CN103122386B - 一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，步骤如下：一、鱼肉DNA的提取，二、PCR扩增，三、酶切及电泳检测，四、鉴定；通过上述四个步骤即可准确的测定大西洋鲑鱼。本发明具有操作简单，快速准确、价格低廉和对仪器设备要求低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，属生物分子检测领域，主要用于大西洋鲑鱼的真伪鉴别。
背景技术
大西洋鲑鱼通常称作挪威三文鱼，因在我国市场上销售的大西洋鲑鱼主要从挪威等国家进口，大西洋鲑鱼相比其它三文鱼品质好、价格较高。三文鱼不是鱼类分类名称，而是某些鲑科鱼类或鲑鳟鱼类的商品名，通常是指一种生长在加拿大、挪威、日本和美国等高纬度地区的冷水鱼类，常见的三文鱼有大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)、红鲑(Oncorhynchus nerka)和大西洋鲑(Salmo salar)。
近几年，三文鱼的贸易规模增长迅猛，贸易量由1976年21.02万吨上升到2009年399.70万吨，年均增长13.66％，目前，市场上供应的三文鱼主要是野生捕捞和人工养殖两大类。人工养殖品种主要是大西洋鲑、虹鳟和银鲑，占世界三文鱼养殖总产量的95％左右，其中，人工养殖的大西洋鲑鱼对水质要求严格，通过注射疫苗减少抗生素的用量，比其他的三文鱼更适合生吃。因此，在中国大西洋鲑鱼最受欢迎，超市销售的大西洋鲑鱼制品有冷冻大西洋鲑鱼片、大西洋鲑鱼刺身和大西洋鲑鱼寿司等。但是，近年来我国的一些不法商家为了牟取暴利，以一些太平洋鲑鱼冒充大西洋鲑鱼出售，尤其是在虹鳟鱼上市前，饲喂含有虾红素的饲料以增加虹鳟鱼肉的颜色来冒充大西洋鲑鱼，严重地损害了消费者的利益，一些违法添加的染色剂也给消费者的身体健康带来了风险。由于太平洋鲑鱼与染色的虹鳟鱼肉相似，消费者难以通过感官进行鉴别。因此，急需一种大西洋鲑鱼快速、准确的鉴定方法为相关部门提供技术支撑。
现有的鉴别大西洋鲑鱼的标记技术有扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphis，AFLP)、微卫星(Simple Sequence Repeats，SSR)和DNA条形码(DNA barcoding)等。相比而言，DNA条形码鉴别技术比其他鉴定技术更具优势，但强烈依赖测序技术，在国内，需要送到专门的测序公司，价格昂贵而且耗费时间。因此，市场急需一种操作简单，快速准确、价格低廉和对仪器设备要求低的大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，但现有技术中未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种操作简单，快速准确、价格低廉和对仪器设备要求低的大西洋鲑鱼的分子鉴别方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是：一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，步骤如下：
一、鱼肉DNA提取：称取鱼肉于灭菌离心管中，加入TE抽提液，用消毒后的小剪刀将鱼肉组织剪碎，然后，加入10％SDS至终浓度为1.9～2.1％，20mg/ml蛋白酶K至终浓度为400μg/L，充分混匀，将离心管置于55～65℃的恒温水浴槽中，直至混合液消化至澄清为止；取出消化好的样品，加入6M饱和的NaCl溶液300μL，高速涡旋30s，12000r/min离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其混合比例为25∶24∶1，缓慢震荡1min，12000r/min离心10min；取上清液至新的离心管中，重复上一步骤1～2次，然后取上清液至新的离心管中，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，12000r/min离心10min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干，然后加入100μLTE或dH2O，于-20℃保存；
二、PCR扩增：DNA模板100～500ng，含Mg2+10×缓冲液5μL，2.5mol/L dNTPs4μL，25μmol/L SWF1和25μmol/L SWR1各0.6μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，加去离子水至50μL；PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃30s，46℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
三、酶切及电泳检测：酶切采用20μL的体系，取PCR产物10μL，10×缓冲液2μL，限制性内切酶HindIII或Msc I1～2μL，加去离子水补齐至20μL，然后置于金属浴37℃酶切3～5h，酶切反应完以后，取5μL PCR产物与1μL预染液混合，预染2～3min，于1.5～2％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照分析电泳结果；
四、鉴定：限制性内切酶Msc I和HindIII对5种三文鱼COI扩增片段的酶切分析，即可对大西洋鲑鱼及其制品的进行鉴别。
进一步的，所述步骤一中的TE抽提液含有1％CTAB、0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA。
进一步的，所述步骤二中所使用的引物SWF1和SWR1，引物序列如下：
SWF1：CACCCTCTATTTAGTATTTGG，SWR1：TATCCCGACAGTGAACAT，扩增片段长度为844bp。
进一步的，所述步骤三中的预染液为6×Loading buffer(上样缓冲液)：Genefinder核酸染料＝9∶1混合。
进一步的，所述步骤四中的酶切分析：大西洋鲑鱼提取DNA经PCR扩增后的产物可被限制性内切酶Msc I切成660bp和184bp大小的两个片段，但不可以被限制性内切酶HindIII切开。
本发明的有益效果在于：本发明基于三文鱼DNA条形码通用引物设计的基础上，通过对多种三文鱼测序、序列比对和酶切位点分析，找到了大西洋鲑鱼的特异性酶切位点，建立了一种大西洋鲑鱼及其制品的分子鉴别方法，操作简单，快速准确、价格低廉、对仪器设备要求低。
附图说明
下面结合附图对本发明的技术方案进行说明。
图1是本发明限制性内切酶Msc I和HindIII对5种三文鱼COI扩增片段的酶切分析示意图。
具体实施方式
一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，步骤如下：
一、鱼肉DNA提取：
用电子天平称取100mg鱼肉于1.5mL灭菌的离心管中，加入400μL的TE抽提液，所述TE抽提液含有1％CTAB、0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA，用70％酒精消毒的剪刀将鱼肉组织剪碎，然后，加入40μL10％SDS至终浓度1.9～2.1％，加入8μL20mg/ml蛋白酶K至终浓度约为400μg/L，上下震荡，充分混匀，将离心管置于55～65℃的恒温水浴槽中，直至混合液消化至澄清为止；取出消化好的样品，加入300μL6M饱和的NaCl溶液，高速涡旋30s，12000r/min离心30min，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其混合比例为25∶24∶1，上下震荡至乳白色，缓慢震荡1min，12000r/min离心10min；取上清液至新的1.5ml离心管中，重复上一步骤1～2次，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，12000r/min离心10min，弃去上清液，每管加入700μL70％乙醇，上下震荡数次，12000r/min离心10min，可重复数次，弃去乙醇，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干，然后加入100μLTE或dH2O，于-20℃保存；
二、PCR扩增：
引物设计见表1，其稀释后的终浓度均为25μmol/L，-20℃冰箱保存备用；DNA模板100～500ng，含Mg2+10×PCR缓冲液5μL，2.5mol/L dNTPs4μL，25μmol/L SWF1和25μmol/L SWR1各0.6μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，加去离子水至50μL；PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃30s，46℃40s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
表1 PCR扩增引物设计
注：扩增片段大小为844bp
三、酶切及电泳检测：
酶切采用20μL的体系，取PCR产物10μL，10×缓冲液2μL，限制性内切酶HindIII或Msc I1～2μL，加去离子水补齐至20μL，然后置于金属浴37℃酶切3～5h，酶切反应完以后，取5μL PCR产物与1μL预染液混合，其中预染液为Loading Buffer和GeneFinder的混合物，混合比例＝9∶1，预染2～3min，于1.5～2％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照分析电泳结果；
四、鉴定：
如图1所示的限制性内切酶Msc I和HindIII对5种三文鱼COI扩增片段的酶切分析中，M代表DL2000Maker；DG，HZ，HG，DM和YG分别代表大西洋鲑(挪威三文鱼)、虹鳟、红鲑、大马哈鱼和银鲑样品；1表示阳性对照，未加限制性内切酶，2表示加入相应限制性内切酶；MscI，HindIII表示2种不同的限制性内切酶；由图1可知，5种三文鱼经限制性内切酶Msc I酶切后，大西洋鲑(挪威三文鱼)会产生184bp和660bp两个DNA片段，而虹鳟、红鲑、大马哈鱼和银鲑酶切不会产生任何DNA条带；相反，5种三文鱼鱼类经限制性内切酶HindIII酶切后，虹鳟、红鲑、大马哈鱼和银鲑会产生244bp和600bp两个DNA片段，而大西洋鲑不会产生任何条带，联合使用限制性内切酶Msc I和HindIII，即可对大西洋鲑鱼及其制品的进行鉴别。
表2 5种三文鱼经Msc I和Hind III酶切的电泳图谱
注：844bp表示限制性内切酶无法对COI扩增片段酶切，数字相加表示COI扩增片段经限制性内切酶酶切后片段的大小。
本发明的实施例所表述的，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，其特征在于，步骤如下 ：
一、鱼肉 DNA 提取 ：称取鱼肉于灭菌离心管中，加入 TE 抽提液，用消毒后的小剪刀将鱼肉组织剪碎，然后，加入 10％ SDS 至终浓度为 1.9 ～ 2.1％，20mg/ml 蛋白酶 K 至终浓度为400μg/L，充分混匀，将离心管置于 55 ～ 65℃的恒温水浴槽中，直至混合液消化至澄清为止 ；取出消化好的样品，加入 6M 饱和的 NaCl 溶液 300μg，高速涡旋 30s，12000r/min 离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其混合比例为25 ∶ 24 ∶ 1，缓慢震荡 1min，12000r/min 离心 10min ；取上清液至新的离心管中，重复上一步骤1～2次，然后取上清液至新的离心管中，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，12000r/min 离心 10min，弃去上清液，在 50℃烘箱中烘干，然后加入 100μgTE或 dH2O，于 -20℃保存 ；
二、PCR 扩增 ：DNA 模板 100 ～ 500ng，含 Mg2+10× 缓冲液 5μL，2.5mol/L dNTPs4μL，25μmol/L SWF1 和 25μmol/L SWR1 各 0.6μL，5U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 0.3μL，加去离子水至 50μL ；PCR 扩增反应程序为 ：94℃ 2min ；94℃ 30s，46℃ 40s，72℃ 1min，30 个循环 ；72℃ 10min ；
三、酶切及电泳检测 ：酶切采用 20μL 的体系，取 PCR 产物 10μL，10× 缓冲液 2μL，限制性内切酶 HindIII 或 Msc I1 ～ 2μL，加去离子水补齐至 20μL，然后置于金属浴 37℃酶切3～5h，酶切反应完以后，取5μL PCR产物与1μL预染液混合，预染2～3min，于1.5～2％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V 条件下电泳 30min，然后，采用凝胶成像系统拍照分析电泳结果 ；
四、鉴定 ：限制性内切酶 Msc I 和 HindIII 对 5 种三文鱼 COI 扩增片段的酶切分析，即可对大西洋鲑鱼及其制品进行鉴别；
所述步骤二中所使用的引物 SWF1 和 SWR1，引物序列如下 ：
SWF1 ：CACCCTCTATTTAGTATTTGG，SWR1 ：TATCCCGACAGTGAACAT，扩增片段长度为 844bp；
所述步骤四中的酶切分析 ：大西洋鲑鱼提取 DNA 经 PCR 扩增后的产物可被限制性内切酶 Msc I 切成 669bp和 175bp 大小的两个片段，但不可以被限制性内切酶 HindIII 切开；
所述5种三文鱼为大马哈鱼 (Oncorhynchus keta)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)、红鲑(Oncorhynchus nerka)和大西洋鲑 (Salmo salar)。
2.根据权利要求 1 所述的大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，其特征在于 ：所述步骤一中的TE 抽提液含有 1％ CTAB、0.05mol/LpH8.0 的 Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的 EDTA。
3.根据权利要求 1 所述的大西洋鲑鱼的分子鉴别方法，其特征在于 ：所述步骤三中的预染液为 6×Loading buffer ：Genefinder 核酸染料＝ 9 ∶ 1 混合。
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