CN105039569A - 一种相互易位染色体的断点分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种相互易位染色体的断点分析方法，其利用染色体显微切割技术获得易位染色体断点附近染色质，再利用NGS技术测序分析，可以快速且相对价廉地进行断点的精确定位，有利于对相互易位染色体进行后续分析，如可以利用这些信息设计引物，对相互易位携带者的PGD胚胎进行诊断，分辨完全正常胚胎和携带相互易位染色体的胚胎，通过仅移植完全正常的胚胎而阻断相互易位染色体在该家族中的传递。

Description

一种相互易位染色体的断点分析方法

技术领域

本发明涉及细胞遗传工程领域，尤其是涉及一种相互易位染色体的断点分析方法。

背景技术

染色体相互易位是指非同源染色体的染色质发生交换而引起的染色体结构变化，其在新生儿中的发生率约为1/500至1/6251。染色体相互易位携带者往往没有临床表型，因此常常被称为染色体相互易位携带者。然而由于在减数分裂过程中染色体的异常分离，会产生很大比例的染色体异常的配子。对于非Robertsonian易位携带者来说，理论上仅能产生1/18完全正常的配子，1/18携带相互易位染色体的配子，其余均为异常配子。这些配子受精后会形成部分三体或者部分单体的受精卵，容易导致胚胎发生早期流产。目前通过荧光原位杂交(FISH)、基因芯片(SNPArray)以及新一代测序(NGS)技术对由于相互易位异常减数分裂导致的部分三体或者部分单体胚胎进行植入前遗传学诊断(PGD)的技术已经十分成熟。然而，目前还没有一种临床上可以接受的方法在胚胎植入前将染色体完全正常的胚胎和携带相互易位染色体的胚胎区分开来。相互易位携带者仍有可能生育携带相互易位染色体的后代，该后代到了生育年龄仍然面临由于反复流产而求助于PGD进行辅助生殖的窘境。

寻找相互易位断点一直是细胞遗传学研究的热点之一。目前寻找相互易位断点的主要方法有荧光原位杂交(FISH)+染色体步移法、相互易位染色体流式分选+新一代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)、FISH+区域捕获+NGS及环化建库+NGS等。早期寻找相互易位染色体断点的方法需要通过原位杂交确定大概的染色体位置，再通过染色体步移测序寻找断点，方法费时费力，且由于基因组结构十分复杂，成功率不高。随着测序技术的进步，测序成本迅速降低，大规模序列分析也逐步变为可能。人们逐步采用NGS技术对基因组进行分析，从而寻找相互易位染色体断点。2008年德国Ropers研究小组采用特殊的流式细胞分选术分选相互易位染色体，再对分选后的染色体进行NGS分析，从而找到断点。这一技术需要特殊的流式细胞仪和分选技术，测序成本也很高，难于推广和临床应用。2011年美国约翰霍普金斯大学和哈弗大学的两个独立小组均报道了运用区域捕获技术结合NGS技术进行断点查找的工作，这一方法虽然可以大大减少测序通量，然而需要设计特殊的捕获芯片，费时费力，仍然难以应用于临床。2012年新英格兰医学杂志报道了美国哈弗大学的新研究成果，利用DNA环化建库结合NGS技术进行断点寻找。该方法无需进行中期核分裂相的制备，可以利用DNA直接进行环化建库，分析断点信息，将断点分析又向临床推进了一步。然而，该方法需要用到特殊的建库方法，测序量仍然较大(约需测序两亿八千万reads)，在临床应用上仍有一定困难。目前还没有一种合适的方法进行相互易位染色体断点分析。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速有效的相互易位染色体的断点分析方法。

一种相互易位染色体的断点分析方法，包括如下步骤：

步骤S1，制作细胞周期处于有丝分裂中期的细胞样本；

步骤S2，收集所述细胞样本，进行染色体显带操作，选取条带清晰的样本；

步骤S3，在所述样本上找到相互易位的染色体，切割下易位染色体断点附近的染色质，并对切割下的染色质进行扩增处理；

步骤S4，对扩增处理后的染色质进行NGS测序分析，并将测序结果比对至人类基因组上，获得相互易位染色体的断点位置。

在其中一个实施例中，所述步骤S1中，所述细胞样本为外周血细胞样本。

在其中一个实施例中，所述步骤S1包括如下步骤：将肝素抗凝外周血接种至含PHA的RPMI1640培养基中，37℃恒温箱培养72小时后加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷，继续培养17小时后加入胸腺嘧啶核苷，再在5小时后加入秋水仙素，再在2小时后收集得到所述细胞样本。

在其中一个实施例中，所述步骤S2包括如下步骤：

步骤S21，向所述细胞样本中加入低渗液进行低渗处理；

步骤S22，向低渗处理后的所述细胞样本中加入固定液进行固定处理，并制备固定后的细胞悬液；

步骤S23，对所述细胞悬液进行滴片处理，制得细胞滴片；

步骤S24，对所述细胞滴片进行染色处理；

步骤S25，染色处理后，进行镜检，选取中期染色体形态分散良好、条带清晰的样本。

在其中一个实施例中，在步骤S21中，所述低渗液是浓度为0.075M的KCl溶液；

在步骤S22中，所述固定液是体积比为3:1的甲醇与乙酸的混合液体，所述细胞悬液是按照0.5mL外周血培养收获的细胞制备2mL细胞悬液的标准制备。

在其中一个实施例中，在所述步骤S23中，在滴片过程中，保持60-100cm的高度进行滴片，每张盖玻片中部滴一滴所述细胞悬液。

在其中一个实施例中，在所述步骤S24中，在进行染色之前还包括对细胞滴片进行老化处理，并将老化处理后的细胞滴片置于胰蛋白酶溶液中消化处理的步骤，再对消化处理后得到的细胞滴片进行所述染色处理，其中，染色处理使用的染色液为Giemsa染色液。

在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，收集的易位染色体断点附近的染色质拷贝数量为6-8个。

在其中一个实施例中，所述步骤S3包括如下步骤：

步骤S31，将样本置于显微镜下找到相互易位的染色体，并切割下易位染色体断点附近的染色质；

步骤S32，将切割下的染色质转移入含有UN1引物的收集液中，进行预扩增处理，所述UN1引物的序列如SEQIDNo.1所示；

步骤S33，对将预扩增处理得到溶液置于含有UN1引物的扩增液中，进行PCR扩增处理。

在其中一个实施例中，在所述步骤S32中，所述收集液包括如下体积份数的各组分：1μL的5×TOPO缓冲液、0.5μL的2mMdNTP、0.1μL的UN1引物、3.5μL的dH₂O以及0.1μL的拓扑异构酶I。

在其中一个实施例中，在所述步骤S32中，预扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、30℃1-5min、37℃3min循环4-15次，其中，每个循环在30℃处理时均需向反应体系中加入0.2μL的T7DNA测序酶。

在其中一个实施例中，在所述步骤S33中，所述扩增液包括如下体积分数的各组分：5μL的10×PCR缓冲液、5μL的2mMdNTP、1μL的UN1引物、40μL的dH₂O以及2.5U的TaqDNA多聚酶。

在其中一个实施例中，在所述步骤S33中，所述PCR扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、56℃1min、72℃1.5min循环30次，再72℃5min，最后于16℃保存。

在其中一个实施例中，在所述步骤S3之后，所述步骤S4之前，还包括对扩增产物进行PCR荧光标记，并在有丝分裂中期核分裂相中进行FISH，以验证显微切割是否成功的步骤。

在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，包括构建测序文库、对构建的测序文库进行NGS测序以及对测序结果进行数据分析的步骤。

在其中一个实施例中，在所述步骤S4之后还包括：

在获得的断点位置附近设计引物，对样本的gDNA进行PCR扩增；

对PCR产物进行Sanger测序验证，获取确切的断点位置。

上述相互易位染色体的断点分析方法利用染色体显微切割技术获得易位染色体断点附近染色质，再利用NGS技术测序分析，可以快速且相对价廉地进行断点的精确定位，有利于对相互易位染色体进行后续分析，如可以利用这些信息设计引物，对相互易位携带者的PGD胚胎进行诊断，分辨完全正常胚胎和携带相互易位染色体的胚胎，通过仅移植完全正常的胚胎而阻断相互易位染色体在该家族中的传递。

该分析方法将染色体显微切割技术和NGS技术结合起来形成一个新的染色体显微切割为基础的NGS技术(Microdissectionbasednext-generationsequencing,Micro-NGS)，通过染色体显微切割技术快速特异地富集断点附近染色质，既可减少后期测序通量和信息分析难度以降低成本，又可以快速获得相互易位染色体断点附近的序列信息，精确寻找到断点位置，为后期分析提供支持。

附图说明

图1为一实施方式的相互易位染色体的断点分析方法的流程示意图；

图2为实施例的部分核型图(a)及易位染色体涂探针FISH结果(b)和衍生染色体跨断点片段显微切割产物反向杂交FISH验证结果，图中，(c)为der(1)，(d)为der(2)，chr表示染色体，der表示衍生染色体，本实施例外周血核型为46,XX,t(1；2)(p31；q13)；

图3为NGS测序分析得到的断点分析示意图；

图4为衍生4号染色体跨断点DNA片段PCR扩增结果(a)和Sanger测序图(b)，衍生9号染色体跨断点DNA片段PCR扩增结果(c)和Sanger测序图(d)，其中，M为DNAmaker，1泳道为实验者的gDNA，2泳道为正常人gDNA，黑色箭头示断裂连接点处；

图5为精确断点序列图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对相互易位染色体的断点分析方法作进一步详细的说明。

如图1所示，一实施方式的相互易位染色体的断点分析方法包括如下步骤：

步骤S110，制作细胞周期处于有丝分裂中期的细胞样本。

在本实施方式中，细胞样本为外周血细胞样本。步骤S110具体包括如下步骤：将肝素抗凝外周血0.5mL接种至5mL含PHA的RPMI1640培养基中，37℃恒温箱培养72小时后加入五氟尿嘧啶(Frdu)和尿嘧啶核苷(Uridine)，继续培养17小时后加入胸腺嘧啶核苷(TDR)，再培养5小时后加入秋水仙素，再培养2小时后收集得到细胞样本。

步骤S120，收集细胞样本，进行染色体显带操作，选取条带清晰的样本。

具体在本实施方式中，步骤S120包括如下步骤：

步骤S121，向细胞样本中加入低渗液进行低渗处理。低渗液优选浓度为0.075M的KCl溶液。

步骤S122，向低渗处理后的细胞样本中加入固定液进行固定处理，并制备固定后的细胞悬液。

优选的，在本实施方式中，在固定处理过程中对细胞样本进行多次固定，每次固定完离心去上清，再加入固定液进行下一次固定处理。

固定液优选体积比为3:1的甲醇与乙酸的混合液体。

本实施方式将0.5mL全外周血培养收获的细胞最终制备成2mL细胞悬液进行滴片。

步骤S123，对细胞悬液进行滴片处理，制得细胞滴片。

在滴片过程中，保持60-100cm的高度进行滴片，每张盖玻片中部滴一滴细胞悬液，室温条件下自然晾干。

步骤S124，对细胞滴片进行染色处理。

在本实施方式中，在进行染色之前还包括对细胞滴片进行老化处理，如可以将细胞滴片放置在37℃的恒温箱中进行老化，并将老化处理后的细胞滴片置于胰蛋白酶溶液中进行消化处理的步骤，再对消化处理后得到的细胞滴片进行染色处理，其中，染色处理使用的染色液优选为Giemsa染色液。

步骤S125，染色处理后，进行镜检，选取中期染色体形态分散良好、条带清晰的样本。

步骤S130，在样本上找到相互易位的染色体，切割下易位染色体断点附近的染色质，并对切割下的染色质进行扩增处理。

在本实施方式中，需要收集易位染色体断点附近的染色质拷贝数量为6-8个。步骤S130具体包括如下步骤：

步骤S131，将样本置于显微镜下找到相互易位的染色体，并切割下易位染色体断点附近的染色质。

步骤S132，将切割下的染色质转移入含有UN1引物的收集液中，进行预扩增处理。

收集液优选包括如下体积份数的各组分：1μL的5×TOPO缓冲液、0.5μL的2mMdNTP、0.1μL的UN1引物、3.5μL的dH₂O以及0.1μL的拓扑异构酶I。预扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、30℃1-5min、37℃3min循环4-15次，其中，每个循环在30℃处理时均需向反应体系中加入0.2μL的T7DNA测序酶。

步骤S133，对将预扩增处理得到溶液置于含有UN1引物的扩增液中，进行PCR扩增处理。

扩增液包括如下体积分数的各组分：5μL的10×PCR缓冲液、5μL的2mMdNTP、1μL的UN1引物、40μL的dH₂O以及0.5μL的TaqDNA多聚酶。PCR扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、56℃1min、72℃1.5min循环30次，再72℃5min，16℃保存。

此外，在本实施方式中，在进行步骤S130之后，进行步骤S140之前，还包括对扩增产物进行PCR荧光标记，并在有丝分裂中期核分裂相中进行FISH，以验证显微切割是否成功的步骤，若验证切割成功，则进行后续步骤S140，若不成功，重新制作细胞滴片进行染色体显微切割处理。

步骤S140，对扩增处理后的染色质进行NGS测序分析，并将测序结果比对至人类基因组上，获得平衡易位染色体的断点位置。

在本实施方式中，步骤S140中，包括使用但不限于LifeTech公司的IONXPRESSLIBRARY试剂盒构建测序文库、使用但不限于IONPGMSEQUENCING200KITV2对构建的测序文库进行NGS测序以及使用但不限于IGV软件将NGS测序数据比对至人类基因组上对测序结果进行数据分析的步骤。

此外，在本实施方式中，在步骤S140之后还包括：在获得的断点位置附近设计引物，对样本的gDNA进行PCR扩增；再对PCR产物进行测序验证，获取确切的断点位置。

上述相互易位染色体的断点分析方法利用染色体显微切割技术获得易位染色体断点附近染色质，再利用NGS技术测序分析，可以快速且相对价廉地进行断点的精确定位，有利于对相互易位染色体进行后续分析，如可以利用这些信息设计引物，对相互易位携带者的PGD胚胎进行诊断，分辨完全正常胚胎和携带相互易位染色体的胚胎，通过仅移植完全正常的胚胎而阻断相互易位染色体在该家族中的传递。

该分析方法将染色体显微切割技术和NGS技术结合起来形成一个新的染色体显微切割为基础的NGS技术(Microdissectionbasednext-generationsequencing,Micro-NGS)，通过染色体显微切割技术快速特异地富集断点附近染色质，既可减少后期测序通量和信息分析难度以降低成本，又可以快速获得相互易位染色体断点附近的序列信息，精确寻找到断点位置，为后期分析提供支持。

以下为具体实施例部分：

一、主要实验仪器及用品：

主要仪器：培养瓶、吸管、吸头、离心管、盖玻片、离心机、染缸、烧杯、超净工作台、通风柜、PCR仪(Eppendorf)、高速冷冻离心机、水浴箱、恒温箱、显微操作臂(Narishige)、倒置显微镜(Olympus)、拉针仪(Narishige)、毛细玻璃管、电泳槽(北京六一生物科技有限公司)、凝胶成像系统(VILBERLOURMET)；

培养基：25％的RPMI1640小牛血清培养基；

同步化及显带所用试剂：10^-5M5Frdu(五氟尿嘧啶)，10^-4MUridine(尿嘧啶核苷)，1/15MKH₂PO₄溶液，10^-3MTDR(胸腺嘧啶核苷)，0.075MKCl低渗液，1/15MNa₂HPO₄溶液，1mg/mLEB(溴化乙锭)溶液，质量分数0.85％的NaCl，质量分数2.5％胰酶，质量分数0.4％酚红，20μg/ml的秋水仙素；

固定剂：甲醇:乙酸＝3:1(体积比)；

Giemsa染色液等；

显微切割试剂：TopoisomeraseI(拓扑异构酶I)、T7DNA测序酶、TaqDNA多聚酶：AmpliTaqDNApolymerase,LD、UN1引物(UN1primer：5’-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’，SEQIDNo.1)、5×TOPO缓冲液(含200mmol/LTris-HCl(pH7.5)、100mmol/LMgCl₂及250mmol/LNaCl)、10×PCR缓冲液(含100mmol/LTris-HCl(pH8.4)、20mmol/LMgCl₂、500mMKCl及0.01％Gelatin)、dNTP(2mM)、超纯水(dH₂O，无核酸污染)、琼脂糖粉。

二、实验流程：

1.中期染色体标本制备

将肝素抗凝外周血0.5mL接种至5mL含PHA的RPMI1640培养基中，37℃恒温箱培养72小时加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷各100μL，17小时后加胸腺嘧啶核苷100μL，5小时后加秋水仙素50μL，2小时后收获细胞液。

外周血样本来源于中信湘雅生殖与遗传专科医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了相互易位携带者及其家属的同意。

可理解，在其他实施例中，该外周血样本也可以取自一些样本冻存库或者治疗机构等。

2.细胞收获、显带操作

1)将细胞液移入15mL离心管中，1500rpm×10min×RT离心，去上清，加37℃0.075MKCl低渗液至8mL，于37℃水浴箱低渗处理40min。

2)向体系中加入1.5mL固定液，混匀后室温条件下放置水浴5min。

3)1500rpm×10min×RT离心，去上清，加固定液至8mL，打匀，室温条件下放置30min。

4)1500rpm×10min×RT离心，去上清，加固定液至8mL，打匀，室温条件下放置30min。

5)1500rpm×10min×RT离心，去上清，留少许制成细胞悬液，细胞悬液浓度相对普通外周血G带宜稀，0.5mL全外周血培养收获的细胞最终制备成2mL细胞悬液进行滴片。

6)保持60-100cm的高度进行滴片，每张盖玻片中部滴1滴，室温条件下自然晾干。

7)将制得的细胞滴片于37℃恒温箱老化过夜后，2.5％胰酶溶液水浴37℃消化盖玻片3min，Giemsa染色液染色体5min，取出盖玻片用蒸馏水洗去残留的染液室温晾干后镜检，选取中期染色体形态以及分散良好、条带清晰的盖玻片放置37℃恒温箱过夜备用。

3.染色体显微切割

1)配制收集液，配方如下表1

表1

2)在带有显微操作臂的倒置显微镜上，100×物镜镜头下找到相互易位染色体，结果如图2所示。

3)切割断点附近染色质6-8个拷贝，并将染色质转移入已加入5μL收集液的Ep管中。

4)37℃孵育1小时，96℃处理10min。

5)预扩增4-15个循环，预扩增条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、30℃1-5min、37℃3min循环4-15次，其中，每个循环在30℃处理时均需向反应体系中加入0.2μL的T7DNA测序酶。

6)PCR扩增40-50循环。

PCR扩增液配方如下表2：

表2

PCR扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、56℃1min、72℃1.5min循环30次，再72℃5min，16℃保存。

4.FISH验证

1)PCR产物荧光标记扩增液配方如下表3：

表3

PCR扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、56℃1min、72℃1.5min循环30次，再72℃5min，16℃保存。

2)荧光标记PCR产物的沉淀和探针溶解

25μL荧光标记PCR产物、25μL超纯水、7.5μL3MNaAc与150μL-20℃预冷的冰无水乙醇混匀后于-80℃放置15min，再在4℃条件下1.3万转/分钟离心20min，去上清，加150μL-20℃预冷75％的酒精洗涤一次，室温条件暗处干燥，加3μL超纯水和7μL杂交液充分溶解备用。

3)在患者的中期核分裂相中进行FISH，验证显微切割产物是否包含跨断点区域

a、将上述获得的细胞制成适宜浓度的细胞悬夜滴50μL于载玻片中央，共滴4张，将载玻片放入60℃烤箱中烘烤2小时，将普通光学显微镜光圈调至最小位置，放大100倍镜检载玻片，选取2张中期分裂相分散良好的载玻片进行荧光原位杂交实验。

b、RNaseA处理：在标本玻片杂交区加40μL0.1mg/mlRNaseA溶液并盖上蜡膜，放入湿盒中于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入70％、90％、100％的酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。

c、探针、玻片变性及杂交

将10μL探针液于75℃水浴变性5min后，立即放置冰块中备用；载玻片于75℃变性液(70％甲酰胺、2×SSC)中变性5min，酒精梯度脱水迅速风干玻片；将已变性探针10μL加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜(约16h)。

d、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号

小心揭去透明胶和蜡膜，将玻片依次于洗脱液I(WS-I：甲酰胺50％(v/v)、10％(v/v)20×SSC、40％(v/v)蒸馏水)中45℃洗3次×2min，洗脱液II(WS-II：4×SSC/0.05％Tween-20)中25℃洗3次×2min，洗脱液III(WS-III：4×SSC)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水后室温晾干玻片；加10μLDAPI(0.5mg/ml)复染，盖上盖玻片，暗处放置20min后用荧光显微镜观察信号并照像保存。

结果如图2c显示显微切割产物der(1)(SpectrumGreen)的荧光标记探针在chr1、der(1)和chr2上均观察到一个绿色的杂交信号，而在der(2)上无绿色杂交信号，说明显微切割产物der(1)包含了跨断点区域，der(1)显微切割成功。图2d显示显微切割产物der(2)(SpectrumGreen)的荧光标记探针在chr1、der(2)和chr2上均观察到一个绿色的杂交信号，而在der(1)上无绿色杂交信号，说明显微切割产物der(2)包含了跨断点区域，der(2)显微切割成功。

5.NGS分析

采用LifeTech公司的IONXPRESSLIBRARY试剂盒构建测序文库。

1)DNA酶切打断

取DNA(100ng)加入到PCR管中，体系补水至35μL。震荡混匀。震荡混匀IonShear^TMPlus10×ReactionBuffer和EnzymeMixII，瞬时离心后放置冰上。加5μL10×ReactionBuffer于PCR管中，吹吸10次左右混匀。加10μLEnzymeMIXⅡ，吹吸混匀。PCR仪上37℃孵育3min。孵育后立即加入5μL终止缓冲液，震荡混匀，瞬时离心后置于冰上。

2)纯化

加99μL平衡到室温且充分混匀的Reagent(1.8倍样本体积)吹吸约10次，震荡混匀，离心2s，室温孵育5min。磁吸3－4min，弃上清。加500μL新鲜配制70％乙醇清洗，磁力架上旋转2周约30s，弃上清。重复一次清洗后室温稍晾干沉淀(约2-3min)，加25μLlowTE洗脱，震荡混匀5s，离心2s，磁吸3min，吸25μL上清至新的PCR管中。

3)连接头

按照表4配备反应体系。配好体系后吹吸混匀，放入PCR仪，反应程序如下：25℃15min，72℃5min。将全部反应液转移到一个1.5ml离心管中，用于纯化。

表4连接头反应体系

4)纯化

加180μL平衡到室温且充分混匀的Reagent(1.8倍样本体积)，吹吸约10次。室温孵育5min，磁吸3－4min，弃上清。加500μL新鲜配制70％乙醇清洗，磁力架上旋转2周约30s，弃上清。重复一次清洗后室温稍晾干沉淀(约2-3min)，加20μLlowTE洗脱，震荡混匀5s，离心2s，磁吸3min，吸20μL上清至新的PCR管中。

5)片段选择

使用琼脂糖凝胶。样本上样量为20μL。Marker上样量为10μL。电泳进行至约13-14min时，Marker的300bp条带在收集孔中，350bp条带在孔的上边缘，此时收集液体，再用10μL水洗收集孔，两次加一起共约25μL。文库插入片段应在100bp-110bp。

6)PCR扩增

室温解冻PCRReactionmix和Primermix，轻轻震荡混匀，瞬时离心。按照表5进行PCR反应。反应程序：95℃变性5min。然后95℃变性15s，58℃退火15s，70℃延伸1min，一共8个循环。

表5反应体系

7)纯化

加195μL平衡到室温且充分混匀的Reagent(1.5倍样本体积)，吹吸约10次，震荡混匀，离心2s，室温孵育5min。磁吸3－4min，弃上清。加500μL新鲜配制70％乙醇清洗，磁力架上旋转2周约30s，弃上清。重复一次清洗。室温稍晾干沉淀(约2-3min)。加20μLlowTE洗脱，震荡混匀离心2s，磁吸3min，吸20μL上清至新的1.5mL离心管中。加30μLReagent，吹吸约10次，震荡混匀，离心2s，室温孵育5min。磁吸3－4min，弃上清。加500μL新鲜配制70％乙醇，磁力架上旋转2周约30s，弃上清。重复步骤。吸尽上清，室温晾干(磁珠量很少，吸尽上清后已经干燥可直接洗脱)。

加20μLlowTE洗脱，震荡混匀，离心2s，磁吸3min，吸20μL上清至新的1.5mL离心管中。Qubit方法检测文库浓度。

8)乳液PCR反应(OneTouch)

根据Qubit检测的文库浓度，稀释文库至2.5pg/μL，用于OneTouch。使用IonPGMTMTemplateOT2200Kit试剂盒对文库DNA进行扩增。运行5.5h。

PGM(IONPGMSEQUENCING200KITV2)测序

程序设定中测序Flow数量选择460Flows，参考基因组选择hg19。Ionxpress选择barcode1，318芯片测序，运行4.5h。

9)数据分析

去除引物及序列比对

去除测序序列中包含的正反向引物序列(CCGACTCGAG)，使用Burrows-WheelerAlignmenttool(BWA)软件比对，将序列定位于人类基因组(hg19)，去除重复比对到多个位置的序列。

检测断点

根据序列比对数目，检测目的染色体断点位置，该位置区域所具有的特征包括：1、两个衍生染色体数据在该位置都有序列；2、每个衍生染色体数据在该区域的序列数目明显高于其他区域。

6.PCR寻找断点位置

1)在预测断点附近设计引物，对相互易位携带者gDNA进行PCR扩增；

根据NGS测序结果预测一实施例(MD14009病例核型46,XX,t(4；9)(q21；q22))4号染色体和9号染色体的断点分别为chr4：84877800bp和chr9：75640500bp，调取预测断点两侧1kb范围内的参考DNA序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，其中，DNA序列调取网址：

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc？hgsid＝438896971_g2x8nfJhRMDeUR9A4FHac 7kUy1AC&o＝17998993&g＝getDna&i＝mixed&c＝chr22&l＝17998993&r＝17999108 &db＝hg19&hgsid＝438896971_g2x8nfJhRMDeUR9A4FHac7kUy1AC。

>hg19_dnarange＝chr4:84877300-84878300bp(5'-3')：

TCTGTGTCTTTTAATTGGAGCATTTAGTCCATTTACATTTAAAGTTAATATTGTTATGTGTGAATCTGATCCTGTCATTATGATGTTAGCTGGTTATTTTGCTCGTTAGTTGATGCAGTTTCTTCCTAGTCTCGATGGTCTTTACATTTTGGCATGATTTTGCAGCGGCTGGTACCAGTTGTTCCTTTCCATGTTTAGTGCTTCCTTCAGGAGCTCTTTTAGGGCAGGCCTGGTGGTGACAAAATCTCTCTTTTATTTGTCCTTCACTTATGAAGCTTAGTTTGGCTGGATATGAAATTTTGGCTTGAAAATTCTTTTCTTTAAGAATGTTGAATATTGGCCCCCACTCTCTTCTGGCTTGTAGAGTTTCTGCCGAGACATCTGCTGTTAGTCTGATGGGCTTCCCTTTGAGGGTAACCCGACCTTTCTCTCTGGCTGCCCTTAACATTTTTTCCTTCATTTCAACTTTGGTGAATCTGACAATTATGTGTCTTGGAGTTGCTCTTCTCGAGGAGTATCTTTGTGGCGTTCTCTGTATTTCCTGAATCTGAATGTTGGGCTGCCTTGCTAGATTGGGGAAGTTCTCCTGGATAATATCCTGCAGAGTGTTTTCCAACTTGGTTCCATTCTCCCCGTCACTTTCAGGTACACAAATCAGACGTAGATTTGGTCTTT AGGCTTTGCTCGTTTCTTTTTATTCTTTTTTCTCTAAACTTCCCTTCTTGCTTCATTTCATTCATTTCATCTTCCATTGCTGATACCCTTTCTTCCAGTTGATGGCATCGGCTCCTGAGGCTTCTGCATTCTTCACGTAGTTCTCAAGCCTTGGTTTTCAGCTCCATCAGCTCCTTTAAGCACTTCTCTGTATTGGTTATTCTAGTTATACATTCTTCTCAATTCTTTTCAAAGTTTTCAACTTCTTTGCCTTTGGTTTGAATGTCCTCCTGTAGCTCGG(SEQIDNo.2)

>hg19_dnarange＝chr9:75640000-75641000bp(5'-3')

CACACATATATCTTGAGTTCTGCATAATAAAAATGATATGAGGATTATAAGGAACTCACAACTTAGTAGTAGAGACAAACAAAAAGGGAAGATTCACACACGTTTTTTCTAAATAAATCAGCCACCCTGTCTCCAGCCAACTGTGGACCTACTGTCAGACCTTAGGATCTTTCAAAACAAGCCGAATTTTATGAGACAATTTCTAATACCAAAATATAGGATATTAATTAAAATGTGTGGGCCAAAACAAAACATGTTTGTTAGCCAGATTTAACGTGCAGCCCATCCTAACATATTTGCAATCAGGAAGACAGCCTTTTCTCTACCTTACCTCTTAAATTAGACAATCTAAGGGGAGAATGCTTTTAGTTTTAACAATTTAGTAGCAAGGGACATTTTAGGAAAGTCTGGTATACTGGTAGGTAGGATCATTCTTATTAGTACGTCTTTACTCATTTATTTATTTAACAAATACAGCCTATACTACCTGGTAGGAACTCAGTATATAATGGTGATCAAATTAGAAACATCGATGTTTTGTTCAGGGAAATTTCATCAGATAGGAAAAGATTTAGGGCCATTACCAATGGAAGGAAGAACTCTAAGAGCTGAAATAAATAACTACTATGTTGGCTGAAACTGCTTTAATATTAATGAGAAAGTTGGGCATAGGGAAGACCATTCCTAGTGAAGCATTTTTCTATCTGTGTGTATTGCCTGGGGTGGGAGGATGGTGAAAATGGCCCTAAAAATACATAATATGGATAGAAAAGAGAGACAATGAATGAATAATAAAATATATCACATTTGTTTCTTGTAGGAAATAGCTGCAAA TTAAACCAGTGGCTTTCAATTTCTCTGGATTATGTCATAGTAAAAAAAATTATTTTCCCTTTCCATAGTGTACACAAGAGCAGACACACACTTAGGTGTATACACACACACTAAAACCAAA(SEQIDNo.3)

利用在线引物设计软件(网址：

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr？hgsid＝438896971_g2x8nfJhRMDeUR9A4FHac7kUy1AC)设计衍生4号染色体跨断点DNA片段PCR引物(der(4))：

MD14009-CHR4-4F:5’-AGCATTTGCTTGTCTGTAAAGTA-3’(chr4:84877550-84877572bp正向引物，SEQIDNo.4)、

MD14009-CHR9-1R:5’-TAAGTTTTCATTTCAAACTGATTC-3’(chr9:75640856-75640879bp反向引物，SEQIDNo.5)；

设计衍生9号染色体跨断点DNA片段PCR引物(der(9))：

MD14009-chr9-1F:5’-CCCGTGAGAATCAGATTTAACA-3’(chr9:75640370-75640391bp正向引物，SEQIDNo.6)、

MD14009-chr4-1R:5’-CCAAGAAATATGGGACTATGTGC-3’(chr4:84877998-84878020反向引物，SEQIDNo.7)。

2)PCR反应体系和反应程序

PCR反应体系如表6所示

表6PCR反应体系

反应程序：95℃变性5min。然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。最后72℃延伸5min，16℃保存。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，见图4a和4c，观察到携带者gDNA特异的der(4)跨断点约670bp条带和der(9)跨断点约290bp条带，正常对照gDNA均为阴性。

3)PCR产物应用双脱氧单链终止法(Sanger测序法)测序验证断点确切位置，测序结果利用在线比对软件与参考DNA序列比对分析(网址：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？hgsid＝427694565_AH8tf38aSdoTtDrjCRULAoCdUsgz&command＝start)，结果如图5示，4号染色体精确断点位置为chr4:84877905-84877912bp，且中间缺失6bpDNA序列。9号染色体精确断点位置为chr9:75640555-75640556bp。4号和9号染色体断点处存GTT和GAT微小同源序列。4号染色体参考序列(斜体DNA序列)、衍生4号染色体跨断点序列(图4b)、衍生9号染色体跨断点序列(图4d)和9号染色体参考DNA序列(下划线DNA序列)如下(断点处上、下游25bp序列)：

chr4:GCTGCCTTGCTAGATTGGGGAAGTTGATAATATCCTGCAGAGTGTTTTCCAACTTG(SEQIDNo.8)

der(4):GCTGCCTTGCTAGATTGGGGAAGTTTTGTTCAGGGAAATTTCATCAGATA(SEQIDNo.9)

der(9):TGGTGATCAAATTAGAAACATCGATAATATCCTGCAGAGTGTTTTCCAACTTG(SEQIDNo.10)

chr9:TGGTGATCAAATTAGAAACATCGATGTTTTGTTCAGGGAAATTTCATCAGATA(SEQIDNo.11)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，制作细胞周期处于有丝分裂中期的细胞样本；

步骤S2，收集所述细胞样本，进行染色体显带操作，选取条带清晰的样本；

步骤S3，在所述样本上找到相互易位的染色体，切割下易位染色体断点附近的染色质，并对切割下的染色质进行扩增处理；

步骤S4，对扩增处理后的染色质进行NGS测序分析，并将测序结果比对至人类基因组上，获得相互易位染色体的断点位置。

2.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述细胞样本为外周血细胞样本。

3.如权利要求2所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：将肝素抗凝外周血接种至含PHA的RPMI1640培养基中，37℃恒温箱培养72小时后加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷，继续培养17小时后加入胸腺嘧啶核苷，再在5小时后加入秋水仙素，再在2小时后收集得到所述细胞样本。

4.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

步骤S21，向所述细胞样本中加入低渗液进行低渗处理；

步骤S22，向低渗处理后的所述细胞样本中加入固定液进行固定处理，并制备固定后的细胞悬液；

步骤S23，对所述细胞悬液进行滴片处理，制得细胞滴片；

步骤S24，对所述细胞滴片进行染色处理；

步骤S25，染色处理后，进行镜检，选取中期染色体形态分散良好、条带清晰的样本。

5.如权利要求4所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在步骤S21中，所述低渗液是浓度为0.075M的KCl溶液；

在步骤S22中，所述固定液是体积比为3:1的甲醇与乙酸的混合液体，所述细胞悬液是按照0.5mL外周血培养收获的细胞制备2mL细胞悬液的标准制备；在所述步骤S23中，在滴片过程中，保持60-100cm的高度进行滴片，每张盖玻片中部滴一滴所述细胞悬液；

在所述步骤S24中，在进行染色之前还包括对细胞滴片进行老化处理，并将老化处理后的细胞滴片置于胰蛋白酶溶液中消化处理的步骤，再对消化处理后得到的细胞滴片进行所述染色处理，其中，染色处理使用的染色液为Giemsa染色液。

6.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在所述步骤S3中，收集的易位染色体断点附近的染色质拷贝数量为6-8个；

所述步骤S3包括如下步骤：

步骤S31，将样本置于显微镜下找到相互易位的染色体，并切割下易位染色体断点附近的染色质；

步骤S32，将切割下的染色质转移入含有UN1引物的收集液中，进行预扩增处理，所述UN1引物的序列如SEQIDNo.1所示；

步骤S33，对将预扩增处理得到溶液置于含有UN1引物的扩增液中，进行PCR扩增处理。

7.如权利要求6所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在所述步骤S32中，所述收集液包括如下体积份数的各组分：1μL的5×TOPO缓冲液、0.5μL的2mMdNTP、0.1μL的UN1引物、3.5μL的dH₂O以及0.1μL的拓扑异构酶I；

在所述步骤S32中，预扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、30℃1-5min、37℃3min循环4-15次，其中，每个循环在30℃处理时均需向反应体系中加入0.2μL的T7DNA测序酶；

在所述步骤S33中，所述扩增液包括如下体积分数的各组分：5μL的10×PCR缓冲液、5μL的2mMdNTP、1μL的UN1引物、40μL的dH₂O以及2.5U的TaqDNA多聚酶；

在所述步骤S33中，所述PCR扩增的条件为：先94℃处理5min，然后按照94℃1min、56℃1min、72℃1.5min循环30次，再72℃5min，最后于16℃保存。

8.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在所述步骤S3之后，所述步骤S4之前，还包括对扩增产物进行PCR荧光标记，并在有丝分裂中期核分裂相中进行FISH，以验证显微切割是否成功的步骤。

9.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在所述步骤S4中，包括构建测序文库、对构建的测序文库进行NGS测序以及对测序结果进行数据分析的步骤。

10.如权利要求1所述的相互易位染色体的断点分析方法，其特征在于，在所述步骤S4之后还包括：

在获得的断点位置附近设计引物，对样本的gDNA进行PCR扩增；

对PCR产物进行Sanger测序验证，获取确切的断点位置。