CN111024471A - 一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒及使用方法,其技术方案要点包括液基细胞清洗液和细胞染色液,液基细胞清洗液包括细胞保存液和蔗糖;细胞保存液包括以下:多聚甲醛、磷酸盐缓冲液、抗坏血酸、EDTA‑Na2·2H2O、N‑乙酰‑L‑半胱氨酸、4M NaOH、吐温‑20和无菌水;细胞染色液包括苏木素和EA50染色液,苏木素包括以下:硫酸铝钾、苏木色精、碘酸钠、乙酸、无水乙醇、丙三醇和无菌水;EA50染色液包括以下:亮绿SF、曙红、甲醇、磷钨酸、碳酸锂、冰醋酸和无菌水。具有保存细胞稳定性高、细胞固定良好、保留完整细胞形态、防止粘液干扰、细胞聚集、有效裂解红细胞等优点;价格便宜,方便易得,液基细胞保存液成本较低,便于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒及使用方法。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。宫颈癌是所有癌症中唯一明确病因的癌症---高危型人乳头瘤病毒持续感染。宫颈癌在全世界女性最常见癌症发病率中居第二位,每年有约50万新发病例。在过去20年里,宫颈癌发病逐渐年轻化,女性罹患宫颈癌的发病率呈逐年上升趋势,宫颈癌已成为威胁女性健康的重要疾患,已引起世界卫生组织的关注。在发展中国家,宫颈癌的发病率和死亡率持续增长,且超过80%的宫颈癌发生在发展中国家。目前,我国每年有13.15万宫颈癌新发病例,占全世界新发病例的28.7%。在美国,宫颈癌的发病率和死亡率已经下降超过85%,这主要归功于全国范围内宫颈癌普查项目的开展,因此宫颈癌的早期诊断以及预防显得越来越重要。
自20世纪50年代以来,以细胞学检查为主要方法的宫颈癌筛查大大降低了宫颈癌的发生率。传统的巴氏涂片法需医生手工将采集器上的细胞样本涂在载玻片上进行制片,然后置于显微镜下观察。但研究表明采用这种传统制片方法进行涂片最多只能收集20%的细胞,另外残留在采样器上的80%的细胞样本则随采样器一起丢弃。在涂片过程中有40%以上的涂片会因血液、粘液、炎症组织以及固定不及时而变得浑浊不清。综上,巴氏涂片法受到取材方法、涂片等因素的影响,细胞涂层厚,细胞堆积、分布不均匀、含红细胞及蛋白质等原因使恶性细胞的阳性检出率低,给临床诊断带来困难。
液基薄层细胞学检测技术是在传统巴氏细胞检测基础上改良后的检测方法。与传统涂片不同的是该检测方法将取样后的采样器直接放在液基薄层细胞保存液中进行漂洗,使成团的细胞离散,粘液溶解、红细胞破碎,然后通过直径5um滤膜,除去较小的炎症细胞及细胞碎片,进而得到一个薄薄的保存完好的细胞层,以备做进一步的显微检测和诊断。液基薄层细胞学检测技术对宫颈癌细胞的阳性检出率为95%以上,同时还能发现癌前病变,微生物感染如霉菌、滴虫、衣原体等,解决了传统巴氏涂片假阴性率高、丢失细胞率高(80%)和涂片质量差等技术难题。
目前,市场上常用的是美国新柏氏生产的液基细胞液,该产品与该公司的仪器Thinprere-2000配套使用,对宫颈鳞状上皮瘤变的检出率提高了100%以上,并能使不满意标本和不确定性的细胞学结果的误差率降到最低,能够显著提高宫颈病变的早期发现率,但因其价格昂贵,仅在一些大医院进行推广,难以推广至低收入地区或基层,无法普及。而国内同类产品,由于研发思路不同,技术原理也不尽相同所以在产品质量和制片质量等方面参差不齐。
发明内容
本发明的目的之一在于解决上述技术问题,提供一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,使液基细胞保存液具有保存细胞稳定性高、细胞固定良好、保留完整细胞形态、防止粘液干扰、细胞聚集、有效裂解红细胞等优点。
本发明的目的之二在于提供一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒的使用方法,价格便宜,方便易得,液基细胞保存液成本较低,便于推广应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,包括液基细胞清洗液和细胞染色液,所述液基细胞清洗液包括细胞保存液和蔗糖;所述细胞保存液包括以下成分:多聚甲醛、磷酸盐缓冲液、抗坏血酸、EDTA-Na2·2H2O、N-乙酰-L-半胱氨酸、4M NaOH、吐温-20和无菌水;
所述细胞染色液包括苏木素和EA50染色液,所述苏木素包括以下成分:硫酸铝钾、苏木色精、碘酸钠、乙酸、无水乙醇、丙三醇和无菌水;所述EA50染色液包括以下成分:亮绿SF、曙红、甲醇、磷钨酸、碳酸锂、冰醋酸和无菌水。
作为优选, 1L的所述细胞保存液中按质量百分比的成分:
多聚甲醛0.6%-1.1%
抗坏血酸0.03%-0.12%
EDTA-Na2·2H2O 0.08%-0.17%
N-乙酰-L-半胱氨酸0.01%-0.12%;
1L的所述细胞保存液中按体积百分比的成分:
吐温-20 0.005%-0.07%
4M NaOH 0.05%-0.13%。
作为优选,1L的所述液基细胞清洗液中细胞保存液的体积百分比为:8.5%-16%;1L的所述液基细胞清洗液中蔗糖的质量百分比为: 8%-13%。
作为优选,1L的所述细胞染色液的苏木素中按质量百分比的成分:
硫酸铝钾3%-7%
苏木色精0.1%-1.2%
碘酸钠0.01%-0.7%;
1L的所述细胞染色液的苏木素中按体积百分比的成分:
乙酸1.5%-2.3%
无水乙醇6.5%-10%
丙三醇0.2%-0.8%。
作为优选,1L的所述细胞染色液中的EA50染色液中按质量百分比的成分:
亮绿SF 0.01%-0.7%
曙红0.2%-0.8%
磷钨酸0.15%-0.3%;
1L的所述细胞染色液中的EA50染色液中按体积百分比的成分:
甲醇20%-29%
碳酸锂0.9%-2%
冰醋酸1.5%-2.3%。
所述磷酸盐缓冲液由磷酸盐和水性介质组成,1L的所述细胞保存液中磷酸盐的质量百分比为:0.09%-0.25%。
一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
步骤(1)将采得的样本轻轻混匀,不需要振荡;
步骤(2)在10ml离心管上标记编号;
步骤(3)将每个样本平分成三份在10ml离心管里;
步骤(4)1000r/min离心5分钟,弃上清;
步骤(5)分别在3个离心管里加入保存液,用吸管轻轻吹打混匀;
步骤(6)在一次性涂片器用铅笔写上编号,加入清洗液,样品摇匀后,600r/min 离心3min ,从涂片器中取出玻片置于染色架;
步骤(7)将装有玻片的染色架在95%乙醇中固定10min以上;
步骤(8)进行染色;
步骤(9)滴加中性树脂,封片;
步骤(10)镜检。
作为优选,所述步骤(8)中进行染色的具体步骤为:
⑦过两道TO透化。
作为优选,所述步骤(2)中的标记编号为实验组和对照组。
作为优选,所述步骤(3)中每组离心管设为3个。
本发明的有益效果是:
(1)能够快速对样品中的白细胞、脱落上皮细胞等有检验价值的细胞进行固定保存,防止有效细胞发生自溶,且固定保存对的细胞形态完好,能够保持样品采集时细胞的原始形态,不会发生膨胀、固缩等形态变化,保证检验对有效细胞数量和质量的要求;(2)能分离出包埋在粘液中的有效细胞,彻底清楚样本中的粘液,有效防止粘液对样品检验结果的干扰;(3)可制成均匀单层薄片;(4)裂解红细胞。
本发明通过上述各组分和组分含量的合理配比,使液基细胞保存液具有保存细胞稳定性高、细胞固定良好、保留完整细胞形态、防止粘液干扰、细胞聚集、有效裂解红细胞等优点,同时本发明提供的液基细胞保存液的各组分的价格便宜,方便易得,液基细胞保存液成本较低,便于推广应用。
附图说明
图1是本发明中实施例1处理后的宫颈细胞染色图片;
图2是本发明试剂盒制片图片;
图3是本发明美国新柏氏试剂盒制片图片。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述,下列实施例仅用于说明本发明而不应限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议条件进行,所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买的常规产品。
实施例1
经本发明一种用于宫颈癌筛查的试剂盒处理后的制片效果:
本发明用于宫颈癌筛查的试剂盒包括保存液、液基细胞清洗液、细胞染色液三个组分:
液基细胞保存液,每1L包含以下组分:6.3g多聚甲醛、1.0192g磷酸氢二钾,0.2574g磷酸二氢钾,0.379g抗坏血酸、0.57g EDTA-Na2·2H2O、0.2836gN-乙酰-L-半胱氨酸,0.7ml 4MNaOH,560ul 吐温-20,无菌水补足1L,pH 7.0。
液基细胞清洗液,每1L包含以下组分:150ml细胞保存液,80g蔗糖,无菌水。
液基细胞染色液,每1L包含以下组分:45g硫酸铝钾、3g苏木色精、60ml无水乙醇、230ml丙三醇、0.3g碘酸钠、15ml乙酸、0.4g亮绿SF、2.5g曙红、200ml甲醇、10ml冰醋酸、0.9g磷钨酸、8ml碳酸锂,无菌水。
具体操作步骤如下:
(1)将采得的样本轻轻混匀(不要振荡);
(2)在10ml离心管上标记编号;
(3)将每个样本平分成三份在10ml离心管里;
(4)1000r/min离心5分钟,弃上清;
(5)分别在3个离心管里加入4ml保存液,用吸管轻轻吹打混匀;
(6)在一次性涂片器用铅笔写上编号,加入3ml清洗液,样本摇匀后,600r/min 离心3min 。从涂片器中取出玻片置于染色架;
(7)将装有玻片的染色架在95%乙醇中固定10min以上;
(8)进行染色,具体步骤为:
①苏木素染色3min
②在清水中洗去苏木素,盐酸酒精分化,清水洗去盐酸酒精,流水反蓝。
③过3道95%乙醇脱水
④置于EA50中染色3min
⑤清水漂洗
⑥过3道无水乙醇脱水
⑦过两道TO透化
(9)滴加中性树脂,封片;
(10)镜检。
图1为经本实施例1提供的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒染色后的宫颈细胞镜检图片,镜检图片中鳞状上皮细胞分布均匀,细胞完整、饱满、保存状态良好,背景干净、清晰,且未发现红细胞、萎缩细胞和滴虫、念珠菌等微生物,实验结果表明试剂盒中的相关组分能够有效解决红细胞,粘液干扰、细胞聚集,样本染菌等问题,显著提高诊断结果的准确性。
实施例2
本发明试剂盒与市售同类产品试剂盒的制片效果比较:
目前,市场上常用的是美国新柏氏生产的液基细胞液,该产品对宫颈鳞状上皮瘤变的检出率提高了100%以上,并能使不满意标本和不确定性的细胞学结果的误差率降到最低,能够显著提高宫颈病变的早期发现率。选择新柏氏的液基细胞检测试剂盒作为本发明试剂盒的对照产品,评价制片效果。本发明的检测试剂盒为实验组,新柏氏试剂盒为对照组,具体实验操作如下:
(1)将采得的样本轻轻混匀(不要振荡);
(2)在10ml离心管上标记编号并标明实验组/对照组;
(3)将每个样本平分成三份在10ml离心管里,每组3个重复;
(4)1000r/min离心5分钟,弃上清;
(5)分别在3个离心管里加入对应的保存液4ml,用吸管轻轻吹打混匀;
(6)在一次性涂片器用铅笔写上编号,加入3ml清洗液,样本摇匀后, 600r/min离心3min 。从涂片器中取出玻片置于染色架;
(7)将装有玻片的染色架在95%乙醇中固定10min以上;
(8)进行染色,具体步骤为:
①苏木素染色3min
②在清水中洗去苏木素,盐酸酒精分化,清水洗去盐酸酒精,流水反蓝。
③过3道95%乙醇脱水
④置于EA50中染色3min
⑤清水漂洗
⑥过3道无水乙醇脱水
⑦过两道TO透化
(9)滴加中性树脂,封片;
(10)镜检。
表1本发明试剂盒与美国新柏氏试剂盒制片效果比较
评价项目 | 实验组 | 对照组 |
总背景 | 背景干净 | 背景干净 |
总体细胞数量 | 保留几乎全部细胞 | 保留几乎全部细胞 |
细胞种类形态 | 种类齐全、形态完整 | 种类齐全、形态完整 |
微生物形态 | 未见微生物 | 未见微生物 |
由图2和图3的镜检图片中鳞状上皮细胞分布均匀,细胞完整、饱满、保存状态良好,背景干净、清晰,且未发现红细胞、萎缩细胞和滴虫、念珠菌等微生物,结合图2、图3和表1可知,实验组与对照组的制片效果一致。
综上所述,本发明的一种用于宫颈癌的液基薄层细胞检测试剂盒具有能够快速对样品中的白细胞、脱落上皮细胞等有检验价值的细胞进行固定保存,防止有效细胞发生自溶,且固定保存对的细胞形态完好,能够保持样品采集时细胞的原始形态,不会发生膨胀、固缩等形态变化,达到检验对有效细胞数量和质量的要求;能分离出包埋在粘液中的有效细胞,彻底清楚样本中的粘液,有效防止粘液对样品检验结果的干扰;可制成均匀单层薄片;裂解红细胞等优点,且该试剂盒能够达到进口产品(美国新柏氏)的制片效果,降低生产成本,有利于产品在基层地区的推广使用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
附录
1、保存液配制
具体如下:
(1)取一个干净1000ml容器置于磁力搅拌器上,加入700 ml无菌水。 (2)继续往容器中依次加入6.3g多聚甲醛、1.0192g K2HPO4、0.2574g KH2PO4、0.57g EDTA-Na2·2H2O、0.379g抗坏血酸、0.2836 N-乙酰-L-半胱氨酸、0.56mL吐温-20,完全溶解,加水补足1L。 (3)最后用4M NaOH调节pH至7.0。
2、清洗液配制:
(1)取150ml细胞保存液,再加入80g蔗糖用磁力搅拌器搅拌溶解。
(2)用纯化水定容至1L,得到1L清洗液。
3、苏木素配制方法:(1L)
取一个干净1000ml容器,先加700mL水,然后加45g硫酸铝钾(12水合),90度加热3h;
同时在50mL离心管中加入3g苏木色精,补充无水乙醇至50mL,在振荡器中震荡3h;
之后两者混合再加230mL丙三醇、0.3g碘酸钠、150mL乙酸过夜成熟降温,隔天加入氢氧化钠至pH 2.7左右。
4、EA50配制方法:(1L)
取亮绿SF(淡黄)0.4g,在50mL离心管里溶于10mL蒸馏水和10mL无水乙醇。
取曙红2.5g,在50mL离心管里溶于20mL无水乙醇,
两者盖住,旋上瓶盖震荡了3h。
将亮绿倒入1000mL烧杯中,(残余亮绿可用无水乙醇润洗)
然后加入加甲醇200mL,
之后倒入曙紅,再加约10mL的冰醋酸,搅拌。
加入95乙醇定容至1L,(直接用烧杯定容)
最后加入磷钨酸0.9g,
加入饱和碳酸锂溶液调节pH至3.5,(约8mL)
保存过夜,隔天使用。
Claims (10)
1.一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,包括液基细胞清洗液和细胞染色液,所述液基细胞清洗液包括细胞保存液和蔗糖;所述细胞保存液由以下成分组合:多聚甲醛、磷酸盐缓冲液、抗坏血酸、EDTA-Na2·2H2O、N-乙酰-L-半胱氨酸、4M NaOH、吐温-20和无菌水;
所述细胞染色液包括苏木素和EA50染色液,所述苏木素由以下成分组成:硫酸铝钾、苏木色精、碘酸钠、乙酸、无水乙醇、丙三醇和无菌水;所述EA50染色液由以下成分组成:亮绿SF、曙红、甲醇、磷钨酸、碳酸锂、冰醋酸和无菌水。
2.根据权利1所述的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,1L的所述细胞保存液中按质量百分比的成分:
多聚甲醛0.6%-1.1%
抗坏血酸0.03%-0.12%
EDTA-Na2·2H2O 0.08%-0.17%
N-乙酰-L-半胱氨酸0.01%-0.12%;
1L的所述细胞保存液中按体积百分比的成分:
吐温-20 0.005%-0.07%
4M NaOH 0.05%-0.13%。
3.根据权利1所述的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,1L的所述液基细胞清洗液中细胞保存液的体积百分比为:8.5%-16%;1L的所述液基细胞清洗液中蔗糖的质量百分比为: 8%-13%。
4.根据权利1所述的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,1L的所述细胞染色液的苏木素中按质量百分比的成分:
硫酸铝钾3%-7%
苏木色精0.1%-1.2%
碘酸钠0.01%-0.7%;
1L的所述细胞染色液的苏木素中按体积百分比的成分:
乙酸1.5%-2.3%
无水乙醇6.5%-10%
丙三醇0.2%-0.8%。
5.根据权利1所述的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,1L的所述细胞染色液中的EA50染色液中按质量百分比的成分:
亮绿SF 0.01%-0.7%
曙红0.2%-0.8%
磷钨酸0.15%-0.3%;
1L的所述细胞染色液中的EA50染色液中按体积百分比的成分:
甲醇20%-29%
碳酸锂0.9%-2%
冰醋酸1.5%-2.3%。
6.根据权利1所述的一种用于宫颈癌筛查的液基细胞检测试剂盒,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液由磷酸盐和水性介质组成,1L的所述细胞保存液中磷酸盐的质量百分比为:0.09%-0.25%。
7.一种根据权利要求1-6任意一项所述试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1):将采得的样本轻轻混匀,不需要振荡;
步骤(2):在10ml离心管上标记编号;
步骤(3):将每个样本平分成三份在10ml离心管里;
步骤(4):1000r/min离心5分钟,弃上清;
步骤(5):分别在3个离心管里加入保存液,用吸管轻轻吹打混匀;
步骤(6):在一次性涂片器用铅笔写上编号,加入清洗液,样本摇匀后,600r/min 离心3min ,从涂片器中取出玻片置于染色架;
步骤(7):将装有玻片的染色架在95%乙醇中固定10min以上;
步骤(8):进行染色;
步骤(9):滴加中性树脂,封片;
步骤(10):镜检。
9.根据权利要求7所述试剂盒的使用方法,其特征在于:所述步骤(2)中的标记编号为实验组和对照组。
10.根据权利要求9所述试剂盒的使用方法,其特征在于:所述步骤(3)中每组离心管设为3个。
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