CN116296701A - 一种细胞固定液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞固定液及其应用，所述细胞固定液包含第一固定液、第二固定液、第三固定液和第四固定液，其中，所述第一固定液为含有质量体积浓度为1%的甲基纤维素和质量体积浓度为0.01%多聚赖氨酸的PBS混合液；所述第二固定液为60%（v/v）乙醇溶液；所述第三固定液为体积比90%（v/v）乙醇溶液；所述第四固定液为质量体积浓度为12%的多聚甲醛溶液。该方法构建的细胞蜡块可以弥补琼脂糖包埋或者细胞涂片的不足，达到组织蜡块的效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体而言，涉及细胞蜡块的快速稳定固定及蜡块制备方法。
背景技术
细胞病理学主要是根据细胞内异常物质或者细胞的形态变化，研究疾病的发生、发展变化规律，从而达到诊断疾病和预防疾病的目的。常规方法有细胞涂片、琼脂糖等方法。
细胞涂片常因细胞量少，厚薄不均一，涂片过程会导致细胞变性和损伤[参见：谢小林.去红细胞处理在血性体液标本细胞学制片及沉渣石蜡包埋制作中的应用[J.临床合理用药杂志,2020,13(11):167 -168.；琼脂糖法制作简单，但是琼脂糖发脱水通透性较差，不利于细胞块脱水且细胞松散，不能聚集在一起。[参见：CAO MQ,SHI J,LIU wW,etal.Improved and optimized prepa-ration technology of agarose cell block[J].Chin of Pathol,2019,48(2):151 -153.]
发明内容
发明目的：鉴于现有细胞石蜡包埋技术不足，细胞在固定过程中不易成团，只能用图片或者琼脂糖包埋等方法，本发明提供了一种简单的细胞样本固定方法及石蜡包埋制备及应用方法，此方法可以使细胞样本固定后稳定成团，达到类似组织蜡块的效果，可以连续切片并适用各类病理染色。本方法构建的细胞石蜡包埋过程快速稳定，细胞可以很好成团，后续实验方法简单，以弥补琼脂糖包埋或者细胞涂片的不足，达到组织蜡块的效果。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种细胞固定液，包含第一固定液、第二固定液、第三固定液和第四固定液，其中，所述第一固定液为含有质量体积浓度(1·g/100mL)为1％的甲基纤维素和质量体积浓度为0.01％多聚赖氨酸的PBS混合液；所述第二固定液为60％(v/v)乙醇溶液；所述第三固定液为体积比90％(v/v)乙醇溶液；所述第四固定液为质量体积浓度为12％的多聚甲醛溶液。
本发明进一步提出了上述细胞固定液在制作细胞蜡块上的应用。
进一步地，本发明提出一种利用上述细胞固定液制备细胞蜡块的方法，包括如下步骤：
(1)细胞收集：取液基细胞标本，离心弃上清，收集细胞于离心管中；
(2)将第一固定液加入含有细胞的离心管中，混合，得到细胞悬浮液，静置10-15min，离心留沉淀，去上清；
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入第二固定液，混合，得到悬浮液后立即离心，留沉淀，去上清；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入第三固定液，混合，得到悬浮液后立即离心，留沉淀，去上清；
(5)向步骤(4)得到的沉淀中加入第四固定液，常温固定24-72h，留沉淀，去上清；
(6)将步骤(5)得到的沉淀放入包埋盒中，使用全自动封闭组织脱水机处理，完成后放入石蜡包埋机中包埋，完成后冰冻脱模取出。
其中，步骤(1)中离心条件为3000r/min离心5min；步骤(3)和步骤(4)中离心条件为3000r/min离心10min。
步骤(2)和步骤(3)中，通过用移液枪小心吹打细胞，使之均匀悬浮，得到悬浮液。
具体地，全自动封闭组织脱水机器处理的脱水流程如下：
本申请的固定方法适用于人、大鼠、小鼠的贴壁细胞系。
在一些具体的实施方式中，所述细胞为CHO-K1、PC12、SKOV3。
有益效果：本发明可实现细胞样本固定后稳定成团，达到类似组织蜡块的效果，可以连续切片并适用各类病理染色，为细胞病理学相关检测提供了新的细胞样本包埋解决方案。
附图说明
图1为实施例1中PC12细胞经12％多聚甲醛固定24h后的细胞团块照片；
图2为实施例1制备得到的细胞蜡块免疫组化、IF和HE染色实验结果图；
图3为不同包埋方法得到的PC12细胞的HE染色结果图；
图4为不同包埋方法得到的PC12细胞的IHC结果(胞浆蛋白)；
图5为不同包埋方法得到的PC12细胞的IHC结果(核蛋白)；
图6为不同包埋方法得到的PC12细胞的IHC结果(膜蛋白)；
图7为不同包埋方法得到的PC12细胞的IF结果(膜蛋白)；
图8为不同包埋方法得到的PC12细胞的IF结果(包浆蛋白)。
具体实施方式
为了能够更清楚理解本发明的技术构思和技术手段，并可依照说明书的内容和本领域的常规技术手段予以实施，下面结合具体的实施例和附图对本发明做进一步详细说明，但是以下具体试验例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1对培养细胞的固定。
1.细胞来源及前处理：
1.1选取对数生长期的CHO-K1、PC12、SKOV3(上述细胞来自江苏凯基生物科技股份有限公司CHO-K1货号：KG420，PC12货号：KG111，SK-OV-3货号：
KG201)等贴壁细胞去掉细胞上清液，加入无菌PBS清洗两次；加入1mL 0.25％
胰蛋白酶细胞消化液，常温消化10min后加入1mL含血清的培养基终止消化；
用移液器吹打细胞，然后将细胞悬液吸到离心管中，3000r/min离心5min；弃上清液。
2.第一固定液的制备及细胞固定：
2.1配置含有1％的甲基纤维素、0.01％多聚懒氨酸的PBS(PH值7.2-7.6)第一固定液；
2.2将配置好的含有1％的甲基纤维素、0.01％多聚懒氨酸的PBS(PH值7.2-7.6)第一固定液沿管壁加入离心管中，之后用移液枪小心吹打细胞，使之均匀悬浮，待细胞充分悬浮于第一固定液后静置10min，然后3000r/min离心10分钟留沉淀去除上清。
3.第二固定液制备及处理
3.1所得沉淀将配置好的第二固定液(60％乙醇溶液)沿管壁加入离心管中，之后用移液枪小心吹打细胞，使之均匀悬浮。细胞充分悬浮于第二固定液后立即3000r/min离心10min留沉淀去除上清。
4.第三固定液3制备及处理
所得沉淀将配置好的第三固定液(90％乙醇溶液)沿管壁加入离心管中，之后用移液枪小心吹打细胞，使之均匀悬浮。细胞充分悬浮于第三固定液后立即3000r/min离心10min留沉淀去除上清。
5.第四固定液制备及处理
5.1所得沉淀将配置好的第四固定液(12％多聚甲醛溶液)沿管壁加入离心管中常温固定24h。
图1为PC12细胞经12％多聚甲醛固定24h后的细胞团块照片，从图中可以看出，成团效果较好。
6.用全自动封闭组织脱水机器进行组织处理
6.1所得细胞沉淀用滤纸包裹后放入包埋盒中，使用全自动封闭组织脱水机处理。
脱水流程如下：
完成后放入石蜡包埋机中包埋，完成后冰冻脱模取出。
实施例2免疫组化(IHC)实验、HE染色和(免疫荧光IF)实验。
将实施例1制备得到的蜡块进行免疫组化实验、HE染色和IF实验。
其中，免疫组化实验方法如下：
(1)预处理：
1.1石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min。分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，PBS浸洗3min×3次。
(2)实验步骤
2.1抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的染色盒内，放至微波炉中，中高火档至加热10分钟，将染色盒取出浸入流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却)，自然冷却后用PBS浸洗3次；
2.2灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min。PBS浸洗3min×3次；
2.3封闭:滴加1％BSA50-100μl，室温孵育20分钟。甩去，不洗。
2.4抗原-抗体反应：滴加一抗50-100μl,，4℃过夜。PBS浸洗3min×3次；
2.5一抗二抗反应：滴加羊抗兔/鼠聚合物50μl,，室温湿盒孵育20分钟。PBS浸洗3min×3次；
2.6显色：每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液；
2.7终止显色：镜下观察染色深浅，染好立即终止，用自来水轻柔冲洗15分钟用蒸馏水终止显色反应；
2.8复染：将切片放入苏木素染液，染色10min，用蒸馏水冲洗干净，之后0.1％HCl分化，自来水冲洗后返蓝；
2.9脱水封片：分别用70％乙醇中浸泡5分钟；85％乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟；无水乙醇乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。在切片上加中性树胶，加盖玻片；
2.10观察：显微镜下拍照保存。
HE实验方法：
(1)预处理
1.1石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min；分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，PBS浸洗3min×3次；
(2)实验步骤
2.1浸入苏木素染液染色3-5min，水洗约30-60s；
2.2浸入伊红染色液染色20s，水洗约30-60s；
2.3浸入100％酒精中约20s，水洗约30-60s；
2.4脱水封片：分别用70％乙醇中浸泡10；85％乙醇中浸泡10s；95％乙醇中浸泡5分钟；无水乙醇乙醇中浸泡10s。用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。在切片上加中性树胶，加盖玻片。
2.5观察：显微镜下拍照保存。
IF实验：
(1)预处理
1.1石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min。分别用无水乙醇中浸泡5min；95％乙醇中浸泡5min；85％乙醇中浸泡5min；70％乙醇中浸泡5min，PBS浸洗3min×3次。
(2)实验步骤
2.1抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的染色盒内，放至微波炉中，中高火档至加热10分钟，将染色盒取出浸入流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却)，自然冷却后用PBS浸洗3次
2.2灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min。。PBS浸洗3次。
2.3封闭:滴加即用型山羊血清50-100ul,室温孵育20分钟.
2.4抗原-抗体反应：滴加一抗稀释液50-100ul，37℃，湿盒孵育2小时。PBS浸洗3次。
2.5一抗二抗反应：滴加二抗50-100ul，37℃，避光孵育1h；
2.6PBS浸洗3次。
2.7复染：每张片子滴加配制DAPI染液50-100ul，室温避光放置5min。
2.8封片：用防萃灭封片胶封片。
2.9观察：显微镜下拍照保存。
实验结果如图2所示。
对比例
对固定液成分对包埋效果的影响进行了考察。
A组：琼脂糖包埋得到的蜡块，其中，琼脂包埋法步骤为：细胞样本离心沉淀后弃上清，加入沉淀体积10倍的10％中性福尔马林吹打均匀悬浮固定1h，3 000r/min离心5min离心已固定标本，加入2％融化的琼脂，混匀后3 000r/min离心10min，取出凝固的细胞块，用滤纸包裹后放入包埋盒，常规脱水﹑包埋、制片即可。
B组：不使用第一固定液，用第二至第四固定液进行固定得到的蜡块；
C组：第一固定液中，去除多聚赖氨酸组分，其余同实施例1；
D组：第一固定液中，去除甲基纤维素，其余同实施例1。
利用上述方法得到的蜡块进行免疫组化实验、HE染色和IF实验，结果如图3-图8所示。如图3-图8所示，传统琼脂糖包埋法及本发明在不使用固定液1的情况下所制备的蜡块结果细胞分布较为松散，不能很好的聚集成团；本发明固定液1在缺少多聚赖氨酸或者甲基纤维素的情况下，细胞聚集成团效果和传统琼脂糖包埋法类似，均不能够有效聚集细胞团，程松散状。使用本发明固定液后，能有效聚集细胞团，结构紧密。结构紧密的肿瘤细胞团块，能够有效的避免由于结构松散导致的后期检测实验过程中(免疫组化、免疫组化)繁琐的实验步骤导致的样本脱落、假阳性、假阴性的情况，提高实验的准确性。
本发明提供了一种细胞固定液以及细胞蜡块的制备思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (8)
1.一种细胞固定液，其特征在于，包含第一固定液、第二固定液、第三固定液和第四固定液，其中，所述第一固定液为含有质量体积浓度为1%的甲基纤维素和质量体积浓度为0.01%多聚赖氨酸的PBS混合液；所述第二固定液为60%（v/v）乙醇溶液；所述第三固定液为体积比90%（v/v）乙醇溶液；所述第四固定液为质量体积浓度为12%的多聚甲醛溶液。
2.权利要求1所述的细胞固定液在制作细胞蜡块上的应用。
3.一种利用权利要求1所述的细胞固定液制备细胞蜡块的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）细胞收集：取液基细胞标本，离心弃上清，收集细胞于离心管中；
（2）将第一固定液加入含有细胞的离心管中，混合，得到细胞悬浮液，静置10-15min，离心留沉淀，去上清；
（3）向步骤（2）得到的沉淀中加入第二固定液，混合，得到悬浮液后立即离心，留沉淀，去上清；
（4）向步骤（3）得到的沉淀中加入第三固定液，混合，得到悬浮液后立即离心，留沉淀，去上清；
（5）向步骤（4）得到的沉淀中加入第四固定液，常温固定24-72h，留沉淀，去上清；
（6）将步骤（5）得到的沉淀放入包埋盒中，使用全自动封闭组织脱水机处理，完成后放入石蜡包埋机中包埋，完成后冰冻脱模取出。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中离心条件为3000r/min离心5min；步骤（3）和步骤（4）中离心条件为3000r/min离心10min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，通过用移液枪小心吹打细胞，使之均匀悬浮，得到悬浮液。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，全自动封闭组织脱水机器处理的脱水流程如下：
12%甲醛 40min
75%乙醇 1.5h
85%乙醇 40min
95%乙醇 1h
95%乙醇 1h
100%乙醇 1h
100%乙醇 30min
100%二甲苯 45min
100%二甲苯 40min
石蜡 1h
石蜡 1h
石蜡 30min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为人、大鼠、小鼠的贴壁细胞系。
8.根据权利要求8所述的制备方法，所述细胞为CHO-K1、PC12、SKOV3。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310305247.3A CN116296701A (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 一种细胞固定液及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310305247.3A CN116296701A (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 一种细胞固定液及其应用 |
Publications (1)
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310305247.3A Pending CN116296701A (zh) | 2023-03-27 | 2023-03-27 | 一种细胞固定液及其应用 |
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