CN106011276B - 用于鉴定天台蛙的物种特异性pcr鉴定引物和方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)的物种特异性PCR鉴定引物和方法及应用，其中，所述物种特异性PCR鉴定引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。本发明通过从天台蛙组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明提供的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为天台蛙，通过这种方式，避免了传统DNA测序及序列比对的繁琐，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为天台蛙，进一步达到了检测时间短，检测效率高，兼具简便性及经济性的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物物种的检测领域，具体地，涉及用于鉴定天台蛙的物种特异性PCR鉴定引物和方法及应用。
背景技术
天台蛙(Glandirana tientaiensis)是中国特产的两栖动物，分类地位上隶属两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、腺蛙属(Glandirana)。该物种的模式产地在浙江省天台县，因此得名。天台蛙的形态特征为无背侧褶，吻端有一明显的浅色纵纹，体背黑褐色，背腹面均粗糙，密被小疣粒。指基下瘤清晰，有外褶突。雄性具内声囊。其一般生活于山区溪流附近，平时多藏匿于溪边石缝或草丛中，较难发现，晚上则活动频繁，傍晚6时许起至晚上9时许左右为其活动高峰期。活跃于溪边石块上或草丛中觅食，水中活动较少，阴雨天也不例外，且活动时常常成群出现。目前已知，天台蛙的分布地其仅限于浙江和安徽的局部山地，主要栖息于山区的溪流附近，数量稀少。伴随着人类活动加剧所带来的栖息地逐渐斑块化及丧失，加之分布区域狭小，天台蛙物种数量呈现出急剧下滑趋势。IUCN红色物种名录已将天台蛙列为“近危级”(Near Threatened,NT)物种。因此，尽快开展针对天台蛙这一我国特有物种的相关生物学研究及保护工作具有重要意义。
物种鉴定是人类认识自然界的第一步。正确认识和区分物种是生物资源的可持续性开发利用的基本理论基础，特别是那些具有重要经济、科研以及生态意义的物种，分类鉴定工作显得尤为重要。从目前的分类学现状来看，动物物种鉴定一般从以下两个方面来入手，一方面是传统分类方法，从形态学特征，尤其是成体形态入手；另一个方面是利用生物大分子的序列信息。具体到天台蛙物种，由于其变态发育的特点，在野外科考工作中经常会遇到一些蝌蚪、卵带及具尾幼体等未成年个体，这些未成年个体与成体在形态学方面差异巨大，极难辨识。与此同时，在天台蛙的自然栖息地内还生活着其它两栖动物及未成年个体，如虎纹蛙(Hoplobatrachus tigerinus)、凹耳蛙(Odorrana tormota)、黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)等。这些动物的幼体(变态发育期)存在着广泛的生态位重叠现象。形态学上基本都是通体黑色个体，能游泳的幼体，辨识难度极大。这种情况使得我们亟需找到一种能快速、准确地实现对天台蛙幼体及成体的物种鉴别方法，以期能为天台蛙的繁殖生物学、迁地保护等濒危动物保护工作带来便利。
因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，仅需一次PCR扩增及一次琼脂糖凝胶电泳检测，即可快速、高效地对天台蛙物种进行准确鉴定，兼具简便性及经济性的用于鉴定天台蛙的物种特异性PCR鉴定引物和方法是本发明亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中通过形态学鉴定天台蛙不仅容易受到其他物种的干扰，大大降低鉴定的准确度，而通过常规DNA测序则不仅费时费力，且鉴定成本大大增加，鉴定周期大大延长的问题，从而提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，仅需一次PCR扩增及一次琼脂糖凝胶电泳检测，即可快速、高效地对天台蛙物种进行准确鉴定，兼具简便性及经济性的用于鉴定天台蛙的物种特异性PCR鉴定引物和方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴定天台蛙(Glandiranatientaiensis)的物种特异性PCR鉴定引物，其中，所述物种特异性PCR鉴定引物包括如SEQID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。
本发明还提供了一种利用物种特异性PCR鉴定天台蛙(Glandiranatientaiensis)的方法，其中，所述方法包括：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用根据上述所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的总DNA进行PCR扩增；
3)将步骤2)中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，
在步骤3)中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品为来自天台蛙的样品，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中不出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品不是来自天台蛙的样品。
本发明还提供了一种根据上述所述的物种特异性PCR鉴定引物或上述所述的方法在鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)中的应用。
通过上述技术方案，本发明通过从天台蛙组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明提供的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为天台蛙，通过这种方式，避免了传统DNA测序及序列比对的繁琐，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为天台蛙，进一步达到了检测时间短，检测效率高，兼具简便性及经济性的效果。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1-3和对比例1-10的扩增产物的糖凝胶电泳图；其中，泳道C来自双蒸水样品，泳道M为分子量标记，泳道1来自黑斑蛙的肌肉样品，泳道2来自天台蛙的肌肉样品，泳道3来自武夷湍蛙的肌肉样品，泳道4来自中华蟾蜍的肌肉样品，泳道5来自沼蛙的肌肉样品，泳道6来自棘胸蛙的肌肉样品，泳道7来自天台蛙的肌肉样品，泳道8来自花臭蛙的肌肉样品，泳道9来自虎纹蛙的肌肉样品，泳道10来自凹耳蛙的肌肉样品，泳道11来自天台蛙的肌肉样品，泳道12来自泽蛙的肌肉样品。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种用于鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)的物种特异性PCR鉴定引物，其中，所述物种特异性PCR鉴定引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对。
本发明还提供了一种利用物种特异性PCR鉴定天台蛙(Glandiranatientaiensis)的方法，其中，所述方法包括：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用根据上述所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的总DNA进行PCR扩增；
3)将步骤2)中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，
在步骤3)中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品为来自天台蛙的样品，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中不出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品不是来自天台蛙的样品。
上述设计通过从天台蛙组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明提供的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为天台蛙，通过这种方式，避免了传统DNA测序及序列比对的繁琐，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为天台蛙，进一步达到了检测时间短，检测效率高，兼具简便性及经济性的效果。
在本发明的一种优选的实施方式中，出现的条带中所含有的DNA片段的长度为230bp。
在本发明的一种更为优选的实施方式中，为了使电泳后得到的条带更为清晰可辨，相对于30μL的PCR扩增体系的总体积，每条引物的浓度为0.2-0.5pmol/L，DNA模板的用量为40-60ng。当然，本发明中的用量并不局限于此，本领域技术人员可以根据实际需要进行相应的调节。同时，在PCR扩增过程中使用的聚合酶和缓冲液等可以为本领域常规使用的类型，用量本领域技术人员也可以根据实际情况进行选择，在此不多作赘述。
PCR扩增过程可以按照本领域常规采用的方式进行操作，条件可以根据实际需要选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述PCR扩增过程的变性温度为92-98℃，变性时间为35-45s。
在一种更为优选的实施方式中，所述PCR扩增过程的退火温度可以进一步限定为55-60℃，退火时间为25-45s。
本发明还提供了一种根据上述所述的物种特异性PCR鉴定引物或上述所述的方法在鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物浓度为10pmol/L，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本发明中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HCl(pH8.0)、25mmol的乙二胺四乙酸(pH8.0)、100mmol的氯化钠和1％重量份的十二烷基硫酸钠，本发明中使用的dNTPMix为Transgene公司的市售品，蛋白酶K为Merck公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为Tiangen公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。所述PCR仪为型号为ABI-2720型PCR仪。
实施例1
将0.5g表1中编号为2的待测样品置于离心管中并在离心管中将待测样品用消毒剪刀剪碎，然后向离心管中依次加入500μL的裂解液，30μL的10％十二烷基硫酸钠和3μL的20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀后56℃水浴消化12h至管内液体澄清。向上述消化后的混合物中加入Tris-平衡酚500μL，并轻微振荡5min后置于11000r/min的离心机上离心10min，取离心后的上清液。重复上述离心步骤两次。向重复离心后最终得到的上清液中加入冰冻无水乙醇1000μL并于-20℃下放置1h后置于12000r/min的离心机上离心13min后，弃上清液，并向得到的沉淀中加入70％的乙醇800μL，并轻微振荡0.5min后置于13000r/min的离心机上冰冻离心13min，弃上清液。重复上述离心步骤两次。将得到的沉淀置于无菌操作台上自然晾干2.5h后向其中加入TE溶液400μL，轻微振荡并用手指轻弹离心管后于4℃下放置3h后进行琼脂糖凝胶电泳，得到总DNA。
向PCR仪的样品管中加入10μL的10×PCR buffer，每条引物各1μL，2μL的2mmol/L的dNTPMix，2μL的25mmol/L的Mg2+，1U的Taq酶和50ng的总DNA，并用双蒸水补齐至30μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后进行30个循环，该循环包括：95℃变性40s，58℃退火30s和72℃延伸35s；最后再作72℃延伸10min。在上述反应条件下进行PCR扩增。将扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示(泳道编号为2)。
实施例2
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为7，电泳结果如图1所示(泳道编号为7)。
实施例3
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为11，电泳结果如图1所示(泳道编号为11)。
对比例1
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为C，电泳结果如图1所示(泳道编号为C)。
对比例2
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为1，电泳结果如图1所示(泳道编号为1)。
对比例3
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为3，电泳结果如图1所示(泳道编号为3)。
对比例4
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为4，电泳结果如图1所示(泳道编号为4)。
对比例5
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为5，电泳结果如图1所示(泳道编号为5)。
对比例6
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为6，电泳结果如图1所示(泳道编号为6)。
对比例7
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为8，电泳结果如图1所示(泳道编号为8)。
对比例8
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为9，电泳结果如图1所示(泳道编号为9)。
对比例9
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为10，电泳结果如图1所示(泳道编号为10)。
对比例10
按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为12，电泳结果如图1所示(泳道编号为12)。
测试例
将得到条带的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块用干净的手术刀切胶后并在DNA纯化试剂盒中进行纯化后送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
表1
| 编号 | 物种 | 样品类型 | 采集地 |
| C | 双蒸水 | - | - |
| 1 | 黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 2 | 天台蛙(Rana tientaiensis) | 肌肉 | 安徽泾县 |
| 3 | 武夷湍蛙(Amolops wuyiensis) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 4 | 中华蟾蜍(Bufo gargarizans) | 肌肉 | 安徽芜湖 |
| 5 | 沼蛙(Hylarana guentheri) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 6 | 棘胸蛙(Quasipaa spinosa) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 7 | 天台蛙(Rana tientaiensis) | 肌肉 | 安徽泾县 |
| 8 | 花臭蛙(Odorrana schmackeri) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 9 | 虎纹蛙(Hoplobatrachus tigerinus) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 10 | 凹耳蛙(Odorrana tormota) | 肌肉 | 安徽黄山 |
| 11 | 天台蛙(Rana tientaiensis) | 肌肉 | 安徽泾县 |
| 12 | 泽蛙(Fejervarya multistriata) | 肌肉 | 安徽黄山 |
通过表1的样品信息及图1的电泳图结果比对可以看出，通过本发明设计的引物对，在实际检测时可以将待测样品仅通过一次PCR扩增并通过凝胶糖电泳实验中的电泳图结果即可判断待测样品是否为天台蛙，不仅快速、高效，同时兼具简便性及经济性的特点。同时，三个阳性扩增产物(样品2、样品7和样品11)送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序的DNA片段的序列长度为230bp，利用GenBank数据库的Blast软件搜索比对后发现，样品2、样品7和样品11的序列与GenBank中已有的天台蛙物种线粒体Cytb基因同源片段序列的序列相似性达到100％。进一步表明了本研究设计的物种特异性引物组合可以有效地对天台蛙进行物种特异性诊断及鉴定。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (7)
1.一种用于鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)的物种特异性PCR鉴定引物，其特征在于，所述物种特异性PCR鉴定引物由如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对组成。
2.一种利用物种特异性PCR鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用根据权利要求1所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的总DNA进行PCR扩增；
3)将步骤2)中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；其中，
在步骤3)中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品为来自天台蛙的样品，若含有步骤2)中得到的产物的泳道中不出现阳性扩增条带，则判断所述待测样品不是来自天台蛙的样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，出现的条带中所含有的DNA片段的长度为230bp。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，相对于30μL的PCR扩增体系的总体积，每条引物的浓度为0.2-0.5pmol/L，DNA模板的用量为40-60ng。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，所述PCR扩增过程的变性温度为92-98℃，变性时间为35-45s。
6.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，所述PCR扩增过程的退火温度为55-60℃，退火时间为25-45s。
7.一种根据权利要求1所述的物种特异性PCR鉴定引物或权利要求2-6任意一项所述的方法在鉴定天台蛙(Glandirana tientaiensis)中的应用。
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