CN113383769B - 一种细胞保存液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种细胞保存液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种细胞保存液及其制备方法与应用。所述细胞保存液包括醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂和蛋白水解酶；所述细胞保存液通过添加蛋白水解酶，可以较好地处理多粘液和血细胞的样本，提高薄层液基细胞学检测的染色效果；但是蛋白水解酶会影响还原兰组织细胞染色效果，通过添加抗氧化剂，降低了蛋白水解酶对还原兰组织细胞染色的影响，同时，提高了免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色的准确性和稳定性，并且，所述细胞保存液保存细胞样本后对HPV检测的准确性和稳定性无影响。即所述细胞保存液能同时满足薄层液基细胞学检测、HPV检测、免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色四种筛查方法。

Description

一种细胞保存液及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞保存液及其制备方法与应用。
背景技术
目前，宫颈癌是女性癌症中最常见的恶性肿瘤之一。早期诊断宫颈癌及癌前病变是提高宫颈癌治愈率及患者生存率的关键，薄层液基细胞学检测(Thin-Cytologic Test，TCT)是目前临床应用最广泛的筛查子宫颈癌的方法。薄层液基细胞学检测是以观察细胞形态结构变化来诊断临床病症的一门学科。几十年来，薄层液基细胞学检测已成为宫颈癌的大规模普查和高危人群随访观察的主要方法，使中晚期宫颈癌的发生率大幅度下降。传统的细胞学检查方法巴氏涂片法(即宫颈刮片)制成的涂片，细胞大量重叠，并且涂片存在着大量的红细胞、白细胞、粘液及脱落坏死组织等，病理医生在判读时非常困难，会出现15％～40％的假阴性率。薄层液基细胞学检测是上世纪90年代末发明的一项细胞学新技术，对宫颈癌及癌前病变诊断准确性较高，被认为是宫颈癌早期诊断、早期预防的最佳方法。随着薄层液基细胞学检测的运用日益增多，过多于依赖病理医生主观判断，使其检出率低的缺点也逐渐显现出来。所以，近几年开始衍生出新的宫颈癌筛查方法，例如：HPV检测、免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色(醋酸白染色)等，能很好的弥补薄层液基细胞学检测检出率低的缺点。
用于薄层液基细胞学检测的细胞保存液普遍包含甲醛。当细胞被甲醛浸润后，细胞内主要的肽段和基本结构都会保存下来。除此之外，一些核苷酸也可能会与甲醛发生反应，而碳水化合物则不会有类似现象。甲醛可以特定地结合到某些氨基酸残基上，比如赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，甚至还可能会对细胞核酸物质产生影响，从而影响HPV检测。
目前市面上也有无甲醛的保存液，但是尚无一种能同时满足薄层液基细胞学检测、HPV检测、免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色四种筛查方法的保存液。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种细胞保存液。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的细胞保存液的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的细胞保存液在收集和/或保存脱落细胞中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供第一方面的细胞保存液在制备试剂盒中的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括：醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂和蛋白水解酶。
优选地，所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种；进一步为乙醇。
优选地，所述醇的含量按体积百分比计为5％～30％；进一步为15％～20％；更进一步为15％。
优选地，所述酸为有机酸；进一步为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸中的至少一种；更进一步为乙酸。
优选地，所述酸的含量按体积百分比计为5％～30％；进一步为15％～20％；更进一步为20％。
优选地，所述缓冲盐为磷酸缓冲盐、醋酸缓冲盐和柠檬酸缓冲盐中的至少一种。
优选地，所述磷酸缓冲盐为磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种；进一步为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。
优选地，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物中磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的质量比为1：(1～3)。
优选地，所述醋酸缓冲盐为醋酸和醋酸钠的混合物。
优选地，所述柠檬酸缓冲盐为柠檬酸和柠檬酸钠的混合物。
优选地，所述缓冲盐的含量按质量体积比(g/mL)计为0.099％～3.0％；进一步为1.2％～1.5％；更进一步为1.5％。
优选地，所述离子强度维持剂为氯化盐；进一步为氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的至少一种；更进一步为氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的至少一种；再进一步为氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁的混合物。
优选地，所述氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁的混合物中氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁的质量比为(3～5)：(3～5)：(1～3)：1。
优选地，所述离子强度维持剂的含量按质量体积比(g/mL)计为0.055％～2.2％；进一步为1.375％～1.65％；更进一步为1.65％。
优选地，所述抗氧化剂为葡萄糖、果糖、抗坏血酸、谷胱甘肽、硫辛酸、尿酸、胡萝卜素、α-生育酚和泛醌中的至少一种；进一步为葡萄糖、果糖和抗坏血酸中的至少一种；更进一步为葡萄糖、果糖和抗坏血酸的混合物。
优选地，所述葡萄糖、果糖和抗坏血酸的混合物中葡萄糖、果糖和抗坏血酸的质量比为(1～3)：(1～3)：1；进一步为2：2：1。
优选地，所述抗氧化剂的含量按质量体积比(g/mL)计为0.1％～2.0％；进一步为0.8％～1.0％；更进一步为1.0％。
优选地，所述蛋白水解酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、尿激酶、链激酶、激肽释放酶、弹性蛋白酶、细菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种。
优选地，所述蛋白水解酶的含量按质量体积比(g/mL)计为0.1％～2.0％；进一步为1％～1.2％；更进一步为1.2％。
优选地，所述细胞保存液还包含水，所述水的含量为余量。
优选地，所述细胞保存液的pH为6.0～7.4；进一步6.5～7.4；更进一步为6.5。
本发明的第二方面，提供第一方面的细胞保存液的制备方法，将醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂、蛋白水解酶与水混合，得到。
优选地，所述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将磷酸盐与部分水混合，得到溶液a；
(2)将溶液a与离子强度维持剂混合，得到溶液b；
(3)将溶液b与蛋白水解酶混合，得到溶液c；
(4)将溶液c与醇、酸混合，调节pH至6.0～7.4，加入剩余水定容。
优选地，所述pH值为6.5～7.4；进一步为6.5。
本发明的第三方面，提供第一方面的细胞保存液在收集和/或保存脱落细胞中的应用。
优选地，所述脱落细胞为宫颈脱落细胞。
本发明的第四方面，提供第一方面的细胞保存液在制备试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒为用于(1)～(4)中任一种试剂盒或用于(1)～(4)中两种以上(含两种)的联合检测试剂盒：
(1)薄层液基细胞学检测；
(2)HPV检测；
(3)免疫细胞化学染色；
(4)还原兰组织细胞染色。
本发明的第五方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一方面的细胞保存液。
优选地，所述试剂盒为用于(1)～(4)中任一种试剂盒或用于(1)～(4)中两种以上(含两种)的联合检测试剂盒：
(1)薄层液基细胞学检测；
(2)HPV检测；
(3)免疫细胞化学染色；
(4)还原兰组织细胞染色。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种细胞保存液，包括：醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂和蛋白水解酶；与现有技术相比，本发明提供的细胞保存液无甲醛，固定成分使用性能温和的醇类维持细胞形态，保证薄层液基细胞学检测的细胞形态完整性，起到保护和保存作用；同时，通过添加蛋白水解酶，可以较好地处理多粘液和血细胞的样本，提高薄层液基细胞学检测的染色效果；但是蛋白水解酶会影响FRD还原兰组织细胞染色效果(可能的原因是FRD还原兰组织细胞染色是检测细胞表面的叶酸受体的表达，蛋白水解酶可能在消化粘液和血细胞的同时也消化了细胞表面的叶酸受体，从而使FRD还原兰组织细胞染色效果变差甚至无法染色)，通过添加抗氧化剂，降低了蛋白水解酶对FRD还原兰组织细胞染色的影响，同时，提高了免疫细胞化学染色和FRD还原兰组织细胞染色的准确性和稳定性，并且，本发明提供的细胞保存液保存细胞样本后对HPV检测的准确性和稳定性无影响。即本发明提供的细胞保存液能同时满足薄层液基细胞学检测、HPV检测、免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色四种筛查方法，拓宽了细胞保存液的应用范围；可实现一个样本的多种筛查方法联用，有利于整体提高宫颈癌筛查的准确性。
附图说明
图1是不同细胞保存液保存的细胞样本进行HPV检测的结果图。
图2是不同细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测的结果图：A是实施例1的细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测的结果图；B是实施例2的细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测的结果图；C是对比例1的细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测的结果图；D是对比例2的细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测的结果图。
图3是不同细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色的结果图：A是实施例1的细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色的结果图；B是实施例2的细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色的结果图；C是对比例1的细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色的结果图；D是对比例2的细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色的结果图。
图4是不同细胞保存液保存的细胞样本进行还原兰组织细胞染色的结果图：A是实施例1的细胞保存液保存的细胞样本进行还原兰组织细胞染色的结果图；B是实施例2的细胞保存液保存的细胞样本进行还原兰组织细胞染色的结果图；C是对比例1的细胞保存液保存的细胞样本进行还原兰组织细胞染色的结果图；D是对比例2的细胞保存液保存的细胞样本进行还原兰组织细胞染色的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
实施例1一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表1所示。
表1实施例1中细胞保存液的组分及含量
组分 含量
磷酸氢二钠 4g
磷酸二氢钠 8g
氯化钾 5g
氯化钠 5g
氯化钙 2.5g
氯化镁 1.25g
乙醇 200mL
乙酸 150mL
胰蛋白酶 10g
葡萄糖 8g
双蒸水 定量补足1000mL
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入600mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入胰蛋白酶，搅拌溶解，得到溶液c；
(4)向溶液c中加入葡萄糖，搅拌溶解，得到溶液d；
(5)向溶液d中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
实施例2一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表2所示。
表2实施例2中细胞保存液的组分及含量
组分 含量
磷酸氢二钠 5g
磷酸二氢钠 10g
氯化钾 6g
氯化钠 6g
氯化钙 3g
氯化镁 1.5g
乙醇 150mL
乙酸 200mL
胰蛋白酶 12g
葡萄糖 4g
果糖 4g
抗坏血酸 2g
双蒸水 定量补足1000mL
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入600mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入胰蛋白酶，搅拌溶解，得到溶液c；
(4)向溶液c中加入葡萄糖、果糖和抗坏血酸，搅拌溶解，得到溶液d；
(5)向溶液d中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
实施例3一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表3所示。
表3实施例3中细胞保存液的组分及含量
Figure BDA0003138213330000061
Figure BDA0003138213330000071
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入800mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入胰蛋白酶，搅拌溶解，得到溶液c；
(4)向溶液c中加入葡萄糖、果糖和抗坏血酸，搅拌溶解，得到溶液d；
(5)向溶液d中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
实施例4一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表4所示。
表4实施例4中细胞保存液的组分及含量
Figure BDA0003138213330000072
Figure BDA0003138213330000081
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入250mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入胰蛋白酶，搅拌溶解，得到溶液c；
(4)向溶液c中加入葡萄糖、果糖和抗坏血酸，搅拌溶解，得到溶液d；
(5)向溶液d中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
对比例1一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表5所示。
表5对比例1中细胞保存液的组分及含量
组分 含量
磷酸氢二钠 3.5g
磷酸二氢钠 7g
氯化钾 4g
氯化钠 4g
氯化钙 2g
氯化镁 1g
乙醇 100mL
乙酸 80mL
双蒸水 定量补足1000mL
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入750mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
对比例2一种细胞保存液
一种细胞保存液，其组分及含量如表6所示。
表6对比例2中细胞保存液的组分及含量
组分 含量
磷酸氢二钠 5g
磷酸二氢钠 10g
氯化钾 5g
氯化钠 5g
氯化钙 2.5g
氯化镁 1.25g
乙醇 200mL
乙酸 120mL
胰蛋白酶 5g
双蒸水 定量补足1000mL
上述细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，加入600mL双蒸水，搅拌溶解，得到溶液a；
(2)向溶液a中加入氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁，搅拌溶解，得到溶液b；
(3)向溶液b中加入胰蛋白酶，搅拌溶解，得到溶液c；
(4)向溶液c中加入乙醇、乙酸，搅拌混匀，用NaOH调节pH至6.5，用双蒸水定容至1000mL，得到细胞保存液。
效果实施例
1.实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液保存的细胞样本进行HPV检测
按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈，获得细胞样本(包含血液样本和粘液较多样本)，分别将取样刷放入实施例1、2及对比例1、2的细胞保存液中，在室温下保存7天。使用细胞提取DNA试剂盒提取细胞样本的全基因组DNA，然后进行QPCR检测，反应体系如下：DNA模板(50ng)2uL，Forwardprimer(10uM)1uL，Reverseprimer(10uM)1uL，2XSYBR GreenqPCR Mix10uL，ddH2O16uL。反应程序如下：94℃，3min。94℃，15sec；55℃，15sec；72℃，20sec；40个循环。引物序列为：HPV GP5+/6+F：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC(SEQID NO:1)，HPV GP5+/6+R：GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC(SEQ ID NO:2)；结果如图1所示：HPV GP5+/6+检测实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液保存样品DNA的Ct值为19.72、18.52、18.94和19.86，表明实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液可以很好地保存样品中DNA。
2.实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液保存的细胞样本进行薄层液基细胞学检测(TCT)
按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈，获得细胞样本(包含血液样本和粘液较多样本)，分别将取样刷放入实施例1、2及对比例1、2的细胞保存液中，在室温下保存7天。采用全自动制片机进行自动制片和巴氏染色，然后显微镜下拍照，结果如图2所示：从图2中A、B可知，实施例1、2的细胞保存液保存包含血液和粘液较多的细胞样本时，细胞样本中的粘液被打散，血红细胞被裂解，制片、染色后观察不会出现遮挡上皮细胞的现象及干扰镜下观察现象；从图2中D可知，对比例2的细胞保存液保存包含血液和粘液较多的细胞样本时，染色效果与实施例1、2的细胞保存液一致，；从图2中C可知，对比例1的细胞保存液保存包含血液和粘液较多的细胞样本时，细胞样品中的粘液和血红细胞未被裂解，制片、染色后观察出现粘液和血红细胞遮挡上皮细胞的现象及干扰镜下观察现象。由此可见，实施例1、2，对比例2的细胞保存液不仅能够较好地保存细胞的形态，而且对细胞样品中粘液和血液也有较好地处理效果。
3.实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液保存的细胞样本进行免疫细胞化学染色
按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈，获得细胞样本(包含血液样本和粘液较多样本)，分别将取样刷放入实施例1、2及对比例1、2的细胞保存液中，在室温下保存7天。采用全自动制片机进行自动制片，然后使用P16抗体检测试剂盒进行染色，最后显微镜下拍照。结果如图3所示：从图3中A可知，实施例1的细胞保存液保存细胞样本后，制片、染色后显微镜观察可见少量染色，从图3中B可知，实施例2的细胞保存液保存细胞样本后，制片、染色后显微镜观察可见明显染色；从图3中C、D可知，对比例1、2的细胞保存液保存细胞样本后，制片、染色后未见染色。由此可见，仅实施例1、2的细胞保存液保存细胞样本后，进行免疫细胞化学染色，可见染色，不会出现假阴性现象。
4.实施例1、2，对比例1、2的细胞保存液保存的细胞样本进行FRD还原兰组织细胞染色
按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈，获得细胞样本(包含血液样本和粘液较多样本)，分别将取样刷放入实施例1、2及对比例1、2的细胞保存液中，在室温下保存7天。取细胞样本震荡离心浓缩脱落细胞，分别滴加细胞悬液(细胞数量相等)至塑料管的FRD染色液中，颠倒摇晃塑料管静置反应显色，观察塑料管壁判断结果。结果如图4所示：从图4中D可知，对比例2细胞保存液保存细胞样本后，进行FRD还原兰组织细胞染色，塑料管壁蓝色显色不明显；从图4中A可知，实施例1的细胞保存液保存细胞样本后，进行FRD还原兰组织细胞染色，塑料管壁蓝色显色有所改善；从图4中B、C可知，实施例2及对比例1的细胞保存液保存细胞样本后，进行FRD还原兰组织细胞染色，塑料管壁蓝色显色明显。实施例1、2及对比例1的细胞保存液保存细胞样本后，进行还原兰组织细胞染色具有较佳效果。
5.实施例3、4的细胞保存液保存的细胞样本进行HPV检测、薄层液基细胞学检测(TCT)、免疫细胞化学染色和FRD还原兰组织细胞染色，实验结果几乎接近于实施例2的图1、图2中B、图3中B和图4中B的结果。
综上所述，实施例1、2、3、4的细胞保存液同时满足薄层液基细胞学检测、HPV检测、免疫细胞化学染色和还原兰组织细胞染色四种筛查方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州朗坤生物科技有限公司
<120> 一种细胞保存液及其制备方法与应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttgttactg tggtagatac tac 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25

Claims (5)

1.一种细胞保存液，包括：醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂和蛋白水解酶；
所述醇为乙醇；
所述醇的含量按体积百分比计为5%～30%；
所述酸为乙酸；
所述酸的含量按体积百分比计为5%～30%；
所述缓冲盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物；
所述缓冲盐的含量按质量体积比计为0.099 % ～3.0%；
所述离子强度维持剂为氯化钾、氯化钠、氯化钙和氯化镁的混合物；
所述离子强度维持剂的含量按质量体积比计为0.055%～2.2%；
所述抗氧化剂为葡萄糖、果糖和抗坏血酸的混合物；
所述抗氧化剂的含量按质量体积比计为0.1 %～2.0%；
所述蛋白水解酶为胰蛋白酶；
所述蛋白水解酶的含量按质量体积比计为0.1%～2.0%。
2.权利要求1所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于：
将醇、酸、缓冲盐、离子强度维持剂、抗氧化剂、蛋白水解酶与水混合，得到。
3.权利要求1所述的细胞保存液在（I）～（II）中任一项中的应用；
（I）收集和/或保存脱落细胞；
（II）制备试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述试剂盒为用于（1）～（4）中任一种的试剂盒或用于（1）～（4）中两种以上的联合检测试剂盒：
（1）薄层液基细胞学检测；
（2）HPV检测；
（3）免疫细胞化学染色；
（4）还原兰组织细胞染色。
5.一种试剂盒，包含：权利要求1所述的细胞保存液。
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