CN117230155A - 一种十二指肠液样本的保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种十二指肠液样本的保存液及其制备方法，属于十二指肠液样本的保存技术领域，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂25～30份、a‑球蛋白40～45份、乙醇10～15份、氯化钠5～10份、葡萄糖20～25份、甘油10～15份、枸橼酸‑枸橼酸钠缓冲溶液35～40份、余量为水，所述十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。该种十二指肠液样本的保存液能够提高十二指肠液样本的保存质量，能够检测十二指肠液样本中的细胞和蛋白和、核酸标志物。
Description
技术领域
本发明涉及十二指肠液样本的保存技术领域，具体涉及一种十二指肠液样本的保存液及其制备方法。
背景技术
十二指肠液是由胰腺外分泌液、胆汁、十二指肠分泌液以及胃液部分组成。由于十二指肠引流液是指在无菌操作下通过连续引流取得的，上述各部分之间很难避免相互掺杂，故实际上十二指肠引流液都包含上述各部分。十二指肠液的收集时应在空腹状态下进行，从而尽可能地减少胃液及食物的干扰。其中，胰腺外分泌液是无色透明碱性液体，正常人每天分泌量在1000～1500毫升左右，所以从量的角度上看是十二指肠液的主要成分。胰液内主要的酶组分为四种：淀粉分解酶、蛋白分解酶、脂肪分解酶及核酸分解酶，其中蛋白分解酶主要包括胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶原及前弹力蛋白酶。其中90％以上是胰酶或胰酶原，其他为少量血浆蛋白。胰液中的蛋白分解酶分为内切酶与外切酶。内切酶有胰蛋白酶和糜蛋白酶A、B，其作用于蛋白质结构内部的肽链，使其降解为较小分子的多肽。外切酶包括羧肽酶A、B和亮氨酸肽酶，其作用于经过胰蛋白酶分解后形成的多肽末端处的肽链，最后蛋白质被消化成氨基酸、二肽和三肽。而糜蛋白酶原是胰腺分泌的无活性的糜蛋白酶原，在胰蛋白酶的作用下，转化为有活性的糜蛋白酶，可分解蛋白质为腙和胨，若与胰蛋白酶同时作用于蛋白质时，则可水解蛋白质为小分子的多肽和氨基酸，因此它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，因而胰蛋白酶是胰液中最重要的酶。胰蛋白酶原进入肠道后被十二指肠粘膜分泌的肠激酶活化，形成具有生物活性的胰蛋白酶，胰蛋白酶可自行活化胰蛋白酶原且可以活化糜蛋白酶原及其他蛋白分解酶。胆汁正常人每天分泌量在500毫升左右，不含有消化酶，其主要成分为胆汁酸、磷脂、胆固醇、蛋白、氨基酸、胆色素等。小肠液是由十二指肠腺和小肠腺分泌弱碱性液体，正常人每天分泌量在1000毫升左右，其酶种类较多，但活力较胰酶弱。主要作用是为中和胃酸，保护十二指肠粘膜免遭胃酸侵蚀。
十二指肠液中所含的蛋白质等各种生物分子容易被分解。因此，在将十二指肠液作为生物试样，对该生物试样中的蛋白质标志物进行定量检测时，担心该生物试样中的蛋白质标志物受到蛋白酶影响而不能准确地进行测定。因此，将十二指肠液试样中的蛋白质标志物稳定地保存至供于检查为止这一点很重要。为了降低从十二指肠液中胰腺外分泌液中各种分解酶的活性，传统方法是将提取的十二指肠液在冷却状态下保存，通过去除酶活性的温度来抑制活性；然而，该方法需要将提取的十二指肠液始终保持在低温的环境，存在操作繁琐和耗能的问题。另外，根据蛋白质的种类，即使在低温下也有分解进行的情况，因此单纯的低温保存，对于抑制十二指肠液的各种分解酶的活性是不充分的。此外，虽然可以通过向十二指肠液中加入蛋白酶抑制剂，抑制酶的活性，但是胰液中含有多种酶，特别是蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶、代谢蛋白酶、羧肽酶等，如果添加一种或几种抑制剂，就会完全抑制所有酶的活性也是非常困难的。而且，很多抑制剂都需要在低温下保存，成本也很高，因此存在不能适用于常规检查的问题。
另外，呈弱碱性(ph8.5左右)的胰液被排出到十二指肠，与胃酸混合后变成中性。因此，pH值达到pH7～7.5的核酸酶随着被排出到十二指肠，预计其活性将进一步增强。为此，特别是在将胰液中的核酸作为解析对象进行诊断等的情况下，如何抑制胰液中包含的核酸酶变得重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种十二指肠液样本的保存液，能够提高十二指肠液样本的保存质量，能够检测十二指肠液样本中的蛋白质标志物和核酸标志物。
本发明的目的之二在于提供一种十二指肠液样本的保存液的制备方法，该制备方法步骤简单，能够工业生产十二指肠液样本的保存液。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种十二指肠液样本的保存液，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂25～30份、α-球蛋白40～45份、乙醇10～15份、氯化钠5～10份、葡萄糖20～25份、甘油10～15份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液35～40份、余量为水，所述十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
进一步地，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、余量为水，所述十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
进一步地，所述胆汁酸螯合剂为考来烯胺、胆汁酸螯合剂中的一种或两种。
进一步地，还包括二异丙基氟碳酸25～30份。
进一步地，还包括硫酸锌5～10份。
进一步地，还包括碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液5～20份、所述十二指肠液样本的保存液的pH为9～10。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种十二指肠液样本的保存液的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取配方量的胆汁酸螯合剂、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、甘油、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往所述水中先加入胆汁酸螯合剂、乙醇、甘油，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在所述混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得所述的一种十二指肠液样本的保存液。
进一步地，在所述S3后，用所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调节pH至9.0～10，加入水定容至预定体积，制得pH为9～10的十二指肠液样本的保存液。
进一步地，所述S2中，还包括往所述水中加入配方量的二异丙基氟碳酸、硫酸锌。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的一种十二指肠液样本的保存液，胆汁酸螯合剂能够螯合肠激酶，形成不溶性复合物，从而抑制肠肽酶激活胰蛋白酶原的速度；α-球蛋白作为胰蛋白酶的抑制剂，能够抑制胰蛋白酶的活性；甘油能够保持十二指肠液样本中细菌，能够诊断十二指肠有无感染；乙醇、氯化钠能够保持十二指肠液样本中红细胞、白细胞、十二指肠上皮细胞的的形态，细胞检测时能够提高十二指肠炎诊断的准确性，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液配置成pH为7.0～7.6，在该范围内能够最适合细胞保存。
(2)本发明提供的一种十二指肠液样本的保存液，胆汁酸螯合剂能够螯合肠激酶，形成不溶性复合物，从而抑制肠肽酶激活胰蛋白酶原的速度；α-球蛋白作为胰蛋白酶的抑制剂，能够抑制胰蛋白酶的活性；需要对十二指肠液样本中的蛋白质标志物和核酸标志物进行检测时，用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调节十二指肠液样本的pH至9.0～10，能够使十二指肠液样本的各种酶失活，包括胰蛋白酶，抑制样本的各种酶的活性，使得十二指肠液样本中的蛋白质标志物和核酸标志物不受到蛋白酶影响而能准确地进行测定，提高对疾病的诊断结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是实施例1～7和对比例1～3中保存的十二指肠液样品中荧光量的测定结果图。
具体实施方式
下面，结合具体实施例，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、甘油、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入胆汁酸螯合剂、乙醇、甘油，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
实施例2
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂28份、α-球蛋白40份、乙醇12份、氯化钠5份、葡萄糖20份、甘油15份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液35份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、甘油、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入胆汁酸螯合剂、乙醇、甘油，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
胆汁酸螯合剂28份、α-球蛋白40份、乙醇12份、氯化钠5份、葡萄糖20份、甘油15份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液35份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6
实施例3
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺30份、α-球蛋白42份、乙醇15份、氯化钠8份、葡萄糖25份、甘油13份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液40份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、甘油、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入胆汁酸螯合剂、乙醇、甘油，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
实施例4
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠10份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、二异丙基氟碳酸25份、硫酸锌5份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌、甘油、二异丙基氟碳酸、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入考来烯胺、乙醇、甘油、二异丙基氟碳酸，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌，搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
实施例5
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠10份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、二异丙基氟碳酸30份、硫酸锌10份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌、甘油、二异丙基氟碳酸、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入考来烯胺、乙醇、甘油、二异丙基氟碳酸，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌，搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
实施例6
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠10份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、二异丙基氟碳酸28份、硫酸锌8份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、称取配方量的考来烯胺、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌、甘油、二异丙基氟碳酸、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往水中先加入考来烯胺、乙醇、甘油、二异丙基氟碳酸，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖、硫酸锌，搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得的一种十二指肠液样本的保存液。
实施例7
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液5～20份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为9～10。
本实施例提供的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法包括以下步骤：
S1、将实施例1制备的十二指肠液样本的保存液用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调节pH至9.0～10，加入水定容至预定体积，制得pH为9～10的十二指肠液样本的保存液。
对比例1
与实施例1不相同得是本对比例1提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：a-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
对比例1提供的一种十二指肠液样本的保存液按照实施例1的制备方法制备即可。
对比例2
与实施例1不相同得是本对比例2提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：考来烯胺25份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
对比例2提供的一种十二指肠液样本的保存液按照实施例1的制备方法制备即可。
对比例3
与实施例8不相同得是本对比例1提供的一种十二指肠液样本的保存液按照重量份计，包括以下按照重量份计的组分：乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液5～20份、余量为水，十二指肠液样本的保存液的pH为9～10。
对比例1提供的一种十二指肠液样本的保存液按照实施例1的制备方法制备即可。
实验例
蛋白酶活性实验
收集从7人身上采集的十二指肠液样本混合在一起，分为10等分，分别标记为样本1～10，测试使用实施例1～7和对比例1～3提供的一种十二指肠液样本的保存液分别保存样本1～10的保存效果，以胰蛋白酶活性为检测指标。使用EnzCheck蛋白酶检测试剂盒(MolecularProbes公司生产)进行进行测试，具体操作是在制备的样本1～10中分别添加该试剂盒所附的具有荧光标记的酪蛋白，在37℃下进行孵化，2小时后，在激发光谱Ex/发射光谱Em＝485/535nm的荧光波长下测量荧光量。由于荧光量表示分解酪蛋白的量，所以将荧光量估计为胰蛋白酶活性的值。实施例1～7和对比例1～3中十二指肠液样品中荧光量的测量结果如图1所示，由图1可知，相对于对比例1～2，实施例1～8保存的十二指肠液样品中测量的荧光强度显著大于对比例1～2保存的十二指肠液样品，说明因为胆汁酸螯合剂能够螯合肠激酶，形成不溶性复合物，从而抑制肠肽酶激活胰蛋白酶原的速度；α-球蛋白作为胰蛋白酶的抑制剂，能够抑制胰蛋白酶的活性，所以保存的十二指肠液样品中胰蛋白酶的活性得到抑制；但是相对于对比例3，实施例1～7保存的十二指肠液样品中测量的荧光强度低于对比例3，说明因为用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调节十二指肠液样本的pH至9.0～10，能够使保存的十二指肠液样品中胰蛋白酶的活性失活，因而对比例3保存的十二指肠液样品中测量的荧光强度和实施例1相当。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂25～30份、α-球蛋白40～45份、乙醇10～15份、氯化钠5～10份、葡萄糖20～25份、甘油10～15份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液35～40份、余量为水，所述十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
2.如权利要求1所述的一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，包括以下按照重量份计的组分：胆汁酸螯合剂25份、α-球蛋白45份、乙醇10份、氯化钠8份、葡萄糖23份、甘油12份、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液38份、余量为水，所述十二指肠液样本的保存液的pH为7.0～7.6。
3.如权利要求1所述的一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，所述胆汁酸螯合剂为考来烯胺、考来替泊中的一种或两种。
4.如权利要求1所述的一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，还包括二异丙基氟碳酸25～30份。
5.如权利要求4所述的一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，还包括硫酸锌5～10份。
6.如权利要求5所述的一种十二指肠液样本的保存液，其特征在于，还包括碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液5～20份、所述十二指肠液样本的保存液的pH为9～10。
7.权利要求6所述的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、称取配方量的胆汁酸螯合剂、α-球蛋白、乙醇、氯化钠、葡萄糖、甘油、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，余量为水；
S2、往所述水中先加入胆汁酸螯合剂、乙醇、甘油，再加入α-球蛋白、氯化钠、葡萄糖搅拌混合均匀，得到混合溶液；
S3、在所述混合溶液冷却到室温后，用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH至7.0～7.6，加入水定容至预定体积，制得所述的一种十二指肠液样本的保存液。
8.权利要求7所述的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法，其特征在于，在所述S3后，用所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调节pH至9.0～10，加入水定容至预定体积，制得pH为9～10的十二指肠液样本的保存液。
9.如权利要求7所述的一种十二指肠液样本的保存液的制备方法，其特征在于，所述S2中，还包括往所述水中加入配方量的二异丙基氟碳酸、硫酸锌。
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