CN112640888B

CN112640888B - 细胞保存液及其制备方法与细胞的保存方法

Info

Publication number: CN112640888B
Application number: CN202011606179.7A
Authority: CN
Inventors: 刘飞鸿
Original assignee: Shenzhen Road Medical Technology Wuhan Co ltd
Current assignee: Shenzhen Road Medical Technology Wuhan Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112640888A

Abstract

本发明公开了一种细胞保存液及其制备方法与细胞的保存方法，涉及细胞保存技术领域。本发明公开的细胞保存液含有：乙醇、Tris、EDTA·2Na、菠萝蛋白酶、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐、二异丁基萘磺酸、BSA、海藻糖、proclin300以及冰醋酸。该细胞保存液保存的细胞形态结构完整，能够有效裂解粘液和红细胞等干扰成分，避免对检测结果形成干扰，为后续制片染色提供良好的基础。

Description

细胞保存液及其制备方法与细胞的保存方法

技术领域

本发明涉及细胞保存技术领域，具体而言，涉及一种细胞保存液及其制备方法与细胞的保存方法。

背景技术

细胞病理学检查是通过对患者病变部位脱落、刮取和穿刺抽取的细胞，进行病理形态学的观察并做出定性诊断，主要应用于肿瘤的诊断，也可用于某些疾病的检查和诊断，如内部器官炎症性疾病的诊断和激素水平的判断。细胞学的标本可以是来自生殖道、呼吸道、消化道、泌尿道等分泌、排泄物中的脱落细胞，也可以是经穿刺抽取的胸、腹、心包腔、关节腔、脑脊髓膜腔液体中的脱落细胞，或经FNA技术穿刺吸取出的全身各组织器官病变处的细胞等。

液基细胞学检测技术近年来已广泛应用于细胞病理学诊断，在细胞学病理检查中有很大的诊断价值。由于细胞内自身溶酶体的作用，细胞在离体后易发生破坏溶解，难以保持活体时的形态结构，需要细胞保存液对脱离人体细胞的形态结构进行维持。多样化的临床细胞样本类型对细胞保存液有不同的要求，目前临床应用的细胞保存液有多种，但大多只针对单一类型的细胞样本，并且较多采用进口分装，其价格昂贵，增加了病人的负担。另外细胞保存液的理化性质影响后续的制片及染色效果，市场上出现的细胞保存液产品质量和制片质量等方面参差不齐。

液基细胞样本中常携带大量的粘液，粘液是由糖蛋白、脂类、非糖类蛋白质、无机盐和水等组成的水凝胶。粘蛋白的多肽骨架富含丝氨酸、苏氨酸、糖链与丝氨酸、苏氨酸的羟基侧链连接，形成O-连接的寡糖，糖基含量可达黏蛋白总重量的80％。粘液中常会包裹细胞，影响细胞制片的效果，粘液较多量往往造成制片失败。目前临床上常使用加强震荡强度、延长震荡时间、差速离心、冰冻等措施，但是效果都不明显，无法将粘液性物质溶解，也无法将粘液性物质中的上皮细胞沉淀下来，难以保证检验对有效细胞数量和质量的要求，不利于临床诊断。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞保存液及其制备方法与细胞的保存方法。本发明提供的细胞保存液保存的细胞形态结构完整，能够有效裂解粘液和红细胞等干扰成分，避免对检测结果形成干扰，为后续制片染色提供良好的基础。此外，该细胞保存液可应用于临床不同的细胞样本，均能取得较好的诊断效果，且成本较低，便于推广应用。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种细胞保存液，其含有如下组分：乙醇40～50％(v/v)、Tris0.1～0.5％(w/v)、EDTA·2Na 0.01～0.03％(w/v)、菠萝蛋白酶0.01～0.05％(w/v)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐0.01～0.05％(w/v)、二异丁基萘磺酸0.01～0.10％(w/v)、BSA0.06～0.08％(w/v)、海藻糖0.03～0.04％(w/v)、proclin300 0.01～0.03％(w/v)以及冰醋酸1.0～2.0％(v/v)。

本发明提供的细胞保存液的特点包括如下：

(1)本发明提供的细胞保存液功能齐全，主要基质为乙醇和水成分，在有效保存白细胞、脱落上皮细胞等有价值细胞的同时，对环境及操作者不造成危害。采用乙醇作为细胞固定剂，能够快速固定细胞，保持细胞形态结构的完整；采用Tris、EDTA·2Na和冰醋酸作为pH缓冲剂，使液基细胞环境的pH值维持在6.8-7.2之间，有利于后续的制片及染色效果；采用二异丁基萘磺酸和EDTA·2Na作为分散剂，能够分散细胞之间的粘连，防止细胞聚集；采用菠萝蛋白酶和三(2-羧乙基)膦盐酸盐作为粘液软化剂，能够裂解粘液，降低样本中粘液造成的干扰，提高制片质量；采用BSA和海藻糖作为细胞保护剂，保护液基细胞形态结构的稳定，延长液基细胞的保存时间；采用proclin300作为防腐剂，抑制细菌、真菌、酵母菌等病原体，延长保存液的保存时间，同时能保护工作环境和工作人员健康。

(2)该细胞保存液保存细胞类型多，特别是对血性标本和痰标本具有较好的消化处理能力，能够排除血液和粘液的干扰。该细胞保存液渗透压较低，能使红细胞膨胀破裂。该保存液中含有的菠萝蛋白酶能够分解黏蛋白中的肽键，三(2-羧乙基)膦盐酸盐能够打开蛋白质之间的二硫键，结合EDTA和二异丁基萘磺酸的分散作用，能够高效的裂解粘液，释放出包埋在粘液中的诊断细胞，防止有价值细胞的丢失。同时在降解粘液的过程中也不会损害细胞。

(3)该细胞保存液保存的细胞样品在进行液基制片时，样本预处理过程简单，只需要经过粗过滤就可以进行后续的制片，操作方法便捷，大幅度提高工作效率。

(4)该细胞保存液保存的细胞染色效果好，细胞核清晰完整，细胞质通透舒展无扭曲，细胞分布均匀，平面感好，能够缩短阅片时间，提高工作效率。

(5)该细胞保存液的原材料均为普通的生化试剂，方便易得，能够降低生产成本，并且无毒无害无污染，确保操作人员的安全，便于推广应用。

在可选的实施方式中，上述细胞保存液含有如下组分：乙醇40％(v/v)、Tris0.1％(w/v)、EDTA·2Na 0.01％(w/v)、菠萝蛋白酶0.01％(w/v)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐0.01％(w/v)、二异丁基萘磺酸0.1％(w/v)、BSA0.08％(w/v)、海藻糖0.04％(w/v)、proclin300 0.01％(w/v)以及冰醋酸1％(v/v)。

在可选的实施方式中，上述细胞保存液含有如下组分：乙醇45％(v/v)、Tris0.3％(w/v)、EDTA·2Na 0.02％(w/v)、菠萝蛋白酶0.05％(w/v)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐0.03％(w/v)、二异丁基萘磺酸0.07％(w/v)、BSA 0.07％(w/v)、海藻糖0.03％(w/v)、proclin300 0.02％(w/v)以及冰醋酸1.5％(v/v)。

在可选的实施方式中，上述细胞保存液含有如下组分：乙醇50％(v/v)、Tris0.5％(w/v)、EDTA·2Na 0.03％(w/v)、菠萝蛋白酶0.04％(w/v)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐0.05％(w/v)、二异丁基萘磺酸0.08％(w/v)、BSA0.06％(w/v)、海藻糖0.03％(w/v)、proclin300 0.03％(w/v)以及冰醋酸2.0％(v/v)。

在可选的实施方式中，所述细胞保存液的pH为6.8-7.2。

在可选的实施方式中，所述乙醇的纯度为94％-96％。

在可选的实施方式中，所述乙醇为无水乙醇。

另一方面，本发明提供制备如上所述的细胞保存液的方法，其包括：将所述乙醇、所述Tris、所述EDTA·2Na、所述菠萝蛋白酶、所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐、所述二异丁基萘磺酸、所述BSA、所述海藻糖、所述proclin300以及所述冰醋酸溶于所述水中。

在可选的实施方式中，该制备方法包括如下步骤：

步骤(1)：将所述Tris、所述EDTA·2Na、所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐、所述二异丁基萘磺酸、所述海藻糖以及所述proclin300溶解于水中，得到第一溶液；

步骤(2)：将所述菠萝蛋白酶和所述BSA加入到所述第一溶液中，得到第二溶液；

步骤(3)：将所述乙醇加入到第二溶液中，得到第三溶液；

步骤(4)：将所述冰醋酸加入到所述第三溶液中，得到所述细胞保存液。

按照此制备方法制备的细胞保存液能够保持各成分的结构和活性，充分发挥各成分的作用。

另一方面，本发明提供一种细胞的保存方法，其包括：将待保存细胞样本与如上任一项所述的细胞保存液混合。

在可选的实施方式中，所述待保存细胞样本为宫颈脱落细胞、痰液脱落细胞或针吸细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例及对比例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图2为实施例1提供的细胞保存液保存处理痰标本的镜检细胞液基图片。

图3为实施例1提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈血性标本的镜检细胞液基图片。

图4为实施例1提供的细胞保存液保存处理针吸细胞标本的镜检细胞液基图片。

图5为实施例2提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图6为实施例2提供的细胞保存液保存处理痰标本的镜检细胞液基图片。

图7为实施例2提供的细胞保存液保存处理血性标本的镜检细胞液基图片。

图8为实施例2提供的细胞保存液保存处理针吸细胞标本的镜检细胞液基图片。

图9为实施例3提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图10为实施例3提供的细胞保存液保存处理痰标本的镜检细胞液基图片。

图11为实施例3提供的细胞保存液保存处理宫颈血性标本的镜检细胞液基图片。

图12为实施例3提供的细胞保存液保存处理针吸细胞标本的镜检细胞液基图片。

图13为对比例1提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图14为对比例2提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图15为对比例3提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图16为对比例4提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图17为对比例5提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图18为对比例6提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

图19为对比例7提供的细胞保存液保存处理阴道宫颈脱落细胞标本的镜检细胞液基图片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1-3

实施例1-3提供的细胞保存液的配方如下表1所示：

表1

	实施例1	实施例2	实施例3
				乙醇(纯度为95％)	40％(v/v)	45％(v/v)	50％(v/v)
Tris	0.1％(w/v)	0.3％(w/v)	0.5％(w/v)
				EDTA·2Na	0.01％(w/v)	0.02％(w/v)	0.03％(w/v)
菠萝蛋白酶	0.01％(w/v)	0.05％(w/v)	0.04％(w/v)
				三(2-羧乙基)膦盐酸盐	0.01％(w/v)	0.03％(w/v)	0.05％(w/v)
二异丁基萘磺酸	0.10％(w/v)	0.07％(w/v)	0.08％(w/v)
				BSA	0.08％(w/v)	0.07％(w/v)	0.06％(w/v)
海藻糖	0.04％(w/v)	0.03％(w/v)	0.03％(w/v)
				proclin300	0.01％(w/v)	0.02％(w/v)	0.03％(w/v)
去离子水	59％(v/v)	53.5％(v/v)	58％(v/v)
				冰醋酸	1.0％(v/v)	1.5％(v/v)	2.0％(v/v)
pH(25℃)	6.9	7.0	7.2

实施例1的细胞保存液制备方法如下(配制量：1L)：

1.依次向590mL去离子水中添加10g Tris、1g EDTA·2Na、1g三(2-羧乙基)膦盐酸盐、1g二异丁基萘磺酸、4g海藻糖、1g proclin300，搅拌均匀至溶解，得到溶液a。

2.将4g菠萝蛋白酶、8g BSA加入到溶液a中，搅拌均匀，得到溶液b。

3.将400mL无水乙醇缓慢加入到溶液b中，搅拌均匀，得到溶液c。

4.将10ml冰乙酸加入到溶液c中，搅拌均匀，得到实施例的细胞保存液。

实施例2-3的细胞保存液参考上述方法制备即可。

实施例4

本实施例提供上述实施例1-3提供的细胞保存液的使用方法，如下：

1.按照标准采样流程采样后，将样本(例如阴道宫颈脱落细胞标本、痰标本、阴道宫颈血性标本和针吸细胞标本等)置于用盛有细胞保存液的样本瓶中，旋紧保存管盖送检；

2.振荡5-10min，吸取细胞悬液2-3ml至制片仓，自然沉降10min；

3.取出玻片进行巴氏染色流程，然后封片镜下检测判读细胞形态。

实验例1

使用实施例1提供的细胞保存液，采用实施例4的方法分别对阴道宫颈脱落细胞标本、痰标本、阴道宫颈血性标本以及针吸细胞标本进行保存处理，然后制片镜检，观察细胞形态，结果见图1-图4。

实验例2

使用实施例2提供的细胞保存液，采用实施例4的方法分别对阴道宫颈脱落细胞标本、痰标本、阴道宫颈血性标本以及针吸细胞标本进行保存处理，然后制片镜检，观察细胞形态，结果见图5-图8。

实验例3

使用实施例3提供的细胞保存液，采用实施例4的方法分别对阴道宫颈脱落细胞标本、痰标本、阴道宫颈血性标本以及针吸细胞标本进行保存处理，然后制片镜检，观察细胞形态，结果见图9-图12。

从图1-图12可以看出，本发明实施例提供的细胞保存液保存的细胞制片背景干净，细胞均匀排列，诊断细胞集中，细胞形态结构完整，无细胞固缩、溶解和膨胀现象。对宫颈细胞标本、血性标本、痰标本、针吸细胞标本都具有较优的保存效果，制片效果好，制片后几乎观察不到粘液和血细胞碎片，所有细胞清晰的展现在显微镜下，诊断效率高。

对比例1

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，不含Tris、EDTA·2Na和冰醋酸，乙醇含量为60％，去离子水含量为39％，海藻糖含量为0.08％。

对比例2

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，不含海藻糖和BSA。

对比例3

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，不含菠萝蛋白酶和三(2-羧乙基)膦盐酸盐，EDTA·2Na含量为0.05％，二异丁基萘磺酸含量为0.1％。

对比例4

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，菠萝蛋白酶更换为胰蛋白酶。

对比例5

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，三(2-羧乙基)膦盐酸盐更换为二硫苏糖醇。

对比例6

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，不含EDTA·2Na和二异丁基萘磺酸。

对比例7

本对比例提供的细胞保存液与实施例1基本相同，不同之处在于，冰醋酸更换为盐酸。

实验例4

使用对比例1-7提供的细胞保存液对阴道宫颈脱落细胞标本进行保存处理；再制片镜检，观察细胞形态，结果见图13-19。

从图13和14可以看出，对比例1和2提供的细胞保存液保存的细胞制片背景干净，但是细胞形态结构不完整，出现细胞溶解和膨胀现象。

从图15可以看出，对比例3提供的细胞保存液保存的细胞制片背景不干净，有大团的粘液，影响诊断。

从图16可以看出，对比例4提供的细胞保存液保存的细胞制片背景干净，但是出现染色不良，细胞核和细胞质颜色对比不明显，同时存在细胞溶解和膨胀现象。

从图17可以看出，对比例5提供的细胞保存液保存的细胞制片背景不干净，有大团的粘液，影响诊断。

从图18可以看出，对比例6提供的细胞保存液保存的细胞制片背景不干净，有大团的粘液，细胞成团较多，影响诊断。

从图19可以看出，对比例7提供的细胞保存液保存的细胞制片背景不干净，有较多的红细胞碎片，影响诊断。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种细胞保存液，其特征在于，其组成为：乙醇40~50%v/v、Tris 0.1~0.5%w/v、EDTA·2Na 0.01~0.03%w/v、菠萝蛋白酶0.01~0.05%w/v、三（2-羧乙基）膦盐酸盐0.01~0.05%w/v、二异丁基萘磺酸0.01~0.1%w/v、BSA 0.06~0.08%w/v、海藻糖0.03~0.04%w/v、proclin300 0.01~0.03%w/v以及冰醋酸1~2%v/v，余量为去离子水；

所述细胞保存液的pH为6.8-7.2；

所述细胞保存液保存的细胞样本为宫颈脱落细胞、痰液脱落细胞或针吸细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，其含有如下组分：乙醇40%v/v、Tris0.1%w/v、EDTA·2Na 0.01%w/v、菠萝蛋白酶0.01%w/v、三（2-羧乙基）膦盐酸盐0.01%w/v、二异丁基萘磺酸0.1%w/v、BSA 0.08%w/v、海藻糖0.04%w/v、proclin300 0.01%w/v以及冰醋酸1%v/v。

3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，其含有如下组分：乙醇45%v/v、Tris0.3%w/v、EDTA·2Na 0.02%w/v、菠萝蛋白酶0.05%w/v、三（2-羧乙基）膦盐酸盐0.03%w/v、二异丁基萘磺酸0.07%w/v、BSA 0.07%w/v、海藻糖0.03%w/v、proclin300 0.02%w/v以及冰醋酸1.5%v/v。

4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，其含有如下组分：乙醇50%v/v、Tris0.5%w/v、EDTA·2Na 0.03%w/v、菠萝蛋白酶0.04%w/v、三（2-羧乙基）膦盐酸盐0.05%w/v、二异丁基萘磺酸0.08%w/v、BSA 0.06%w/v、海藻糖0.03%w/v、proclin300 0.03%w/v以及冰醋酸2.0%v/v。

5.根据权利要求1-4任一项所述的细胞保存液，其特征在于，所述乙醇的纯度为94%-96%，或者所述乙醇为无水乙醇。

6.制备如权利要求5所述的细胞保存液的方法，其特征在于，其包括：将所述乙醇、所述Tris 、所述EDTA·2Na、所述菠萝蛋白酶、所述三（2-羧乙基）膦盐酸盐、所述二异丁基萘磺酸、所述BSA、所述海藻糖、所述proclin300以及所述冰醋酸溶于水中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

将所述Tris、所述EDTA·2Na、所述三（2-羧乙基）膦盐酸盐、所述二异丁基萘磺酸、所述海藻糖以及所述proclin300溶解于水中，得到第一溶液；

将所述菠萝蛋白酶和所述BSA加入到所述第一溶液中，得到第二溶液；

将所述乙醇加入到第二溶液中，得到第三溶液；

将所述冰醋酸加入到所述第三溶液中，得到所述细胞保存液。

8.一种细胞的保存方法，其特征在于，其包括：将待保存的细胞样本与权利要求1-5任一项所述的细胞保存液混合；

所述待保存的细胞样本为宫颈脱落细胞、痰液脱落细胞或针吸细胞。