CN105483282A - 一组pcr特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5’-CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC-3’；CL-R：5’-GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC-3’。采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1)提取待测样品的基因组DNA；2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。

Description

一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。
背景技术
重楼属(ParisL.)是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39个物种,主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用,其中滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)及华重楼[P.polyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara.]收载于2005年版《中国药典》,是云南白药等多种中药的重要原料之一。
然而重楼植物分类复杂,由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR技术直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。
目前，运用DNA分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过对滇重楼(P.polyphyllavar.yunnanensis)、南重楼(Parisvietnamensis)与华重楼(P.polyphyllavar.chinensis)等11个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J].药学学报.2010(03))。也有学者采用扩增叶绿体psbA-trnH序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树(neighbor-joiningtree)进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH条形码分子鉴定研究[J].天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。
上述技术显示了DNA条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。
为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的：
一组PCR特异性鉴别引物为：
CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；
CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。
进一步地，一组PCR特异性鉴别引物的构建步骤为：
1)提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；
3)对步骤2)的PCR扩增产物进行测序；
4)使用BioEdit软件对步骤3)的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；
1)利用primerpremier5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物(CL-F，CL-R)。
进一步地，步骤2)中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM10×PCRTaqbuffer(Mg2+plus)、10mMdNTP、上下游引物各10μM、1UDNATaq聚合酶、1μLDNA模板、ddH2O补足25μL。
进一步地，步骤2)中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。
一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，具体步骤为：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；
3)对步骤2)的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
进一步地，步骤2)中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。
本发明的有益效果：本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速鉴别。
附图说明
图1为滇重楼及其混淆品总DNA的电泳检测图谱；
图2为滇重楼及其混淆品通用引物ITS2扩增的电泳检测图谱；
图3为滇重楼及其混淆品鉴别引物的电泳检测图谱。
图中，1.滇重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch)Hand.-Mazz；2.毛重楼ParisaireiLeveille；3.多叶重楼ParispolyphyllaSmithinRees；4.七叶一枝花(长狭叶)Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara；5.大理重楼ParisdaliensisH.Li&V.G.Soukup；6.南重楼Parisietnamensis(Takhtajan)H.L；7.长柱重楼Parisforrestii(Takht.)H.Li；8.七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara；9.五指莲重楼ParisaxialisH.Li；10.阴性对照。
具体实施方式
引物设计
提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA，选择通用引物ITS2对滇重楼和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生工生物公司测序。滇重楼以及其伪品ITS2片段测序所得结果使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点，发现滇重楼变异位点较多，190bp处滇重楼为A，七叶一枝花-长狭叶为T，而其他混淆品为C，203bp处为C，而其他混淆品均为T，206bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，275bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为C，276bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，320bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为G，331bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，363bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，389bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，391bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，利用primerpremier5.0软件，选择203bp和331bp处的位点设计1对特异性PCR引物(CL-F,CL-R)，其核酸序列分别如下：
ITS2F：5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’
ITS3R：5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’
CL-F:：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’
CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。
实施例
1)材料、试剂与仪器
a.材料
材料如下表1所示，分别为滇重楼、毛重楼、多叶重楼、七叶一枝花-长狭叶、大理重楼、南重楼、长柱重楼、七叶一枝花和五指莲重楼。
表1样品来源表
b.试剂琼脂糖(美国Promega公司)；DL2000(北京鼎国昌盛公司)；2×PCRMasterMix(上海生工生物科技有限公司)；核酸染料(北京鼎国昌盛公司)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。
c.仪器PCR仪(Bio-RADT100ThermalCycler)；凝胶成像系统(G-BOXF3英国Syngene)；电泳仪(北京市六一仪器厂，型号DYY-6D)。
2)基因组DNA提取：取待鉴定样品1g，采用改良的CTAB法提取各样品基因组DNA，于-20℃保存。
3)特异性PCR扩增：
运用特异性引物扩增，反应采用25μL体系，其组分含量为：
扩增程序：
预变性94℃3min
变性94℃30s
退火56℃45s
复性72℃1min
保存4℃
35个循环
扩增产物检测及结果：
取5μLPCR扩增产物加入含核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶中，100V稳定电压电泳40min，紫外凝胶成像系统观察。如图3所示，结果显示，滇重楼样品在130bp处产生条带，其余样品未产生条带。
本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速鉴别。
最后说明的是，以上优选实施例及附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’-CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC-3’；
CL-R：5’-GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC-3’。
2.根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：
1)提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；
3)对步骤2)的PCR扩增产物进行测序；
4)使用BioEdit软件对步骤3)的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；
5)利用primerpremier5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。
3.根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2)中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM10×PCRTaqbuffer(Mg2+plus)、10mMdNTP、上下游引物各10μM、1UDNATaq聚合酶、1μLDNA模板、ddH2O补足25μL。
4.根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2)中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。
5.一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；
3)对步骤2)的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
6.根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2)中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。
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