CN105154529A - 一种油茶良种的分子特异性标记引物及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶良种的分子特异性标记引物及鉴定方法，所述分子特异性标记引物的序列如下：上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′，下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′。本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林21号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种油茶良种的分子特异性标记引物及鉴定方法。
背景技术
油茶是我国栽植面积最大、分布范围较广的木本油料树种。大力发展油茶产业，对保障粮油安全，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。我国油茶产业方兴未艾，发展潜力巨大。目前，我国油茶林总面积达4500多万亩，但产量很低，每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是，绝大部分油茶林品种品质差或严重退化，而大量的国家和省级审（认）定的优良品种又未推广应用。同时，一些地方种苗质量意识淡薄，经营管理粗放。为保障油茶产业又好又快发展，要充分认识油茶良种对发展油茶产业的重要性，必须加快油茶优良种苗发展和强化质量管理。
我国目前对油茶种苗质量的监督管理，主要依靠在管理层面制定的各项制度，而在技术层面尚未取得关键性突破，特别是缺乏油茶良种的早期快速鉴别技术体系。目前通过国家林木良种审定的12个长林品种系列分别为长林3号、长林4号、长林18号、长林21号、长林23号、长林26号、长林27号、长林40号、长林53号、长林55号、长林56号、长林166号。这些油茶良种具有早实丰产、稳产、出籽率高、含油量高、抗性强、适应性广等特点。对油茶种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上油茶种苗的混乱局面，并首先从技术层面上对长林油茶良种进行鉴别保护。
目前对油茶品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期长、受环境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA）、ISSR（Inter-SimpleSequenceRepea，简单序列重复区间扩增多态性）和SRAP（sequence-relatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性）相继用于了油茶的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间的分子鉴别研究很少。况且，这些分子标记技术所采用的均为通用引物，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴别，只有开发出某个品种稳定、特异的DNA指纹标记才能真正用于该品种的准确快速鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油茶良种长林21号的分子特异性标记引物，可对油茶良种长林21号进行快速的早期鉴别。
本发明还提供了一种能对油茶良种长林21号进行快速鉴定的方法，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种油茶良种的分子特异性标记引物，所述分子特异性标记引物的序列如下：
上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′（SEQIDNo.1），
下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′（SEQIDNo.2）。
本发明的分子特异性标记引物（引物对）是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得油茶良种长林21号的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该引物对油茶良种进行PCR扩增，仅长林21号可稳定获得571bp大小的特异性片段，而其他油茶品种均不能获得该特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于油茶良种的鉴别（鉴别其是否为长林21号），即待测样品仅限于油茶。
作为优选，所述分子特异性标记引物应用于油茶良种长林21号的鉴定。
一种油茶良种的鉴定方法，所述鉴定方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现571bp大小的DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林21号，反之则否。
本发明方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
鉴定方法具体如下：
（1）取待测油茶幼嫩叶片，加液氮磨碎，利用新型快速植物基因组DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司）提取油茶的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系每20μL组成如下：
2×PowerTaqPCRMasterMix10μL
10μM上、下游引物各1μL
20ng/μL模板DNA3μL
ddH2O5μL
PCR反应条件如下：
94℃预变性7min；94℃变性45min，66.5℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。
取步骤（2）扩增产物5μL，与1μL0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现571bp的DNA条带，则待测油茶品种为长林21号，反之则否。
本发明的有益效果是：本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林21号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
附图说明
图1是本发明对油茶良种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号4为油茶良种长林21号，扩增出了分子量为571bp的特异DNA条带；其余编号为其它的长林油茶良种，未见有500bp多大小的特异DNA条带产生。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
（1）油茶良种基因组DNA的提取：
取待测油茶良种幼嫩叶片0.03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快速植物基因组DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司），以提取获得油茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（NanodropTechnologies,USA）来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′（SEQIDNo.1）和下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′（SEQIDNo.2），由上海生物工程技术有限公司合成。
（3）PCR扩增：
PCR反应液组成：PCR反应体系每20μL组成如下：
2×PowerTaqPCRMasterMix10μL
（PR1700，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司）
10μM上、下游引物各1μL
20ng/μL模板DNA3μL
ddH2O5μL。
扩增反应在LifeECO型扩增仪（Bioer，杭州博日科技有限公司）上进行。扩增条件：94℃预变性7min；94℃变性45min，66.5℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。
（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5μL，与1μL0.25%溴酚兰缓冲液（0.25g溴酚兰溶解于100ml40%（W/V）的蔗糖水溶液中）混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/mLEB的水溶液中染色30分钟，然后在美国伯乐自动凝胶图像分析仪（ChemiDocXRSimagingsystem，Bio-Rad，Hercules,CA,USA）上照相。
按照上述方法，分别对多个油茶良种（编号1~12代表油茶良种依次为：1：长林3号、2：长林4号、3：长林18号、4：长林21号、5：长林23号、6：长林26号、7：长林27号、8：长林40号、9：长林53号、10：长林55号、11：长林56号、12：长林166号）的特异引物PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。
油茶良种均来自浙江省金华市武义县。
箭头所指为仅从编号为4的油茶良种长林21号中扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为500bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的长林油茶良种，未见有500bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记用于油茶良种长林21号的鉴别，其稳定性、特异性非常高。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110>浙江省林业科学研究院
<120>一种油茶良种的分子特异性标记引物及鉴定方法
<130>2015.07
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cggactgattatccttggcaat22
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agatcccgcccaagacctt19
Claims (4)
1.一种油茶良种的分子特异性标记引物，其特征在于：所述分子特异性标记引物的序列如下：
上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′，
下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′。
2.根据权利要求1所述的分子特异性标记引物，其特征在于：所述分子特异性标记引物应用于油茶良种长林21号的鉴定。
3.一种油茶良种的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现571bp大小的DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林21号，反之则否。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述分子特异性标记引物的序列如下：
上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′，
下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′。
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