CN105063203A - 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法 - Google Patents

一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105063203A
CN105063203A CN201510479788.3A CN201510479788A CN105063203A CN 105063203 A CN105063203 A CN 105063203A CN 201510479788 A CN201510479788 A CN 201510479788A CN 105063203 A CN105063203 A CN 105063203A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ginseng
probe
real
seqidno
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510479788.3A
Other languages
English (en)
Inventor
孔德英
孙涛
滕少娜
邓朝晖
陆丽华
蒋丹
何玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau filed Critical Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority to CN201510479788.3A priority Critical patent/CN105063203A/zh
Publication of CN105063203A publication Critical patent/CN105063203A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于人参实时荧光PCR检测的引物、探针及其检测方法。本发明针对人参（<i>Panax</i><i>？ginseng</i>）18S？rRNA基因序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2以及SEQ？ID？NO.3，用于人参的实时荧光PCR方法特异性检测。以本发明所设计的引物探针采用实时荧光PCR方法检测，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测中药材人参及其基原植物。

Description

一种用于人参实时荧光PCR检测的引物、探针及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明针对人参（P.ginseng）18SrRNA基因序列设计并筛选出的一组特异引物和探针及其使用方法，用于人参的实时荧光PCR方法特异性检测。
背景技术
人参（P.ginseng），被人们称为“百草之王”，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智等功效，是我国应用最广泛的名贵中药材，分布于我国东北、俄罗斯远东地区及朝鲜等地。近年来，随着人们“回归自然”的迫切需求和中草药市场的国际化，对人参等药用植物的利用不再局限于传统的入药治病，而广泛应用于饮食、保健、畜禽业等人类生活的各个方面，因而导致资源的过度开发利用，已有相当一部分珍贵药用植物资源受到严重破坏或濒临灭绝，与此同时，市场上伪混品当道，使用野红豆根、商陆根、紫茉莉根、栌兰根等冒充人参的现象屡见不鲜，严重危害消费者的利益，亟待建立准确快速的人参检测技术。
人参类中药的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。从1994年AP-PCR首次用于人参、西洋参的鉴别以来，DNA分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，RFLP、SSR、RAPD、AP-PCR、AFLP、ISSR、SNP等技术相继应用于参类药材的鉴别鉴定。然而，这些技术由于存在着操作步骤繁琐、工作量大、实验结果重复性差等弱点，难以在实际中得到应用而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和后基因组时代的到来，一些新的技术为参类药材的鉴定提供了新的方法。
实时荧光PCR技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，利用一组特异性的引物探针，通过检测荧光强度变化来进行检测，特异性强、灵敏度高，可提高结果准确性，而且在数小时内即可完成检测，提高了工作效率。通过实时荧光PCR方法检测人参，特异性强，结果准确，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供用于人参实时荧光PCR检测的引物探针序列及其检测方法。
一种用于人参实时荧光PCR检测的引物和探针，包括一对引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及探针的核苷酸序列为SEQIDNO.3。
利用上述引物和探针进行人参实时荧光PCR检测的检测方法，包括以下步骤：
1)制备待检模板DNA：用市售的磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取样品中的DNA。
2)PCR反应体系：10μL2×荧光PCR反应预混液，0.4μL10μmol/L的引物SEQIDNO.1，0.4μL10μmol/L的引物SEQIDNO.2，0.8μL10μmol/L的TaqMan探针SEQIDNO.3，4μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水4.4μL；其中阳性对照采用人参基因组DNA，阴性对照采用西洋参基因组DNA，空白对照采用灭菌去离子水。
3)实时荧光PCR反应参数：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。
4)结果判定：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。
上述引物和探针在制备人参实时荧光PCR检测用试剂盒中的用途。
采用本发明的引物和探针进行实时荧光PCR检测，相比于普通PCR方法，灵敏度要高1-2个数量级，特异性更强，整个检测能控制在2个小时内完成，大大缩短检测时间。相较于化学方法，操作简便，价格相对较低，检测难度较低。本方法特异性强，灵敏度高，结果准确，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
附图说明
图1为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR特异性实验检测图；
图2为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR灵敏度实验检测图。
具体实施方式
实施例1：引物、探针的设计和合成
参照GenBank中人参属物种基因序列，挑选种内保守、种间特异的18S序列（GenBankNO.KC593817.1），针对该基因，利用软件primerExpress3.0设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的引物和探针的序列为：
SEQIDNO.1：CACGGGGAGGTAGTGACAATA
SEQIDNO.2：AGACTTGCCCTCCAATGGAT
SEQIDNO.3：FAM-CGGGCTGATTCAGTCT-MGB
以上引物和探针由生物公司合成。
实施例2：本发明实时荧光PCR方法检测人参样品的具体操作
1)配制反应液：根据上述发明内容2所述，在试剂准备区配制PCR反应体系，各物质浓度体积如下：10μL2×荧光PCR反应预混液，0.4μL引物SEQIDNO.1（10μmol/L），0.4μL引物SEQIDNO.2（10μmol/L），0.8μLTaqMan探针SEQIDNO.3（10μmol/L），灭菌去离子水4.4μL。试验设置两次重复，同时阳性对照、阴性对照和空白对照。
2)加模板：在样本区，每个反应加4μL模板DNA，阳性对照用人参基因组DNA，阴性对照用西洋参基因组DNA，空白对照用灭菌去离子水。盖上反应管盖。
3)实时荧光PCR检测：在检测区，将配制好的PCR反应管放到ABIStepOnePlμs荧光PCR仪上，循环程序参数设定为：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。
4)结果判定：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。
实施例3：实时荧光PCR方法的特异性试验
以人参近缘种以及常见伪混品的DNA作为模板，包括：白芷、北沙参、西洋参、三七、桔梗、川明参、玄参、党参、丹参、竹节参。以人参的DNA为阳性对照。结果显示，只有人参DNA检测为阳性，其余均为阴性，证明本发明的引物探针特异性良好。结果见附图1，扩增曲线为阳性对照及人参样品DNA。
实施例4：实时荧光PCR方法的灵敏度试验
用灭菌去离子水将提取的人参基因组DNA（初始浓度为3×102pg/μL）10倍梯度稀释成6个系列梯度，稀释后浓度分别为3×102pg/μL至0.003pg/μL，取4μL作为模板进行灵敏度检测。结果如附图2显示，0.03pg/μL浓度以上均获得强的荧光信号，故最低检测限是0.12pgDNA/反应。
SEQUENCELISTING
<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种用于人参实时荧光PCR检测的引物、探针及其检测方法
<160>3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.1
cacggggaggtagtgacaata21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.2
agacttgccctccaatggat20
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.3
FAM-cgggctgattcagtct-MGB16

Claims (4)

1.一种用于人参实时荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：包括一对引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及探针的核苷酸序列为SEQIDNO.3。
2.一种利用权利要求1所述引物和探针进行人参实时荧光PCR检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备待检模板DNA：用市售的磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取样品中的DNA；
2)PCR反应体系：10μL2×荧光PCR反应预混液，0.4μL10μmol/L的引物SEQIDNO.1，0.4μL10μmol/L的引物SEQIDNO.2，0.8μL10μmol/L的TaqMan探针SEQIDNO.3，4μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照或空白对照，灭菌去离子水4.4μL；
3)实时荧光PCR反应参数：第一步：95℃30s；第二步：95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃时设置FAM荧光通道采集荧光；
4)结果判定：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果Ct值≤35.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40，则判定为阴性；如果35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次，如果再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为阳性，如果再次扩增后Ct值≥40，则判定为阴性。
3.根据权利要求2所述人参实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述阳性对照采用人参基因组DNA，阴性对照采用西洋参基因组DNA，空白对照采用灭菌去离子水。
4.权利要求1所述引物和探针在制备人参实时荧光PCR检测用试剂盒中的用途。
CN201510479788.3A 2015-08-07 2015-08-07 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法 Pending CN105063203A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510479788.3A CN105063203A (zh) 2015-08-07 2015-08-07 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510479788.3A CN105063203A (zh) 2015-08-07 2015-08-07 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105063203A true CN105063203A (zh) 2015-11-18

Family

ID=54492706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510479788.3A Pending CN105063203A (zh) 2015-08-07 2015-08-07 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105063203A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624291A (zh) * 2016-01-19 2016-06-01 中国食品药品检定研究院 检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法
CN108517372A (zh) * 2018-05-22 2018-09-11 华润三九医药股份有限公司 一种用于鉴定人参配方颗粒的引物组及鉴定方法
WO2020212190A1 (en) 2019-04-16 2020-10-22 Indena S.P.A. Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus
CN116334188A (zh) * 2023-05-24 2023-06-27 云南珩柯生物科技有限公司 鉴别屏边三七的方法、引物、探针及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100673070B1 (ko) * 2005-08-31 2007-01-22 대구한의대학교산학협력단 실시간 ｐｃｒ법을 이용한 인삼의 종간 유전자 감별 방법
US20070264638A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Sigma-Aldrich Co. Identification of ginseng and its imposters using genetic variations
CN102827940A (zh) * 2012-09-13 2012-12-19 中国科学院成都生物研究所 中成药中人参dna的pcr检测方法
KR101346261B1 (ko) * 2011-10-07 2014-01-14 대한민국 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100673070B1 (ko) * 2005-08-31 2007-01-22 대구한의대학교산학협력단 실시간 ｐｃｒ법을 이용한 인삼의 종간 유전자 감별 방법
US20070264638A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Sigma-Aldrich Co. Identification of ginseng and its imposters using genetic variations
KR101346261B1 (ko) * 2011-10-07 2014-01-14 대한민국 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트
CN102827940A (zh) * 2012-09-13 2012-12-19 中国科学院成都生物研究所 中成药中人参dna的pcr检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
侯双利等: "人参β-actin 基因实时荧光定量PCR 方法的建立", 《中草药》 *
崔光红等: "利用多重等位基因特异PCR鉴别人参、西洋参", 《中国中药杂志》 *
崔占虎等: "基于快速PCR方法的人参属药用植物鉴别研究", 《中药材》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624291A (zh) * 2016-01-19 2016-06-01 中国食品药品检定研究院 检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法
CN105624291B (zh) * 2016-01-19 2019-01-11 中国食品药品检定研究院 检测样品中是否存在五加科植物成分及是否掺伪的方法
CN108517372A (zh) * 2018-05-22 2018-09-11 华润三九医药股份有限公司 一种用于鉴定人参配方颗粒的引物组及鉴定方法
WO2020212190A1 (en) 2019-04-16 2020-10-22 Indena S.P.A. Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus
CN116334188A (zh) * 2023-05-24 2023-06-27 云南珩柯生物科技有限公司 鉴别屏边三七的方法、引物、探针及其应用
CN116334188B (zh) * 2023-05-24 2023-08-15 云南珩柯生物科技有限公司 鉴别屏边三七的方法、引物、探针及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104404129B (zh) Dna条形码鉴别溪黄草及其近属的方法
CN105063203A (zh) 一种用于人参实时荧光pcr检测的引物、探针及其检测方法
CN103060318A (zh) 基于谷子全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
CN105483282A (zh) 一组pcr特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法
CN104073553B (zh) 湖北麦冬pcr鉴定试剂盒及鉴定方法
CN107937566A (zh) 一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法
CN107586867A (zh) 薄壳山核桃品种Pawnee的特征序列、标记引物及鉴定方法
CN105154529A (zh) 一种油茶良种的分子特异性标记引物及鉴定方法
CN106367496A (zh) 一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组和应用
CN105002272B (zh) 一种rapd标记竹节参及其近缘植物的品种鉴别的方法
CN105907873B (zh) 一种鉴别白及及其混淆品的方法及pcr特异性鉴别引物
CN107862177A (zh) 一种区分鲤群体的单核苷酸多态性分子标记集的构建方法
CN104894237A (zh) 一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应用
CN116426680A (zh) 一种基于二代测序开发用于人参药材真伪检测的引物、探针及其检测方法
CN104673790A (zh) 油茶良种长林18号的分子特异性标记引物及鉴定方法
CN104774948A (zh) 河北白术pcr鉴定试剂盒及鉴定方法
CN105112410B (zh) 用于马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法
CN105200130B (zh) 密执安棒形杆菌不同亚种的条形码鉴定方法及其专用引物
CN102943116A (zh) 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN105420362A (zh) 兔中型艾美耳球虫荧光定量pcr检测引物和试剂盒
KR101948389B1 (ko) Ssr 마커를 이용한 더덕 및 잔대의 감별방법
CN104404173A (zh) 一种用于检测番茄斑萎病毒的nasba方法
CN1965886A (zh) 一种黄芪及其伪品的ssr分子标记鉴别方法
CN108085396A (zh) 基于荧光定量pcr检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法
CN110097976B (zh) 中药复方制剂的生物成分分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151118

RJ01 Rejection of invention patent application after publication