CN109439767A - 一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光pcr引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光pcr引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组、试剂盒及方法。本发明可以通过1管PCR反应同时检测两个指标(大西洋鲑鱼和虹鳟鱼)，操作方便，缩短了检测时间，降低了检测成本。本发明为加强三文鱼水产品市场监管力度，打击三文鱼水产品中的掺杂使假行为，保障消费者的合法权益，提供了有力的技术支撑。

Description

一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物 组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种同时鉴别三文鱼水产品中大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法，可以用于三文鱼水产品的真实性鉴定。
背景技术
作为世界著名的高值经济鱼类之一，三文鱼肉质鲜嫩，鱼肉中富含ω-3不饱和脂肪酸，营养丰富，是深受中国老百姓喜爱的一种水产品。“三文鱼”一词是由英文“salmon”音译而成，指的是一种商品名称。在世界范围内，三文鱼包括大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、银鲑、帝王鲑等品种。在中国市场上，三文鱼的主要品种是大西洋鲑鱼和虹鳟。从分类学上讲，大西洋鲑鱼和虹鳟都属于鲑形目鲑科鱼中的鲑亚科。在属水平上，大西洋鲑鱼为鲑属，虹鳟鱼为大马哈鱼属。
大西洋鲑鱼和虹鳟鱼属于冷水性鱼类。大西洋鲑鱼原产于北大西洋海域，生活在低温海水中，目前已在挪威、智利、加拿大、法罗群岛等地大规模养殖。虹鳟鱼原产于北美洲和太平洋西岸，主要生活在低温淡水中，在我国养殖较为广泛。由于生存条件的差异，大西洋鲑鱼和虹鳟鱼可能会感染不同的寄生虫。大西洋鲑鱼容易受异尖线虫的感染，而虹鳟鱼容易受一些淡水寄生虫的感染。食用大西洋鲑鱼和虹鳟鱼，给消费者造成的食品安全风险不同。
经过加工的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼鱼肉在外观上极为相似，消费者无法用肉眼直接判断。同时，大西洋鲑鱼的价格比虹鳟鱼价格高一半左右，这给不法商贩带来了可乘之机。很多三文鱼水产品不标识品种和产地，或者用低价的虹鳟鱼来冒充价格较高的大西洋鲑鱼。这种掺杂使假行为不仅侵犯了消费者的知情权和经济利益，而且给消费者带来了严重的不可控的食品安全风险。
目前鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的检测技术主要有实时荧光PCR方法和依赖于测序或者生物传感器的普通PCR方法。现有实时荧光PCR方法一次只能检测一个物种，比较麻烦；普通PCR方法检测周期长，费时费力。这些问题给三文鱼水产品市场监管带来了较大困扰。因此，亟需开发一种可以同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的简单快速的检测方法。
发明内容
本发明提供一种用于同时鉴别三文鱼水产品中大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法，应用该方法可以通过1管PCR反应即可确定待检三文鱼为大西洋鲑鱼或者虹鳟鱼。
本发明的目的在于提供一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组。
本发明的另一目的在于提供一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组，其核苷酸序列如下所示：
F1：5’-agcagaactc agccagcct-3’(SEQ ID NO：1)，
R1：5’-aaaggaggga gggagaagtc aa-3’(SEQ ID NO：2)，
F2：5’-accattatta acataaaacc tccag-3’(SEQ ID NO：4)，
R2：5’-gtaatgcctg ctgccagga-3’(SEQ ID NO：5)。
一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，该试剂盒还含有检测探针，其序列如下所示：
P1：5’-ccttctggga gatgacc-3’(SEQ ID NO：3)；
P2：5’-cgtttgagcc gtgcta-3’(SEQ ID NO：6)。
进一步的，所述检测探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团，不同探针之间所标记的荧光基团不同。
进一步的，所述荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，所述淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以DNA为模板，上述所述F1和R1、F2和R2为引物，上述所述P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
3)结果分析：通过荧光扩增曲线和Ct值判定结果。
进一步的，步骤2)中双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。
进一步的，步骤2)中双重实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
进一步的，步骤3)中结果分析的具体情况为：若引物F1、R1与探针P1能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定大西洋鲑鱼阳性；若引物F2、R2与探针P2能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定虹鳟鱼阳性。
进一步的，上述结果分析的具体情况存在以下4种：
若F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；同时，F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阴性；
若F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；同时F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阳性；
若F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；同时，F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阳性；
若F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；同时，F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阴性。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种三文鱼水产品中同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法，与现有技术相比，本发明可以通过1管PCR反应同时检测两个指标(大西洋鲑鱼和虹鳟鱼)，操作方便，缩短了检测时间，降低了检测成本。本发明为加强三文鱼水产品市场监管力度，打击三文鱼水产品中的掺杂使假行为，保障消费者的合法权益，提供了有力的技术支撑。
附图说明
图1大西洋鲑鱼DNA和虹鳟鱼DNA在双重实时荧光PCR鉴别体系中的扩增曲线图谱；图A表示实验组1，图B表示实验组2，图C表示实验组3，图D表示实验组4；图中细实线表示大西洋鲑鱼的扩增曲线，圆点线表示虹鳟的扩增曲线，粗实线表示阈值线。
图2双重实时荧光PCR体系中引物特异性的验证；图A表示实验组1，图B表示实验组2，图C表示实验组3，图D表示实验组4，图E表示实验组5，图F表示实验组6；图中细实线表示大西洋鲑鱼的扩增曲线，圆点线表示虹鳟的扩增曲线，粗实线表示阈值线。
图3本专利所述双重实时荧光PCR方法的灵敏性验证：图A表示实验组1，图B表示实验组2；图中细实线表示大西洋鲑鱼的扩增曲线，圆点线表示虹鳟的扩增曲线，粗实线表示阈值线。
图4市售三文鱼水产品的双重实时荧光PCR扩增曲线图谱，图中细实线表示大西洋鲑鱼的扩增曲线，圆点线表示虹鳟的扩增曲线，粗实线表示阈值线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组和探针
本发明引物组可以对大西洋鲑鱼和虹鳟鱼进行同时检测，本发明引物组包括F1和R1、F2和R2，其碱基序列如下所示。
F1：5’-agcagaactc agccagcct-3’(SEQ ID NO：1)，
R1：5’-aaaggaggga gggagaagtc aa-3’(SEQ ID NO：2)，
P1：5’-ccttctggga gatgacc-3’(SEQ ID NO：3)；
F2：5’-accattatta acataaaacc tccag-3’(SEQ ID NO：4)，
R2：5’-gtaatgcctg ctgccagga-3’(SEQ ID NO：5)，
P2：5’-cgtttgagcc gtgcta-3’(SEQ ID NO：6)；
上述F1和R1为大西洋鲑鱼特异性引物，P1为大西洋鲑鱼特异性探针。P1的5’端荧光基团FAM修饰，P1的3’端被非荧光淬灭基团MGB修饰。F2和R2为虹鳟鱼特异性引物，P2为虹鳟鱼特异性探针。P2的5’端被荧光基团VIC修饰，P2的3’端被非荧光淬灭基团MGB修饰。
实施例2一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法
本实施例设置四个实验组。向实验组1的管中加入50ng大西洋鲑鱼DNA，向实验组2的管中加入50ng虹鳟鱼的DNA，向实验组3的管中加入25ng大西洋鲑鱼的DNA和25ng虹鳟鱼的DNA，向实验组4中加入ddH2O作为阴性对照。
1)提取样本DNA；用无菌剪刀称取样品置于2mL无菌离心管中，采用商业化动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用核酸蛋白分析仪对提取的DNA进行浓度测定。
2)以DNA为模板，以上述F1和R1、F2和R2为引物、P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
其中，双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。其中，2×Premix Ex Taq为Takara公司产品，货号为RR390A。
其中，双重实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
3)结果判定：反应结束后，根据Ct值对结果进行判定(有扩增曲线且Ct值＜30判为阳性)，即若引物F1、R1与探针P1能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定大西洋鲑鱼阳性；若引物F2、R2与探针P2能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定虹鳟鱼阳性。具体分为以下4种情况：
若大西洋鲑鱼有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30(即F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30)；同时，虹鳟鱼Ct值≥30(即F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30)；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阴性；
若虹鳟鱼有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30(即F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30)；同时，大西洋鲑鱼Ct值≥30(即F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30)；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阳性；
若大西洋鲑鱼有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30(即F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30)；虹鳟鱼有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30(即F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30)；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阳性；
若大西洋鲑鱼Ct值≥30；同时(即F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30)，虹鳟鱼Ct值≥30(即F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30)；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阴性。
本实施例各实验组的实时荧光PCR扩增图谱如图1所示。实验组1的鉴定结果为大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阴性；实验组2的鉴定结果为大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阳性；实验组3的鉴定结果为大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阳性；实验组4的鉴定结果为大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阴性。
该实施例说明，本发明所提供的方法可以准确地鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼。
实施例3特异性检测
本实施例采用中国三文鱼市场中比较常见的王鲑(Oncorhynchus.Tshawytscha)和银鲑(Oncorhynchus.Kisutch)的DNA，对引物的特异性进行验证。设置六个实验组。向实验组1的管中加入50ng王鲑DNA，向实验组2的管中加入50ng银鲑的DNA，向实验组3的管中加入25ng大西洋鲑鱼的DNA和25ng王鲑的DNA，向实验组4的管中加入25ng虹鳟的DNA和25ng王鲑的DNA，向实验组5的管中加入大西洋鲑鱼的DNA和25ng银鲑的DNA，向实验组6的管中加入虹鳟的DNA和25ng银鲑的DNA。
1)提取样本DNA：用无菌剪刀称取样品置于2mL无菌离心管中，采用商业化动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用核酸蛋白分析仪对提取的DNA进行浓度测定。
2)以DNA为模板，以上述F1和R1、F2和R2为引物、P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
其中，双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。其中，2×Premix Ex Taq为Takara公司产品，货号为RR390A。
其中，双重实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
3)结果判定：同实施例2。
各实验组的实时荧光PCR扩增图谱如图2所示。实验组1和实验组2的鉴定结果为大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阴性，说明本发明反应体系的引物对大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的特异性良好；实验组3和实验组5的鉴定结果为大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阴性，说明银鲑DNA和王鲑DNA不会影响本发明方法对大西洋鲑鱼的检测结果；实验组4和实验组6的鉴定结果为大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阳性，说明银鲑DNA和王鲑DNA不会影响本发明方法对虹鳟鱼的检出结果。
该实施例说明本发明引物及检测方法具有很好的特异性，不会受到王鲑、银鲑等品种的影响。
实施例4灵敏性检测
本实施例采用大西洋鲑鱼DNA和虹鳟DNA确定本专利所述双重实时荧光PCR方法的灵敏性，设置2个实验组。向实验组1中加入0.5ng大西洋鲑鱼DNA和500ng虹鳟DNA，实验组1中大西洋鲑鱼DNA的质量分数为0.1％；向实验组2中加入0.5ng虹鳟DNA和500ng大西洋鲑鱼DNA，实验组2中虹鳟的质量分数为0.1％。
1)提取样本DNA；用无菌剪刀称取样品置于2mL无菌离心管中，采用商业化动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用核酸蛋白分析仪对提取的DNA进行浓度测定。
2)以DNA为模板，以上述F1和R1、F2和R2为引物、P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
其中，双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。其中，2×Premix Ex Taq为Takara公司产品，货号为RR390A。
其中，双重实时荧光PCR反应程序：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
3)结果判定：同实施例2。
各实验组的实时荧光PCR图谱如图3所示。实验组1的检测结果为大西洋鲑鱼阳性，说明本专利所述方法可以检测到质量分数为0.1％的大西洋鲑鱼；实验组2的检出结果为虹鳟阳性，说明本专利所述方法可以检测到质量分数为0.1％的虹鳟鱼。
该实施例说明，本专利所述方法对大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的灵敏性均可以达到0.1％。
实施例5本发明双重实时荧光PCR方法对市售三文鱼水产品进行检测
从市场上随机购买10份具有物种标识或产地标识的三文鱼水产品，采用本发明中提供的检测方法，对这些三文鱼水产品进行检测：
(1)三文鱼DNA的提取：用无菌剪刀称取约200mg三文鱼肉置于2mL无菌离心管中，采用商业化动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用核酸蛋白分析仪对提取的DNA进行浓度测定。
(2)以DNA为模板，以上述F1和R1、F2和R2为引物、P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
其中，双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。其中，2×Premix Ex Taq为Takara公司产品，货号为RR390A。
其中，双重实时荧光PCR反应程序：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
其中，双重实时荧光PCR反应程序：
3)结果判定：同实施例2。
10份三文鱼样品的实时荧光PCR扩增图谱如图4所示。每份样品的鉴定结果如表1所示。同时，采用细胞色素氧化酶I亚基(COI)引物对这10份样品的COI序列进行扩增，扩增产物经测序比对，比对结果与表1中的鉴定结果一致。
表1本发明对市售三文鱼水产品的检测结果
上述结果说明本发明可以通过1管PCR反应同时检测两个指标(大西洋鲑鱼和虹鳟鱼)，操作方便，缩短了检测时间，降低了检测成本。本发明对大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的鉴定具有很好的检测效果，检测效率高，灵敏度高，特异性好。本发明为加强三文鱼水产品市场监管力度，打击三文鱼水产品中的掺杂使假行为，保障消费者的合法权益，提供了有力的技术支撑。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省食品检验所(广东省酒类检测中心)
<120> 一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组、试剂盒及方
法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcagaactc agccagcct 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaggaggga gggagaagtc aa 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccttctggga gatgacc 17
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accattatta acataaaacc tccag 25
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtaatgcctg ctgccagga 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtttgagcc gtgcta 16

Claims (10)

1.一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR引物组，其核苷酸序列如下所示：
F1：5’-agcagaactc agccagcct-3’(SEQ ID NO：1)，
R1：5’-aaaggaggga gggagaagtc aa-3’(SEQ ID NO：2)，
F2：5’-accattatta acataaaacc tccag-3’(SEQ ID NO：4)，
R2：5’-gtaatgcctg ctgccagga-3’(SEQ ID NO：5)。
2.一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有检测探针，其序列如下所示：
P1：5’-ccttctggga gatgacc-3’(SEQ ID NO：3)；
P2：5’-cgtttgagcc gtgcta-3’(SEQ ID NO：6)。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述检测探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团，不同探针之间所标记的荧光基团不同。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，所述淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。
6.一种同时鉴别大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的双重实时荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以DNA为模板，权利要求1所述F1和R1、F2和R2为引物，权利要求3所述P1和P2为探针，进行双重实时荧光PCR扩增；
3)结果分析：通过荧光扩增曲线和Ct值判定结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中双重实时荧光PCR扩增体系为：2×Premix Ex Taq 12.5μL，F1终浓度为0.1μM,R1终浓度为0.2μM，P1终浓度为0.14μM，F2终浓度为0.2μM，R2为终浓度0.3μM，P2终浓度为0.13μM，模板DNA加入量为25-100ng，补充ddH2O至25μL体系。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中双重实时荧光PCR扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性10s，63℃退火和延伸20s，40个循环。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3)中结果分析的具体情况为：
若引物F1、R1与探针P1能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定大西洋鲑鱼阳性；若引物F2、R2与探针P2能够扩增出对数扩增曲线，且Ct值＜30，则判定虹鳟鱼阳性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：结果分析的具体情况存在以下4种：
若F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；同时，F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阴性；
若F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；同时F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阳性；
若F1、R1和P1有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；同时，F2、R2和P2有荧光对数扩增曲线，且Ct值＜30；则样本中大西洋鲑鱼阳性，虹鳟鱼阳性；
若F1、R1和P1无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；同时，F2、R2和P2无扩增曲线或扩增曲线的Ct值≥30；则样本中大西洋鲑鱼阴性，虹鳟鱼阴性。
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