CN107022640A - 一种合征姬蛙的物种特异性pcr鉴定引物及鉴定方法与应用 - Google Patents

一种合征姬蛙的物种特异性pcr鉴定引物及鉴定方法与应用 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明公开了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物及鉴定方法，所述物种特异性PCR鉴定引物为Cyt b基因的目的片段，包括：上游引物序列F1：5'‑CAA TAC CAA ACC CCC TTR TTY GTW TGA TC‑3'；下游引物序列R1：5'‑GCT TCT CAR ATA ATA AAT ATY AT‑3'。这种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物及鉴定方法，相较于传统DNA测序及序列比对既简单又准确，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为合征姬蛙，缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果，具备实际应用价值。

Description

一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物及鉴定方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测鉴定领域，具体为一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物及鉴定方法与应用。
背景技术
姬蛙属的两栖动物种类繁多，包括饰文姬蛙、合征姬蛙、粗皮姬蛙、小弧斑姬蛙、花姬蛙等，它们的分布范围广泛，并且分布的区域经常有重叠。
合征姬蛙的学名为Microhyla mixtura，是中国的特有物种，是姬蛙科姬蛙属的两栖动物。它分布于安徽、湖北、四川、陕西、贵州等地，多生活于山区小水坑，高山稻田及附近。其生存的海拔范围为140至1700米。本课题组科研人员在采集合征姬蛙标本过程中发现不同采集地点的合征姬蛙形态大小上有较大的区别，可能已经出现种或亚种的分化，因此单纯依据形态大小特征去鉴别合征姬蛙有较大的困难，并且在有些采集地点发现合征姬蛙和饰文姬蛙、花姬蛙等共同生活在一起，有些科研人员鉴别错误，经常错把饰文姬蛙等当做合征姬蛙，因此我们需要从分子水平上设计一种特定引物来鉴定合征姬蛙的物种特异性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种通过PCR扩增凝胶电泳检测鉴定合征姬蛙的物种特异性的PCR鉴定引物及鉴定方法与应用。
为达到上述目的，本发明提供了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，所述物种特异性PCR鉴定引物为Cyt b基因的目的片段，包括：
上游引物序列F1：5'-CAA TAC CAA ACC CCC TTR TTY GTW TGA TC-3'；
下游引物序列R1：5'-GCT TCT CAR ATA ATA AAT ATY AT-3'。
以及上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物的鉴定方法，步骤是：
1)、从待鉴定样品肌肉组织中提取其DNA；
2)、使用权利要求1所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的DNA进行PCR扩增；
3)、将步骤2)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测泳道中是否出现扩增条带。
上述步骤3)中检测是否出现750bp条带。
以及上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物用于鉴定合征姬蛙的应用。
采用上述方案的有益效果为：这种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物及鉴定方法，相较于传统DNA测序及序列比对既简单又准确，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为合征姬蛙，缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果，具备实际应用价值。
附图说明
图1为本发明合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物对具体实施例中样品部分PCR产物凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
本发明提供了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，所述物种特异性PCR鉴定引物为Cyt b基因的目的片段，包括：
上游引物序列F1：5'-CAA TAC CAA ACC CCC TTR TTY GTW TGA TC-3'；
下游引物序列R1：5'-GCT TCT CAR ATA ATA AAT ATY AT-3'。
以及上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物的鉴定方法，步骤是：
1)、从待鉴定样品肌肉组织中提取其DNA；
2)、使用权利要求1所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的DNA进行PCR扩增；
3)、将步骤2)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测泳道中是否出现扩增条带。
上述步骤3)中检测是否出现750bp条带。
以及上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物用于鉴定合征姬蛙的应用。
具体实施例：
(一)实验用仪器设备
(二)总DNA的提取
A.溶液的配制
研究过程中，总DNA的提取采用SNET法。SNET溶液的配制方法如下：
(a)配制SNET溶液母液的方法：
(1)用电子天平称取Nacl 29.2g溶解于100ml灭菌过的蒸馏水中，待用。
(2)用电子天平称取SDS10g溶解于灭菌过的蒸馏水90ml中，搅拌，定容至100ml，制成10％SDS母液待用。
(3)用电子天平称取Na2EDTA.2H2O固体18.61g+NaOH固体2g，再加70ml灭菌过的蒸馏水,置于水浴锅中50℃温浴，溶解后定容至100ml，即制成0.5mol/l EDTA(pH＝8)母液，待用。
(4)用电子天平称取Tris-Base12.11g，置于灭菌过的蒸馏水80ml中溶解，再加4.2ml浓HCL，搅拌，溶解，定容至100ml，即制成1mol/l Tris-CL(pH＝8)母液，待用。
(b)用配制好的SNET溶液母液配制SNET工作液，方法如下：
(1)用量筒量取5mol/l Nacl母液8ml；
(2)用量筒量取10％SDS母液10ml；
(3)用量筒量取1ml 0.5mol/l EDTA(pH＝8)母液1ml；
(4)用量筒量取1mol/l Tris-CL(pH＝8)母液2ml；
(5)用灭菌过的蒸馏水将上述混合液定容至100ml，即制成100ml的SNET工作液。
B.总DNA的提取步骤
(1)材料处理:
a.将镊子灭菌，然后用其撕取适量的腿部肌肉放入离心管，加入196ul的裂解液(SNET),再加入4ul的蛋白酶k(Proteinase K)，用研磨棒充分研磨至液体清亮，无颗粒；
b.将上述离心管放入水浴锅，50度水浴不超过24小时。
(2)总DNA提取
a.取200ul裂解好的液体，每管加Tris—平衡酚200ul充分混匀，8000转离心5分钟；
b.取上清，每管加等体积(约200ul)氯仿和异戊醇的混合液(体积比24:1),8000转离心5分钟；
c.取上清，每管加与上清等体积(约200ul)的异丙醇(冰)，8000转离心15分钟，得DNA沉淀；
d.弃上清，加70％乙醇1000ul，振荡，16000转离心5分钟；
e.弃上清，倒扣，干燥；
f.加20ul无菌水溶解，4℃过夜，–20℃保存。
(三)PCR扩增及测序
Cyt b基因的目的片段长度为720bp左右，引物由自己设计：上游引物序列F1 5'-CAA TAC CAA ACC CCC TTR TTY GTW TGA TC-3'；下游引物序列R1 5'-GCT TCT CAR ATAATA AAT ATY AT-3'；每一样品的扩增体系为25μL，反应体系见表2-2。
PCR扩增体系
扩增反应在伯乐公司生产的PCR仪上进行。PCR反应程序如下：
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检查结果如图所示，出现750bp条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 遵义医学院
<120> 一种用于鉴定合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物和方法及应用
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Microhyla mixtura
<400> 1
caataccaaa cccccttrtt ygtwtgatc 29
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Microhyla mixtura
<400> 2
gcttctcara taataaatat yat 23

Claims (4)

1.一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，其特征是：所述物种特异性PCR鉴定引物为Cyt b基因的目的片段，包括：
上游引物序列F1：5'-CAA TAC CAA ACC CCC TTR TTY GTW TGA TC-3'；
下游引物序列R1：5'-GCT TCT CAR ATA ATA AAT ATY AT-3'。
2.根据权利要求1所述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物的鉴定方法，其特征步骤是：
1)、从待鉴定样品肌肉组织中提取其DNA；
2)、使用权利要求1所述的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1)中提取的DNA进行PCR扩增；
3)、将步骤2)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测泳道中是否出现扩增条带。
3.根据权利要求2所述鉴定方法，其特征是：步骤3)中检测是否出现750bp条带。
4.根据权利要求1所述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物在鉴定合征姬蛙中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108456737A (zh) * 2018-05-17 2018-08-28 遵义医学院 一种用于鉴定合征姬蛙物种特异性的pcr引物

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CN106011276A (zh) * 2016-07-18 2016-10-12 安徽师范大学 用于鉴定天台蛙的物种特异性pcr鉴定引物和方法及应用

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