CN103205424A

CN103205424A - 油茶良种长林55号的分子特异性标记引物及鉴定方法

Info

Publication number: CN103205424A
Application number: CN2013101251337A
Authority: CN
Inventors: 王丽玲; 李海波; 刘本同; 钱华; 王衍彬
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-04-10
Also published as: CN103205424B

Abstract

本发明提供了一种油茶良种长林55号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；上游引物：5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林55号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。

Description

油茶良种长林55号的分子特异性标记引物及鉴定方法

（一）技术领域

本发明涉及油茶良种长林55号的分子特异性标记引物，以及利用该引物对油茶良种长林55号进行快速鉴定的方法。

（二）背景技术

油茶是我国栽植面积最大、分布范围较广的木本油料树种。大力发展油茶产业，对保障粮油安全，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。我国油茶产业方兴未艾，发展潜力巨大。目前，我国油茶林总面积达4500多万亩，但产量很低，每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是，绝大部分油茶林品种品质差或严重退化，而大量的国家和省级审（认）定的优良品种又未推广应用。同时，一些地方种苗质量意识淡薄，经营管理粗放。为保障油茶产业又好又快发展，要充分认识油茶良种对发展油茶产业的重要性，必须加快油茶优良种苗发展和强化质量管理。

我国目前对油茶种苗质量的监督管理，主要依靠在管理层面制定的各项制度，而在技术层面尚未取得关键性突破，特别是缺乏油茶良种的早期快速鉴别技术体系。目前通过国家林木良种审定的9个长林品种系列分别为3号、4号油茶是我国栽植面积最大、分布范围较广的木本油料树种。大力发展油茶产业，对保障粮油安全，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。我国油茶产业方兴未艾，发展潜力巨大。目前，我国油茶林总面积达4500多万亩，但产量很低，每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是，绝大部分油茶林品种品质差或严重退化，而大量的国家和省级审（认）定的优良品种又未推广应用。同时，一些地方种苗质量意识淡薄，经营管理粗放。为保障油茶产业又好又快发展，要充分认识油茶良种对发展油茶产业的重要性，必须加快油茶优良种苗发展和强化质量管理。、18号、21号、23号、27号、40号、53号、55号。这些油茶良种具有早实丰产、稳产、出籽率高、含油量高、抗性强、适应性广等特点。对油茶种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上油茶种苗的混乱局面，并首先从技术层面上对长林油茶良种进行鉴别保护。

对油茶品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期长、受环境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD（RandomAmplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）、ISSR（Inter-SimpleSequence Repea，简单序列重复区间扩增多态性）和SRAP（sequence-relatedamplified polymorphism，相关序列扩增多态性）相继用于油茶的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间的分子鉴别研究很少，况且这些分子标记所采用的或为通用随机引物或为成套设计引物的随机组合，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴定。SCAR（SequenceCharacterized Amplified Region，特征性片段扩增区域）标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，迄今为止，尚未有SCAR标记应用于油茶品种鉴别的研究报道。

（三）发明内容

本发明目的提供油茶良种长林55号的分子特异性标记引物，以及一种能对油茶良种长林55号进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

油茶良种长林55号的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；

上游引物：5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用ISSR标记为引物获得油茶良种长林55号的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对油茶良种长林55号进行PCR扩增，可获得约900bp大小的特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于油茶良种的鉴定（鉴定其是否为长林55号），即待测样品仅限于油茶。

本发明还涉及一种所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林55号进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现约900bp的DNA条带，则待测菌种为油茶良种长林55号；反之则否；

所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；

上游引物：5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。

所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer 终浓度为1×

dNTPs 1mmol/L

MgCl₂ 2.5mmol/L

Taq DNA酶 1.0U/反应

上、下游引物各0.4μM

模板DNA 60ng/反应

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

95℃预变性4min后；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl（pH8.5）、500mM KCl、25mM MgCl₂和1.0%Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，本发明所述方法如下：

（1）取待测油茶叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测油茶叶片的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每25μl组成如下：

10×PCR Buffer 2.5μl

10mmol/L dNTPs 2.5μl

25mmol/L MgCl₂ 2.5μl

5U/μl Taq DNA酶 0.2μl

10μM上、下游引物各1μl

20ng/μl模板DNA 3μl

ddH₂O补足至25μl；

PCR反应条件如下：

95℃预变性4min后；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

（3）取步骤（2）扩增产物5μl，与1μl0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟。于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现约900bp大小的DNA条带，则待测样品为油茶良种长林55号。

本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林55号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。

（四）附图说明

图1为对油茶良种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；箭头所指为从编号为9的油茶良种长林55号扩增出的分子量约900bp大小的特殊DNA条带；其余编号为其它的油茶良种。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）油茶良种基因组DNA的提取：取待测油茶良种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得油茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化（博日Bioer，杭州，中国）后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（GeneQuant Pro，GEHealthcare）来检测完整性、纯度及浓度。OD₂₆₀/OD₂₈₀>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′和下游引物5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

（3）SCAR分子标记的PCR扩增：

PCR反应体系组成：

10×PCR Buffer2.5μl，10mmol/L dNTPs2.5μl，25mmol/L MgCl₂2.5μl，5U/μl Taq DNA酶0.2μl，10mM特异引物对各1μl，20ng/μl模板DNA3μl，ddH₂O补足至25μl。

扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性4min后；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5ul，与1ul0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对多个油茶良种（编号1～10代表油茶良种依次为：1：长林3号；2：长林4号3：长林18号；4：长林21号；5：长林27号；6：长林32号；7：长林40号；8：长林53号；9：长林55号；10：长林66号）进行检测，电泳结果见图1。

其中编号为9的油茶良种长林55号，扩增出了分子量约900bp大小的特殊DNA条带，其余编号为其他油茶良种，未见有900bp大小的特殊DNA条带产生。

Claims

1.油茶良种长林55号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；

上游引物：5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。

2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林55号进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现900bp的DNA条带，则待测菌种为油茶良种长林55号；

所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；

上游引物：5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

（1）取待测油茶叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测油茶叶片的基因组DNA；

PCR反应体系每25μl组成如下：

10×PCR Buffer 2.5μl

10mmol/L dNTPs 2.5μl

25mmol/L MgCl₂ 2.5μl

5U/μl Taq DNA酶 0.2μl

10μM上、下游引物各1μl

20ng/μl模板DNA 3μl

ddH₂O补足至25μl；

PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

（3）取步骤（2）扩增产物5μl，与1μl0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现900bp大小的DNA条带，则待测油茶为油茶良种长林55号。