CN104611437A - 山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一对特异性高的山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物，以及一种能对山稻百灵谷7号进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。本发明分子特异性标记引物可对山稻百灵谷7号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别山稻品种所不能替代的分子手段。

Description

山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物及其鉴定方法。
(二)背景技术
山稻在我国具有悠久的栽培历史，分布广泛，尤以云南、贵州等少数民族聚居地为多，主要采用游耕性质的刀耕火种生产方式。长期的自然选择和人工培育，形成了我国丰富的山稻种质资源。近年来，随着林下经济的发展，建设各种规模大、效益好、带动力强的林下经济发展模式，已成为国家对发展林下经济所要实现的主要目标。然而长期以来，中国山稻主产地的山稻生产、销售一直较为混乱，“异种同名、同种异名”现象普遍存在，特别是一些优良品种频繁被假冒而出现在山稻种质资源市场上，极大地损害了山稻育种者和生产者的利益。因而对于山稻品种，建立一种简便、快速、可靠的优良品种鉴定技术尤为迫切。
分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)在上个世纪90年代已用于各类物种的分类鉴定上，但这些标记用于山稻品种的鉴定均不够理想。SCAR(SequenceCharacterizedAmplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。
(三)发明内容
本发明目的是提供山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物，以及一种能对山稻百灵谷7号进行快速鉴定的方法。
本发明采用的技术方案是：
山稻山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，
下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。
该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得山稻百灵谷7号的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对山稻品种进行PCR扩增，仅山稻百灵谷7号可获得742bp的特异性片段，其他山稻品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于山稻品种的鉴定(鉴定其是否为山稻百灵谷7号)，即待测样品仅限于山稻。
本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对山稻百灵谷7号进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测山稻品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现742bp左右大小的特异DNA条带，则待测山稻品种为山稻百灵谷7号，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，
下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。
本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：
余量为ddH2O；
PCR扩增条件如下：
先94℃预变性6min；
92℃变性40s、68℃退火40s、72℃延伸2min，共30个循环；
最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。
PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、500mM KCl、25mM MgCl2和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH2O。
具体的，所述方法如下：
(1)取待测山稻叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测山稻叶片的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR扩增体系每20μL组成如下：
ddH2O补足至20μL；
PCR扩增条件如下：
94℃预变性6min；92℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；
(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现742bp的DNA条带，则待测山稻品种为山稻百灵谷7号，反之则否。
本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对山稻百灵谷7号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别山稻品种所不能替代的分子手段。
(四)附图说明
图1为对山稻品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；箭头所指为从编号为17的山稻百灵谷17号品种扩增出的分子量为750bp左右大小的特殊DNA条带；其余编号为其它常用的山稻生产品种，未见有750bp左右大小的特异DNA条带产生。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)基因组DNA的提取：基因组DNA的提取采用以SDS-CTAB法进行提取。纯化的基因组DNA先用1.5％的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′和下游引物5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′，由上海生工生物工程技术有限公司合成。
(3)SCAR分子标记的PCR扩增：
PCR扩增体系每20μL组成如下：
ddH2O补足至20μL；
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。
PCR扩增条件如下：
94℃预变性6min；92℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；
(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
按照上述方法，分别对多种水稻和山稻(编号1～24代表山稻及水稻品种依次为：1：甬优538；2：百灵谷12号；3：中旱221；4：百灵谷15号；5：春江119；6：百灵谷10号；7：杂交岳伏9113；8：百灵谷16号；9：百灵谷4号；10：百灵谷18号；11：百灵谷2号；12：百灵谷5号；13：百灵谷19号；14：百灵谷1号；15：百灵谷3号；16：百灵谷9号；17：百灵谷7号；18：百灵谷6号；19：百灵谷13号；20：百灵谷17号；21：百灵谷20号；22：百灵谷11号；23：百灵谷14号；24：百灵谷8号)进行检测，电泳结果见图1。
其中编号17为山稻百灵谷7号品种，扩增出一条清晰明亮、稳定的分子量为750bp左右的特殊DNA条带，其余编号为其他常用的山稻生产品种，未见有750bp左右的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记用于山稻百灵谷7号的鉴定，其稳定性好、特异性高。

Claims (4)

1.山稻百灵谷7号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，
下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。
2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对山稻百灵谷7号进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测山稻品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现742bp的特异DNA条带，则待测山稻品种为百灵谷7号，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物：5′-AGCGGCCGCTGGCATGG-3′，
下游引物：5′-CCATGCCAGCGGCCGCT-3′。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性6min；92℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)取待测山稻叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测山稻叶片的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR扩增体系每20μL组成如下：
PCR扩增条件如下：
94℃预变性6min；92℃变性40s，68℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；
(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现742bp的DNA条带，则待测山稻品种为百灵谷7号，反之则否。
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CN103205424A (zh) * 2013-04-10 2013-07-17 浙江省林业科学研究院 油茶良种长林55号的分子特异性标记引物及鉴定方法
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潘爱虎: "5中杂交粳稻亲本SCAR标记的建立及其在真伪纯度鉴定中的应用", 《植物生理学通讯》 *

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