CN101368179B - 一种扬子鳄卵壳膜中提取dna的试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，包括以下试剂：试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、试剂F，及其试剂盒的使用方法，本试剂盒提取的模板DNA纯度好，可用于基因扩增测序和分型，在对12SrRNA基因、线粒体D-loop区、Cytb基因的扩增中，所有提取的壳膜DNA模板均能成功的扩增，得到与预期大小相同的片段产物，且浓度大，特异性强。在利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增获得了分型数据，用于扬子鳄亲子鉴定。另外本方法还可以应用于其他卵生动物如龟鳖类，鸟类等DNA的提取。所得的模板DNA可广泛应用于卵生动物的种群遗传分析、分子进化、个体间亲缘关系进化等领域的各项研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒及使用方法。
背景技术
扬子鳄(Alligator sinensis)属爬行纲、鳄目、鼍科、鼍属，因起源于距今两亿多年与恐龙同时代的中生代，而被称为“活化石”，是世界上现有23种鳄中最濒临灭绝的物种之一，被国际自然和自然资源保护联盟(IUCN)列为极危级，CITES附录I物种，属于国家一级保护野生动物。目前扬子鳄的野生种群数量约为120-140条，并仍以每年4％-6％的速率下降，濒于灭绝，急需人工恢复其基因流。扬子鳄饲养种群在某些方面存在近亲衰退的现象(吴孝兵等，1999)，导致血缘关系混乱，谱系不清，因此进行扬子鳄的分子生态学研究，最大限度保持遗传多样性，对该物种的保护具有重要意义。
目前，分子生态学在保护生物学及繁殖生态学中得到广泛的应用，进行分子生态学研究的首要工作是分析样品的采集。常用的取样方法有3种，即伤害性取样(destructive sampling)、非伤害性取样(nondestructive sampling)、非损伤性取样(noninvasive sampling)。伤害性取样就是通过杀死动物而获得新鲜肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种取样方法对非珍稀动物来言是可行的，但对珍稀濒危动物而言既不科学也不可行。非伤害性取样是通过对捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或趾等分析样品。该方法不致于导致动物死亡，但对珍稀濒危动物的生理、习性均造成伤害。非损伤性取样法，即在不捕获、触及、甚至未亲眼见到动物的情况下，收集不同形式的样品获取样品中的DNA。样品包括脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、含口腔脱落细胞的食物残渣、鹿角、鱼鳞等。由于非损伤性取样的广泛性、随机性和便利性，使其在物种鉴别、个体识别(亲子鉴定)、性别鉴定、种群遗传结构分析等方面得到广泛的应用。
目前大多数DNA的提取方法对样品材料的要求较严格，需要足够的样本量，而不利于某些特殊领域的研究，例如珍稀濒危野生动物的DNA分析，物种鉴定等领域。现有方法中，多利用生产试剂盒进行提取，这些试剂盒虽然能快速提取，但一般只适用于血液或其他组织材料，不适用于非损伤性材料DNA提取。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通用性好、可靠性高的从扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒及使用方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，包括以下试剂：
(a)试剂A：为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；
(b)试剂B：为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，
所述的磷酸盐缓冲液(B1)：含有137±5mM NaCl；2.7±0.5mM KCl；10±5mM Na2HPO4；2±0.5mM KH2PO4；
所述的STE缓冲液(B2)：含有1±0.5M Tris-HCl pH 8.0、0.5±0.1M EDTA、5±1M NaCl；
(c)试剂C：裂解液1，含有50±10mM Tris-HCl pH 8.0、1±0.5mM EDTA pH8.0、150±10mM NaCl、1±0.5mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度是(w/v)为20±10％十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20±5mg/ml蛋白酶K；
(d)试剂D：裂解液2，含有20±10mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2±0.1％β-巯基乙醇；
(e)试剂E：提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25∶24∶1；
(f)试剂F：提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24∶1。
优选的试剂盒为：
(a)试剂A：为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；
(b)试剂B：为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，
所述的磷酸盐缓冲液(B1)：含有137mM NaCl；2.7mM KCl；10±mM Na2HPO4；2mM KH2PO4；
所述的STE缓冲液(B2)：含有1M Tris-HCl pH 8.0、0.5M EDTA、5M NaCl；
(c)试剂C：裂解液1，含有50mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA pH 8.0、150mM NaCl、1mol/L二硫苏糖醇(DTT)、浓度(w/v)为20％十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K；
(d)试剂D：裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2％β-巯基乙醇；
(e)试剂E：提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25∶24∶1；
(f)试剂F：提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24∶1。
所述的试剂盒的使用方法为：
(1)样品保存：在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-20℃-70℃)，避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；
(2)样品预处理：从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10-20分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；
(3)第一次裂解：取浸泡洗涤后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55℃水浴振摇，消化12-24h；
(4)第二次裂解：将第一次裂解后的液体加入30μl的试剂D，继续消化6-8小时；
(5)第一次提取：将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；
(6)第二次提取：将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取数次，至中央无蛋白层为止。
(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2-3倍体积的冰冻无水乙醇，-10--20℃保存6小时，离心，所得沉淀用70％乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4℃保存备用。
在非损伤性取样中，卵壳膜是一种理想的分析样品：1、在野外，动物繁殖孵化期后，留在窝中的残留卵壳，样品充足，易于采集；2、卵壳膜样本在不接触甚至看不到动物的情况下获得，对动物的干扰和伤害小，同时在研究大型濒危野生动物时也保护了采样人的人身安全；3、在对濒危动物野生种群的个体数量、性别比例以及某些大型动物的个体活动范围等进行研究时，较捕获动物本身而言，采集卵壳膜可以降低采样的花费。
本试剂盒提取的模板DNA纯度好，可用于基因扩增测序和分型，在对12SrRNA基因、线粒体D-loop区、Cytb基因的扩增中，所有提取的壳膜DNA模板均能成功的扩增，得到与预期大小相同的片段产物，且浓度大，特异性强。在利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增获得了分型数据，用于扬子鳄亲子鉴定。另外本方法还可以应用于其他卵生动物如龟鳖类，鸟类等DNA的提取。所得的模板DNA可广泛应用于卵生动物的种群遗传分析、分子进化、个体间亲缘关系进化等领域的各项研究。
附图说明
图1为实施例1的1％琼脂糖凝胶电泳示意图。
图2为实施例2在12S rRNA基因扩增的电泳示意图。
图3为实施例2在Cytb基因扩增的电泳示意图。
图4为实施例2在线粒体D-loop区扩增的电泳示意图。
图5为实施例2微卫星Asiμ20位点的基因分型结果图。
图6为实施例2微卫星Asiμ8位点的基因分型结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
实施例1：
本实施例所用的试剂盒的试剂按下列配方进行配制：
(a)试剂A：为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；
(b)试剂B：为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，
所述的磷酸盐缓冲液(B1)：含有137mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na2HPO4；2mM KH2PO4；
所述的STE缓冲液(B2)：含有1M Tris-HCl pH 8.0、0.5M EDTA、5M NaCl；
(c)试剂C：裂解液1，含有50mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA pH 8.0、150mM NaCl、1mol/L二硫苏糖醇(DTT)、质量浓度为20％十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K；
(d)试剂D：裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2％β-巯基乙醇；
(e)试剂E：提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25∶24∶1；
(f)试剂F：提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24∶1。
按以下步骤提取扬子鳄卵壳膜DNA：
(1)样品保存：在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-20℃)避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；
(2)样品预处理：从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；
(3)第一次裂解：取浸泡洗涤后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55℃水浴振摇，消化12h；
(4)第二次裂解：将第一次裂解后的液体加入30μl的试剂D，继续消化6小时；
(5)第一次提取：将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；
(6)第二次提取：将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取2次，至中央无蛋白层为止。
(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，-20℃保存6小时，离心，所得沉淀用70％乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4℃保存备用。
将实施例取得的DNA模板进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1所示。
实施例2：
本实施例所用的试剂盒的试剂按下列配方进行配制：
(a)试剂A：为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；
(b)试剂B：为预处理液，包括磷酸盐缓冲液(B1)及STE缓冲液(B2)，
所述的磷酸盐缓冲液(B1)：含有135mM NaCl；3.0mM KCl；10mM Na2HPO4；1.5mM KH2PO4；
所述的STE缓冲液(B2)：含有1.5M Tris-HCl pH 8.0、0.5M EDTA、6M NaCl；
(c)试剂C：裂解液1，含有50mM Tris-HCl pH 8.0、0.5mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl、1mol/L mM二硫苏糖醇(DTT)、浓度(w/v)为10％十二烷基苯磺酸钠(SDS)、20mg/ml蛋白酶K；
(d)试剂D：裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为1％β-巯基乙醇；
(e)试剂E：提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25∶24∶1；
(f)试剂F：提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24∶1。
按以下步骤提取扬子鳄卵壳膜DNA：
(1)样品保存：在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存(-10℃)避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；
(2)样品预处理：从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10分钟，去除含保存液的杂质。接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；
(3)第一次裂解：取浸泡洗涤后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55℃水浴振摇，消化24h；
(4)第二次裂解：将第一次裂解后的液体加入20μl的试剂D，继续消化8小时；
(5)第一次提取：将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；
(6)第二次提取：将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取2次，至中央无蛋白层为止。
(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，-20℃保存8小时，离心，所得沉淀用70％乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4℃保存备用。
将实施例2在12S rRNA基因、、Cytb基因、线粒体D-loop区PCR扩增：
PCR反应体系为25μl，包括10×buffer 3μl，MgCl2(25mmol/L)2μl、dNTP(25mmol/L)1μl、上下游引物(10pmol/L)各1μl，DNA模板1μl(20-50ng)、Taq DNA聚合酶1U，加适量ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 45s，53℃-55℃退火温度40s，72℃ 40s，30个循环；最后72℃延伸10min。12S rRNA基因、、Cytb基因、线粒体D-loop区扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2、3、4所示。
将实施例2在微卫星荧光标记引物扩增：
PCR反应体系为25μl，包括10×buffer 3μl，MgCl2(25mmol/L)2μL、dNTP(25mmol/L)1μl、上下游引物(10pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl(20-50ng)、Taq DNA聚合酶1U，加适量ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃ 45s，适宜退火温度40s，72℃ 40s，30个循环；最后72℃延伸10min。微卫星标记引物如表1所示。
PCR产物应用ABI377自动测序仪全基因组扫描，做STR分型，当扩增产物在测序仪中电泳时，数据采集软件会自动收集电泳中扩增产物所带的荧光信号，将信号直接转换成GeneScan中的电泳图，应用Genotyper 2.1软件对基因型进行判读。如图5、图6所示。
表1 扬子鳄5个微卫星座位的特征
| 基因座 | 重复类型 | 扩增片段(bp) | 退火温度(℃) |
| Amiμ8 | (AC)<sub>33</sub> | 159-171 | 56℃ |
| Amiμ18 | (AC)<sub>35</sub> | 172-213 | 60℃ |
| Amiμ224 | (AC)<sub>10</sub> | 186-209 | 59℃ |
| Asiμ1 | (TG)<sub>32</sub> | 315-344 | 63℃ |
| Asiμ20 | (TG)<sub>22</sub> | 213-227 | 64℃ |
Claims (2)
1.一种扬子鳄卵壳膜中提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒为：
(a)试剂A：为保存液，含生理盐水、100mmoL/L葡萄糖、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；
(b)试剂B：为预处理液，包括磷酸盐缓冲液B1及STE缓冲液B2，
所述的磷酸盐缓冲液B1：含有137mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na2HPO4；2mM KH2PO4；
所述的STE缓冲液B2：含有1M Tris-HCl pH 8.0、0.5M EDTA、5M NaCl；
(c)试剂C：裂解液1，含有50mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA pH 8.0、150mM NaCl、1mol/L二硫苏糖醇DTT、浓度w/v为20％十二烷基苯磺酸钠SDS、20mg/ml蛋白酶K；
(d)试剂D：裂解液2，含有20mg/ml蛋白酶K和质量浓度为0.2％β-巯基乙醇；
(e)试剂E：提取液1，含有饱和平衡酚、氯仿、异戊醇，其体积比为25∶24∶1；
(f)试剂F：提取液2，含有氯仿、异戊醇，其体积比为24∶1。
2.用权利要求1所述的试剂盒从扬子鳄卵壳膜中提取DNA的方法为：
(1)样品保存：在野外，采集不同窝卵已孵化后的残留卵壳，编号标记，放入含有保存液A的无菌离心管中，低温冷冻保存-20℃－-70℃，避免其他杂质细菌的干扰，防止取样材料的降解；
(2)样品预处理：从卵壳中剥离出卵壳膜，放进含有试剂B1中的无菌离心管中浸泡10-20分钟，去除含保存液的杂质,接着，对含有卵壳膜的样品用试剂B2进行洗涤，轻轻漂洗，防止抗凝，软化壳膜的作用，最后，室温干燥；
(3)第一次裂解：取浸泡洗涤后2-4mm2的卵壳膜，加入0.7ml试剂C，混匀，于55℃水浴振摇，消化12-24h；
(4)第二次裂解：将第一次裂解后的液体加入30μl的试剂D，继续消化6-8小时
(5)第一次提取：将第二次裂解后的液体离心取上清，在上述溶液中加入等量的试剂E，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取一次；
(6)第二次提取：将第一次提取后的提取液离心，取上清后，加入等量的试剂F，缓慢颠转，温和混匀两相，直至成乳浊液；离心取上清液后，同法再提取数次，至中央无蛋白层为止；
(7)将第二次提取后的提取液离心，取上清后，加入2-3倍体积的冰冻无水乙醇，-10--20℃保存6小时，离心，所得沉淀用70％乙醇洗涤两次后，在超净台风干，溶于适量双蒸水或TE缓冲液中，即可获得DNA样品，于4℃保存备用。
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