄的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分钟，并且每隔5分钟搅拌一次；
6)孵育完成后，检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，丢弃重新制备；若在6.8-7.2之间，用1N无菌NaOH溶液调pH值至7.2；
7)对pH值达到7.2的溶液细菌培养进行无菌检测；
8)对无菌检测后的溶液再进行精子存活试验检测；
9)把通过精子存活试验检测后的溶液分到5ml-10ml的试管中，并在–70℃下进行保存。
所述鸡蛋卵黄的提取方法为：新鲜鸡蛋洗净，蛋壳75％酒精擦拭，把蛋壳剥去，分离完整蛋黄，用注射器穿刺蛋黄膜抽取到蛋黄，一个鸡蛋取5-7ml的蛋黄。
为表明本发明保护剂对人类精子慢速冷冻的效果，本发明进行了对比实验。
实验方法：采用某精子库合格捐精者20例，连续两次禁欲3-5天，采用第二次标本，入选者要求：年龄22-30岁，采精前禁欲5-7天，精液标本前向运动精子比例大于60％，精子计数≥60×106/ml,精液量≥2ml。精液标本充分混匀后分成两份，分别采用本发明保护剂和WHO推荐的卵黄甘油冷冻保护液按照统一的精子冷冻程序进行冷冻，做复苏后精子活力和运动参数的比较。评价指标包括精子活力评估、CASA精子运动参数、脂质过氧化参数总超氧化物歧化酶(T-sod)和丙二醛(MDA)。
数据分析：对两种冷冻保护液复苏后指标进行配对T检验统计分析,见表1。
表1：配对实验统计分析结果
*表示p＜0.05，**表示p＜0.01
实验结果：两组保护液在冷冻后，前向运动精子、不动精子、曲线速度VCL、直线速度VSL、平均速度VAP、线性指数LIN、直线指数STR指标间存在统计学意义。本发明保护剂在精子活力指标前向运动精子比例明显高于对照组。复苏后精子运动参数，包括精子的直线运动、曲线运动、运动速度等均高于对照组，说明本发明保护剂在人类精子冷冻过程中能提高冷冻保护效果。
本发明保护剂的复苏标本的T-SOD明显提高，SOD对精液中的氧化与抗氧化平衡起到至关重要的作用，能有效降低超氧阴离子自由基，保护精子免受损伤。实验显示，尽管MDA在两组间无统计学意义，但本发明的保护液标本MDA均数为49.72nmol/l,低于对照组51.97。实验组还有降低趋势。MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引起脂质过氧化的产物，可反映精液中脂质过氧化的程度，间接反映精子损伤的程度。可以说明，添加海藻糖后，SOD活力提高，反映出精液清除氧自由基的能力提高，但MDA降低不明显，提示精子受攻击的严重程度不明显。
上述实验证明本发明具有下列效果。
1、本发明冷冻保护剂能有效提高复苏人类精子前向运动的比例，能有效提高人类精子复苏后的运动速度和运动指数，对提高人类精子冷冻的复苏率、提高人类精子库志愿者的捐精合格率有重大有益效果。
2、本发明冷冻保护剂可有效提高冷冻精液标本的SOD活力提高，反映出精液清除氧自由基的能力提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中的一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：
葡萄糖1.5g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.0g和去离子水60ml。
一种制备上述实施例中的含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂的方法，其包括下列步骤：
1)在60ml的无菌去离子水中加入1.5g的葡萄糖、1.3g的柠檬酸三钠二水合物和2.0g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；
2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均匀后再加入1.3g的甘氨酸，搅匀；
3)上述步骤中的物质完全溶解后用0.22μm的细孔过滤器过滤；
4)在过滤后的溶液中加入20ml的新鲜鸡蛋卵黄；
5)将加入鸡蛋卵黄的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分钟，并且每隔5分钟搅拌一次；
6)孵育完成后，检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，丢弃重新制备；若在6.8-7.2之间，用1N无菌NaOH溶液调pH值至7.2；
7)对pH值达到7.2的溶液细菌培养进行无菌检测；
8)对无菌检测后的溶液再进行精子存活试验检测；
9)把通过精子存活试验检测后的溶液分到5ml的试管中，并在–70℃下进行保存。
上述鸡蛋卵黄的提取方法为：新鲜鸡蛋洗净，蛋壳75％酒精擦拭，把蛋壳剥去，分离完整蛋黄，用注射器穿刺蛋黄膜抽取到蛋黄，一个鸡蛋取5-7ml的蛋黄。
实施例2
本实施例中的一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：
葡萄糖1.6g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.5g和去离子水60ml。
一种制备上述实施例中的含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂的方法，其包括下列步骤：
1)在60ml的无菌去离子水中加入1.6g的葡萄糖、1.3g的柠檬酸三钠二水合物和2.5g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；
2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均匀后再加入1.3g的甘氨酸，搅匀；
3)上述步骤中的物质完全溶解后用0.22μm的细孔过滤器过滤；
4)在过滤后的溶液中加入20ml的新鲜鸡蛋卵黄；
5)将加入鸡蛋卵黄的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分钟，并且每隔5分钟搅拌一次；
6)孵育完成后，检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，丢弃重新制备；若在6.8-7.2之间，用1N无菌NaOH溶液调pH值至7.2；
7)对pH值达到7.2的溶液细菌培养进行无菌检测；
8)对无菌检测后的溶液再进行精子存活试验检测；
9)把通过精子存活试验检测后的溶液分到10ml的试管中，并在–70℃下进行保存。
上述鸡蛋卵黄的提取方法为：新鲜鸡蛋洗净，蛋壳75％酒精擦拭，把蛋壳剥去，分离完整蛋黄，用注射器穿刺蛋黄膜抽取到蛋黄，一个鸡蛋取5-7ml的蛋黄。
实施例3
本实施例中的一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：
葡萄糖1.55g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.2g和去离子水60ml。
一种制备上述实施例中的含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂的方法，其包括下列步骤：
1)在60ml的无菌去离子水中加入1.55g的葡萄糖、1.3g的柠檬酸三钠二水合物和2.2g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；
2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均匀后再加入1.3g的甘氨酸，搅匀；
3)上述步骤中的物质完全溶解后用0.22μm的细孔过滤器过滤；
4)在过滤后的溶液中加入20ml的新鲜鸡蛋卵黄；
5)将加入鸡蛋卵黄的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分钟，并且每隔5分钟搅拌一次；
6)孵育完成后，检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，丢弃重新制备；若在6.8-7.2之间，用1N无菌NaOH溶液调pH值至7.2；
7)对pH值达到7.2的溶液细菌培养进行无菌检测；
8)对无菌检测后的溶液再进行精子存活试验检测；
9)把通过精子存活试验检测后的溶液分到8ml的试管中，并在–70℃下进行保存。
上述鸡蛋卵黄的提取方法为：新鲜鸡蛋洗净，蛋壳75％酒精擦拭，把蛋壳剥去，分离完整蛋黄，用注射器穿刺蛋黄膜抽取到蛋黄，一个鸡蛋取5-7ml的蛋黄。
Claims (3)
1.一种含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂，其特征在于：每100ml的人类精子冷冻保护剂中含有下列组分的物质：
葡萄糖1.5-1.6g、柠檬酸三钠二水合物1.3g、甘氨酸1.3g、甘油20ml、鸡蛋卵黄20ml、D—海藻糖2.0-2.5g和去离子水60ml。
2.一种制备权利要求1所述的含有D-海藻糖的人类精子冷冻保护剂的方法，其特征在于：它包括下列步骤：
1)在60ml的无菌去离子水中加入1.5-1.6g的葡萄糖、1.3g的柠檬酸三钠二水合物和2.0-2.5g的D—海藻糖，制得含D—海藻糖的混合液；
2)在混合液中加入20ml的甘油，混合均匀后再加入1.3g的甘氨酸，搅匀；
3)上述步骤中的物质完全溶解后用0.22μm的细孔过滤器过滤；
4)在过滤后的溶液中加入20ml的新鲜鸡蛋卵黄；
5)将加入鸡蛋卵黄的溶液放入56℃的水浴箱中孵育40分钟，并且每隔5分钟搅拌一次；
6)孵育完成后，检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，丢弃重新制备；若在6.8-7.2之间，用1N无菌NaOH溶液调pH值至7.2；
7)对pH值达到7.2的溶液细菌培养进行无菌检测；
8)对无菌检测后的溶液再进行精子存活试验检测；
9)把通过精子存活试验检测后的溶液分到5ml-10ml的试管中，并在–70℃下进行保存。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述鸡蛋卵黄的提取方法为：新鲜鸡蛋洗净，蛋壳75％酒精擦拭，把蛋壳剥去，分离完整蛋黄，用注射器穿刺蛋黄膜抽取到蛋黄，一个鸡蛋取5-7ml的蛋黄。
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