CN104962660B - 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。引物及探针序列：5’‑ggttgaacagtctaccctcc‑3’（上游）；5’‑gctaacatactactacgcaaaa‑3’（下游）：5’‑tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt‑3’（探针）。采用杂色蛤物种特异性检测引物与探针进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，实时荧光PCR扩增后会产生一条特异性扩增曲线，从而将杂色蛤成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物、探针设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过荧光PCR分析，即可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。

Description

一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。
背景技术
杂色蛤是贝壳类海产品，隶属帘蛤科，学名菲律宾蛤仔，南方俗称花蛤，辽宁称蚬子，山东称蛤蜊。杂色蛤广泛分布在我国南北海区，它生长迅速，养殖周期短，适应性强（广温、广盐、广分布），离水存活时间长，是一种适合于人工高密度养殖的优良贝类，是我国主要海产经济贝类之一。通过形态学特征进行判断是对杂色蛤识别的传统方法，但是这些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。
快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。杂色蛤与其它近源物种的序列相似度在85-94%之间，而CoxⅠ基因序列有较大差异，目前，贝类动物的分子检测主要集中于这一序列。采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技术。实时荧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技术之一，指在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，研究利用实时荧光PCR对杂色蛤进行物种识别对杂色蛤的物种保护及系统发育研究等领域均具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种杂色蛤物种特异性检测体系及该特异性检测体系的应用方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分杂色蛤的基因与其它贝类动物基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：包括引物与探针的序列是：
上游引物：5’-ggttgaacagtctaccctcc-3’；
下游引物：5’-gctaacatactactacgcaaaa-3’；
探针：5’-tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3’。
进一步地，所述探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
进一步地，所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
进一步地，所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2：
表2杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
一种根据所述的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，其特征在于：利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测。
进一步地，所述杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，以Hotstart TaqDNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异性检测探针位置时，以HotstartTaq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断杂色蛤物种特异性检测探针的淬灭基团，使杂色蛤物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
本发明特异性引物设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用本方法检测杂色蛤动物成分结果显示，采用杂色蛤物种特异性检测引物与探针进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时荧光PCR分析，即可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
附图说明
图1为5种引物PCR结果图，图中：M、DL2000marker；1、P1P2引物扩增结果，2、P3P4引物扩增结果，3、P5P6引物扩增结果，4、P7P8引物扩增结果，5、P9P10引物扩增结果，6、阴性对照，7、空白对照。
图2为杂色蛤实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、杂色蛤，2、杂色蛤，3、阴性对照，4、空白对照。
图3 为杂色蛤与其他海洋动物的实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、杂色蛤，2、杂色蛤，3、杂色蛤，4、夏夷扇贝，5、紫海胆，6、太平洋牡蛎，7、魁蚶，8、阴性对照，9、空白对照。
图4为灵敏度分析结果图，图中：1、5 ng/μL扩增结果；2、1ng/μL扩增结果；3、0.5ng/μL扩增结果；4、0.1ng/μL扩增结果；5、0.05 ng/μL扩增结果；6、阴性对照；7、空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
本实施例中所利用的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系包括引物与探针的序列是：
5’-ggttgaacagtctaccctcc-3’（上游）；
5’-gctaacatactactacgcaaaa-3’（下游）；
5’-tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3’（探针）。
所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表3：
表3杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4：
表4杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
一种所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测，具体步骤如下：
1.杂色蛤物种特异性检测引物合成：在宝生物公司合成杂色蛤物种特异性检测引物5对，其序列（见表5）：
表5. PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因的引物序列：
琼脂糖凝胶电泳检测：以P1P2，P3P4、 P5P6、 P7P8 、P9P10等5对特异性引物PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因后，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示（如图1所示），经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生182bp、178bp、180bp、212bp、269bp大小的特异性电泳条带。以P1P2作为上下游引物进行特异性PCR扩增，电泳效果最好，PCR扩增效率最高，因此选取P1P2作为扩增体系的特异性扩增引物（如图1所示）。
2. 杂色蛤物种特异性检测探针合成：在宝生物公司合成杂色蛤物种特异性检测探针，其序列是：
5’-tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3’。
3.杂色蛤DNA的提取：采用DNA提取试剂盒（购于宝生物公司）提取杂色蛤模板DNA，用微量分光光度计检测提取杂色蛤模板DNA的浓度为100ng。
4.实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因：配制杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的25μL PCR反应体系（如上表3），设置杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数（如上表4）。
采用杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因时，以Hotstart Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异性检测探针位置时，以Hotstart Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断杂色蛤物种特异性检测探针的淬灭基团，使杂色蛤物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线（如图2所示）。
利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系进行杂色蛤的物种成分实时荧光PCR特异性检测杂色蛤、夏夷扇贝、紫海胆、太平洋牡蛎、魁蚶等样品，采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为100ng，分别按照上述步骤4中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的特异性扩增曲线即为杂色蛤，此方法可以准确的对杂色蛤的成分进行鉴定，具有很好的特异性（如图3所示）。
采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成5 ng/μL、1 ng/μL 、0.5 ng/μL 、0.1 ng/μL 、0.05ng/μL 5个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图4所示，所产生特异性扩增曲线即为杂色蛤，当DNA浓度≥0.1ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.1ng/μL。此方法可以准确的对杂色蛤的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 淑艳, 刘
超, 万
晓飞, 孙
健, 丁
<120> 一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用
<130> 20150715
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据序列特异性而设计，作为杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测的上游引物
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> (1)..(20)
<400> 1
ggttgaacag tctaccctcc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据序列特异性而设计，作为杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测的下游引物
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> (1)..(22)
<400> 2
gctaacatac tactacgcaa aa 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据序列特异性而设计，作为杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测的探针
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> (1)..(30)
<400> 3
tctcttcacg taggtggtgt ctcttcaatt 30

Claims (5)

1.一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：包括引物与探针的序列是：
上游引物：5’-ggttgaacagtctaccctcc-3’；
下游引物：5’-gctaacatactactacgcaaaa-3’；
探针：5’-tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3’；
所述探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
。
3.根据权利要求1至2任一所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2：
表2杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
。
4.一种根据权利要求1至2任一所述的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，其特征在于：利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测。
5.根据权利要求4所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，其特征在于：所述杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，以Hotstart Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异性检测探针位置时，以Hotstart Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断杂色蛤物种特异性检测探针的淬灭基团，使杂色蛤物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
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中国帘蛤目16 种经济贝类DNA 条形码及分子系统发育的研究;王琳楠等;《大连海洋大学学报》;20131031;第28卷(第5期);摘要、432、435页 *
基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究;程汉良等;《生态学报》;20130531;第33卷(第9期);第2744-2754页 *
烟台威海沿海菲律宾蛤仔线粒体遗传多样性分析;毕晓欣等;《安徽农业科学》;20121231;第40卷(第2期);第673-674页 *

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