CN104212888B - 标记棉花A genome和A sub-genome染色体端部的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种特异性标记棉花A？genome和A？sub-genome染色体端部的方法。用来源于海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆350B21，在不同棉种的有丝分裂中期染色体上进行BAC-FISH，发现在A？genome和A？sub-genome所有染色体的端部有较强烈杂交信号，而在D？genome和D？sub-genome所有染色体上杂交信号不明显。利用本发明的BAC克隆采用BAC-FISH方法，可快速有效标记棉花A？genome和A？sub-genome染色体端部。

Description

标记棉花A genome和A sub-genome染色体端部的方法
技术领域
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种标记棉花Agenome和Asub-genome染色体端部的方法。
背景技术
棉花是世界上重要的纤维经济作物,也是研究细胞遗传学、植物多倍体化、基因组结构和基因组进化的模式植物。棉属由8个二倍体基因组(A-K)和1个四倍体基因组(AD)组成。其中A基因组和D基因组大约分化于6.7百万年以前，经过了大约5百万年的各自独立的进化，在大约1-2百万年前的一次多倍体化事件中，形成了现存的5个异源四倍体棉种。
荧光原位杂交技术的发展标志着细胞遗传学从经典细胞遗传学时代进入现代分子细胞遗传学时代。该技术是通过用荧光染料染色后的探针DNA片段，根据碱基互补配对原则与靶DNA进行杂交，从而获得探针序列在靶DNA上的具体物理位置。靶DNA可以是有丝分裂间期染色质、有丝分裂中期染色体、减数分裂粗线期染色体、细胞核和DNA纤维等。不同的靶DNA决定了试验分别率的不同，其中DNA纤维的分辨率最高，可达到1Kb左右。
目前，在棉花领域的研究中，大部分试验是以棉花有丝分裂中期染色体为靶DNA。试验中探针DNA片段的长短也是试验成功与否的主要因素，如果探针片段过短，便会遇到不易与靶染色体结合、信号检出率低等问题。BAC-FISH是采用植物基因组大片段BAC(Bacterialartificialchromosome)克隆为探针的FISH技术。由于BAC克隆的片段大都在100Kb左右，从而解决了上述难题。目前，荧光原位杂交技术广泛应用在基因物理定位、染色体识别、物理图谱的构建、亲缘关系研究和转基因检测等方面，在现代分子细胞遗传学领域有着举足轻重的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性标记棉花Agenome和Asub-genome染色体端部的方法。
根据本发明的方法包括使用来自海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆350B21进行细菌人工染色体荧光原位杂交的步骤。
根据本发明的方法，所述BAC克隆350B21由SSR引物CIR096筛选海岛棉pima-90BAC(王文生，2006)文库所得。SSR引物CIR096的序列信息为(www.cottonmarker.org)：
ForwardPrimer:CCCATCACCGTATCTTTC
ReversePrimer:CAGAGCCAAATATGAGATC
该引物可在棉花基因组中扩增出长度约为330bp的片段，序列信息为：TACCCATCACCGTATCTTTCAGTTAAAAATAGTAAACAGACAGTCCTGCACAATCAGCATACTGCTATAACCAGCATCATAATCACGAACAATCATCTAAAGATACAAACAGCACCGACAGCAACAACATCAACATCAACATCAACACCATGTCCATTTGCCCAAGTCATTCTTTCCCGAACATTGCTATAAAACCCAAGAGATGGTTTAAGATGAATCAGCCTTCTTAGAAAATAAACCATAAAACACACACACACACACGCATGCACACTGCCCCTTGCATAATTAGAAAGACAAATATAAAGCAAAATCAGAGCCAAATATGAGATC(www.cottonmarker.org)
用引物CIR096扩增BAC克隆350B21可获得长度大约为330pb的目的片段。
利用BAC克隆350B21做探针，在不同棉种的有丝分裂中期染色体上进行BAC-FISH，结果表明：
在以5个四倍体棉种有丝分裂中期染色体为靶染色体的试验中，Asub-genome染色体的端部均有明显杂交信号，而Dsub-genome染色体上无明显杂交信号。
在以2个A组棉种有丝分裂中期染色体为靶染色体的试验中，所有染色体端部均有明显杂交信号。
在以2个D组棉种有丝分裂中期染色体为靶染色体的试验中，几乎所有染色体上无明显杂交信号。
根据本发明的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤：
1)取材及预处理：取种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理1.7h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95％乙醇：冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；
2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用4％纤维素酶+2％果胶酶混合液处理根尖40min；
3)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；
4)标记探针：探针的标记采用Bio-NickTranslationMix系统标记，首先提取特异BAC克隆(350B21)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH2O中，配成16μL，再加入4μLBio-NickTranslationMix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。
5)进行荧光原位杂交。
6)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。BAC-FISH技术是一种很好的研究染色体结构和染色体之间进化亲缘关系的方法。本发明提供的标记棉花Agenome和Asub-genome染色体端部的方法，对研究棉花种内或种间的分化以及棉花基因组进化具有重要作用，同时对于棉花的遗传进化研究和棉花育种也具有重要意义。
附图说明
图1以BAC克隆350B21为探针(绿色)，分别在陆地棉(A)、海岛棉(B)、毛棉(C)、黄褐棉(D)、达尔文氏棉(E)、亚洲棉(F)、草棉(G)、雷蒙德氏棉(H)和瑟伯氏棉(I)的有丝分裂中期染色体上进行荧光原位杂交。染色体显示为蓝色，350B21为绿色信号。Bar＝5μm
照片上可明显看出，5个四倍体棉的52条染色体中，其中26条较长染色体(Asub-genome)端部都有黄绿色信号，剩余的较短的26条染色体(Dsub-genome)上几乎无信号。草棉和亚洲棉(A组棉种)的26条染色体端部均有黄绿色信号。雷蒙德氏棉和瑟伯氏棉(D组棉种)的26条染色体上几乎检测不到信号。
具体实施方式
实施例1以BAC克隆350B21为探针，分别荧光原位杂交陆地棉((AD)1)、草棉(A1)、雷蒙德氏棉(D5)有丝分裂中期染色体。
1材料和方法
1.1实验材料
实验材料是陆地棉中棉所12、红星草棉和雷蒙德氏棉(野生棉)。所用的BAC文库为海岛棉Pima90-53BAC文库(王文生，2006)，由河北农业大学作物种质资源重点实验室马峙英教授惠赠。实验试剂：纤维素酶OnazukaR-10和果胶酶PectolyaseY-23购自Solarbio公司，生物素探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。
1.2实验方法
1)采用三步PCR法进行BAC文库的筛选(石雪萍等，2010)，即用SSR引物CIR096依次对板池(1个384板所有的单克隆混合)、行池(1个384板中1行24个单克隆混合)和1行24个单克隆层层进行菌液PCR扩增，所有扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后得到阳性单克隆350B21。
2)取材及预处理：取三个棉种的种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理1.7h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95％乙醇：冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；
3)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用4％纤维素酶+2％果胶酶混合液处理根尖40min；
4)制片：酶解好的根尖用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用；
5)标记探针：探针的标记采用Bio-NickTranslationMix系统标记。首先提取特异BAC克隆(350B21)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH2O中，配成16μL，再加入4μLBio-NickTranslationMix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。
6)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法。生物素标记的探针在荧光显微镜下观察显示绿色。染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。
7)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。
2实验结果
实验结果显示，陆地棉((AD)1)52条染色体可清晰的分辨出来，其中26条较长染色体(Asub-genome)的端部可检测到绿色荧光信号，而其他26条较短染色体(Dsub-genome)上几乎没有检测到信号(图1(A))，草棉(A1)的26条染色体端部均可检测到绿色信号(图1(G))，雷蒙德氏棉(D5)的26条染色体几乎检测不到信号(图1(H))。

Claims (1)

1.一种特异性标记棉花Agenome和Asub-genome染色体端部的方法，其特征在于，所述方法包括使用来自海岛棉pima-90BAC文库的BAC克隆350B21进行细菌人工染色体荧光原位杂交的步骤，所述BAC克隆350B21，由序列如下所示的SSR引物CIR096筛选海岛棉pima-90BAC文库所得，
SSR引物CIR096的序列：
ForwardPrimer:CCCATCACCGTATCTTTC
ReversePrimer:CAGAGCCAAATATGAGATC。
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