CN105985948A - 一种高效安全提取动物肌肉组织dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简便、安全、快速提取动物肌肉组织DNA的方法，它是将猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉等，清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入液氮，迅速研磨，直至粉末状，取100mg放入2mL离心管，通过SDS裂解、异丙醇沉淀、吸附柱纯化提取得到DNA，可直接用于PCR扩增。本发明采用的DNA提取方法，2小时内即可完成样品DNA提取的全过程。所提取的DNA质量标准满足了后续PCR扩增的要求，同时避免了传统SDS法或异硫酸氰胍法提取过程中各种有机试剂对实验人员的危害，而且时间上也得到了很大的提升，更适合于动物源性成分鉴定过程中高效快速提取样品DNA的目的，具有高效、快速、低成本、操作简便、无毒安全等优势。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，是一种高效、快速、低成本、操作简便、无毒安全的动物肌肉组织DNA提取方法。
背景技术
近年来，随着疯牛病、羊瘙痒病、口蹄疫、禽流感等一些疾病在欧洲及世界各国的流行，以及一些动物源食品掺假造假现象的普遍产生，对食品、药品，以及饲料产品成分进行动物源性鉴定，已经成为一个备受关注的问题。随着生物技术的发展，以DNA为基础的PCR技术广泛被用来鉴定食品中的动物源性，由于PCR方法比较简便，特异性和灵敏度都很高，国内外已经运用该技术和其他技术结合建立了多种鉴定食品动物源性成分的方法.如常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、定量竞争PCR、RAPD-PCR和AFLP-PCR等，而高质量、高纯度的基因组DNA的获得则是开展该方面研究工作的前提。长期以来，动物肌肉组织样本中DNA的提取一直是耗时、繁琐的过程，消解过程长达数小时甚至过夜，严重减慢了检测速度，同时在提取过程中还反复使用多种有机溶剂，对实验人员的健康造成损伤。因此，许多学者一直在探索动物肌肉组织DNA的高效安全提取方法。
目前国内外研究发现并使用的动物肌肉组织DNA提取方法有很多，其中使用最频繁主要为传统SDS-蛋白酶K消化法、异硫氰酸胍法、CTAB法、试剂盒方法，以及一些以SDS-蛋白酶K消化法为基础的改良方法。
(1)传统SDS-蛋白酶K消化法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破碎细胞，酚/氯仿等有机溶剂抽提蛋白变性，能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的动物材料中提取DNA，获得的DNA纯度高，含量多。但比较费时，往往消化过程需要数小时甚至过夜，且蛋白酶K的消化成本过高，流程繁琐，操作复杂。而且提取过程中使用了大量的有机溶剂，有损实验人员的健康。
(2)异硫氰酸胍法靠异硫氰酸胍主要试剂破坏细胞结构，使核酸从核蛋白中解离出来，起到解偶剂的作用，裂解液经酚氯仿抽提，异丙醇沉淀后获得DNA，操作相对简单、快速虽可以得到较纯的DNA，但仍不可避免酚氯仿等有机溶剂对实验人员的损伤。
(3)CTAB法是通过一种阳离子去污剂(十六烷基三甲基溴化铵)，溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/LNaCl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
为方便研究者提出更高质量的DNA，国内外很多试剂公司依据各种方法的原理和试剂特性，开发出便于提取DNA的试剂盒。硅胶柱型试剂盒是目前较常用的提取试剂盒，本发明将SDS(十二烷基硫酸钠)与吸附性硅胶柱相结合，既达到了有效的细胞裂解，又通过硅胶柱实现了安全无污染的分离纯化，同时操作简单、快速、且成本低廉，有效地避免使用酚氯仿等有机溶剂，对操作人员没有损害。
发明内容
本发明的目的在于克服传统样本DNA提取步骤多、复杂、费时以及大量使用有机溶剂对实验人员造成损伤等缺点，公开了一种高效安全提取动物肌肉组织DNA的方法。本发明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、操作简便、无毒安全等优势。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种高效安全提取动物肌肉组织DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
本发明所述的待测样本为植物样品为动物肌肉组织样品包括猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉等各类动物样品。
本发明所述的SDS裂解液浓度为10％，加入量为500μL；恒温水浴温度为65℃，时间为1h。本发明所述的与水相结合的异丙醇体积为吸取水相体积的0.8倍。
为了能更加清楚的说明本发明的提取方法，下面以羊肉为样本实例，对本发明的提取方法与传统的SDS-蛋白酶K消化法分别加以比较对照说明。
一、材料和方法
(1)样品：生鲜羊肉，由农贸市场购置。
(2)主要仪器：高速冷冻离心机，实时荧光定量PCR扩增仪，恒温水浴锅。
(3)主要试剂：
PCR引物、探针由上海生工公司合成，引物序列见表1。
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂购自TaKaRa公司。
异丙醇购自天津化学试剂三厂公司。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液：1000mL水中溶解CTAB20g，Tris 12.11g，NaCl 81.82g，Na2EDTA 7.44g，高压灭菌。
SDS-蛋白酶K消化液：10mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；25mmol/L EDTA(pH8.0)；5g/L SDS；0.1g/L蛋白酶K。
表1 羊源性成分鉴定定量PCR引物序列
二、生鲜羊肉DNA的两种提取方法的比较
1、SDS-蛋白酶K消化法提取DNA
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和20μL蛋白酶K，混匀，55℃水浴消化数小时至过夜，期间不停颠倒混匀，直至溶液透明；
(3)将消化后的组织裂解液加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀，12000rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管，重复1次；
(4)加入0.5倍体积的Tris饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇(24:1)，缓慢颠倒混匀，12000rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管；
(5)加入0.1倍体积的乙酸钠溶液和2.5倍体积4℃预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色DNA絮状沉淀析出，-20℃沉淀2h；
(6)12000rpm/min离心5min，加入500μL70％乙醇洗涤沉淀；
(7)室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入100μLTE缓冲液溶解DNA沉淀。
2、本发明方法提取DNA
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
三、两种方法提取DNA的实时荧光PCR扩增检测试验：
1、PCR反应体系组成：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，供试生鲜羊肉基因组DNA模板，浓度50ng/μL，2μL，双蒸水补足20μL；
2、PCR反应程序：
95℃预变性15min；45个扩增循环(95℃，20sec；62℃，30sec)；
3、PCR扩增结果：
对两种方法提取的DNA，分别进行羊源性成分鉴定引物OA-PRLP、AF041979的实时荧光PCR扩增，结果见附图1，2。结果显示，两种方法提取DNA的扩增结果是基本一致的。
本发明与传统技术相比具有的积极效果在于：
(1)传统DNA提取操作步骤多、复杂、费时。需要经过裂解、抽提等多个步骤，同时需要在多个离心管之间相互转移样本，增加了对样本间交叉污染的可能性。另外，氯仿等有机溶剂对人体有害。而本发明的DNA提取方法过程简便，同时无需使用有毒有机溶剂，对人体和环境都不会造成危害。
(2)本方法最大的优点在于其过程快速，简便，安全无毒，充分提高了动物源性成分鉴定的检测效率。与传统的提取过程需要数小时至过夜相比，采用本方法，2小时就可以完成样本DNA提取的全过程。
(3)采用本发明的快速提取样本DNA的方法所得到的DNA经实时荧光PCR检测实验，证实与传统方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代复杂、费时的传统SDS法，从而大大节省了时间。
附图说明:
图1为羊源性成分鉴定引物OA-PRLP的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜羊肉(传统SDS法)；生鲜羊肉(本发明方法)；对照样本；
图2为羊源性成分鉴定引物AF041979的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜羊肉(传统SDS法)；生鲜羊肉(本发明方法)；对照样本；
图3为牛源性成分鉴定引物Rd1的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜牛肉(传统SDS法)；生鲜牛肉(本发明方法)；；
图4为猪源性成分鉴定引物Sus-ACTB的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜猪肉(传统SDS法)；生鲜猪肉(本发明方法)；对照样本；
图5为鸡源性成分鉴定引物Chick的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜鸡肉(传统SDS法)；生鲜鸡肉(本发明方法)；对照样本；
图6为羊源性成分鉴定引物Duck的实时荧光PCR扩增图谱；如图标注分别为生鲜鸭肉(传统SDS法)；生鲜鸭肉(本发明方法)；对照样本。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
以生鲜牛肉为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
实时荧光PCR检测：
1、对牛源性成分鉴定引物Rd1进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
Rd1-F：5'-GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG-3'
Rd1-R：5'-GGCCAGACTGGGCACATG-3'
Rd1-P：5'-ROX-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-3'
2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，供试生鲜牛肉基因组DNA模板，浓度50ng/μL，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性15min；45个扩增循环(95℃，20sec；62℃，30sec)；
4、结果：生鲜牛肉实时荧光PCR扩增结果见图3。
实施例2
以生鲜猪肉为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
实时荧光PCR检测：
1、对猪源性成分鉴定引物Sus-ACTB进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
Sus-ACTB-F：5'-GGAGTGTGTATCCCGTAGGTG-3'
Sus-ACTB-R：5'-CTGGGGACATGCAGAGAGTG-3'
Sus-ACTB-P：5'-JOE-TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG-BHQ1-3'
2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，供试生鲜猪肉基因组DNA模板，浓度50ng/μL，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性15min；45个扩增循环(95℃，20sec；62℃，30sec)；
4、结果：生鲜猪肉实时荧光PCR扩增结果见图4。
实施例3
以生鲜鸡肉为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
实时荧光PCR检测：
1、对鸡源性成分鉴定引物Chiken进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
Chiken-F：5'-CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT-3'
Chiken-R：5'-GTCATAGCGGAACCGTGGATA-3'
Chiken-P：5'-FAM-CTATGAATCCGGGCCTC-TAMRA-3'
2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，供试生鲜鸡肉基因组DNA模板，浓度50ng/μL，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性15min；45个扩增循环(95℃，20sec；62℃，30sec)；
4、结果：生鲜鸡肉实时荧光PCR扩增结果见图5。
实施例4
以生鲜鸭肉为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
实时荧光PCR检测：
1、对鸭源性成分鉴定引物Duck进行实时荧光PCR扩增，引物序列为：
Duck-F：5'-AAGCCTTCCTCTAGCTCAGC-3'
Duck-R：5'-AGAAAATGCTTTAGTTAAGTC-3'
Duck-P：5'-FAM-CTCAGCCGCTTAAACAACGC-TAMRA-3'
2、反应体系：
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游和下游引物10μmol/L各1μL，探针10μmol/L，0.4μL，供试生鲜鸭肉基因组DNA模板，浓度50ng/μL，2μL，双蒸水补足20μL。
3、反应程序：
95℃预变性15min；45个扩增循环(95℃，20sec；62℃，30sec)；
4、结果：生鲜鸭肉实时荧光PCR扩增结果见图6。扩增结果。
Claims (4)
1.一种高效安全提取动物肌肉组织DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2mL灭菌离心管中；
(2)加入500μL SDS裂解液和6μL蛋白酶K，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；
(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；
(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为DNA。
2.如权利要求1所述的提取方法，其中所述的待测样本为动物肌肉组织样品包括猪肉、羊肉、牛肉和鸡肉等各类动物样品。
3.如权利要求1所述的提取方法，其中所述的SDS裂解液浓度为10％，加入量为500μL；恒温水浴温度为65℃，时间为1h。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的与水相结合的异丙醇体积为吸取水相体积的0.8倍。
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