CN104372096A

CN104372096A - 一种黄麻微卫星dna标记指纹图谱及其应用

Info

Publication number: CN104372096A
Application number: CN201410664152.1A
Authority: CN
Inventors: 张立武; 祁建民; 袁民航; 蔡蓉蓉
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2034-11-20
Also published as: CN104372096B

Abstract

本发明涉及一种黄麻种质资源的DNA指纹图谱及其应用。该指纹图谱是以28对SSR引物等位片段的组合为基础，以58个黄麻品种/系为供试材料，通过DNA的提取、PCR扩增、PCR产物的鉴定、数据分析，最终构建DNA指纹图谱。该指纹图谱可以区分开供试的黄麻品种/系，可用于黄麻品种/系的鉴定或纯度分析。本发明与传统的形态学和细胞学鉴定检测相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点。

Description

一种黄麻微卫星DNA标记指纹图谱及其应用

技术领域

本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种黄麻微卫星DNA标记的指纹图谱及其应用于黄麻品种/系的鉴定或纯度分析。

背景技术

黄麻(Corchorus)是世界上仅次于棉花的重要韧皮纤维作物，主要在印度、孟加拉和中国种植。生产上栽培的有长果种(Corchorus olitorius L.)和圆果种(Corchorus capsularis L.)，染色体数均为2n=2X=14。黄麻纤维细软、强力大、吸湿性好、散水快，可纺性好，用途十分广阔。

优质黄麻品种在黄麻单产和质量中的贡献率举足轻重。我国黄麻育种家自20世纪40年代就开始黄麻的育种研究，先后推出了闽麻369、粤圆4号、梅峰4号、闽麻5号、黄麻179 等圆果种和巴长4号、宽叶长果等长果种品种。目前，“黄麻179”和“宽叶长果”以其高产、优质、多抗等特征成为我国黄麻主产区品种审定的对照品种。

1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立黄麻品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。就国内而言，由于20世纪地域间引种利用，黄麻品种同种异名现象十分严重，地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学鉴定方法很难做到准确而真实的鉴定黄麻的品种差别，为此需要在分子水平上进行分析鉴定。

DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。而微卫星（又称为简单重复序列，SSR）是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。如用微卫星 DNA 标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”（公开号CN1370834A）。

为了有效保护我国黄麻的品种知识产权，有必要在我国开展黄麻开发微卫星标记开发，并应用于黄麻优良品种 “分子身份证”构建的研究。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种黄麻微卫星DNA标记指纹图谱及其应用，该指纹图谱与常规形态学和细胞学检测相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

本发明提供了一种获取黄麻微卫星DNA标记指纹图谱的专用引物，所述引物为28对SSR引物，其中，11对SSR引物序列见申请专利“黄麻表达序列标签微卫星DNA标记”（专利号为2014100882191），即编号为CcSSR001、CcSSR008、CcSSR025、CcSSR030、CcSSR038、CcSSR045、CoSSR050、CoSSR052、CoSSR053、CoSSR054、CoSSR062的SSR引物；17对SSR引物序列如SEQ ID NO. 1-34所示。

本发明提供了一种黄麻微卫星DNA标记指纹图谱，选用如表1所示的来自不同地区的58个黄麻品种/系为供试材料，其中圆果种黄麻46份，长果种黄麻12份。

表1 供试黄麻种质资源的品种名称及来源

根据上述58个品种所建立的指纹图谱用数字表示为DNA fingerprint No. 1-58所示（表2）。其中，“1”代表图谱中某个位置上有扩增条带存在，而“0”代表图谱中某个位置上没有扩增条带存在。

表2 利用28对SSR引物构建58份黄麻的指纹信息

其中，无条带的记为“0”，有条带的记为“1”。

28对引物产生的67个SSR标记：CcSSR001-260, CcSSR008-400, CcSSR008-350, CcSSR025-300, CcSSR030-200 ,CcSSR030-150, CcSSR038-600, CcSSR045-350, CcSSR045-300, CcSSR045-270, CcSSR045-230, CcSSR045-200, CcSSR045-190, CcSSR045-170, CcSSR045-140,CcSSR045-130,CoSSR050-400,CoSSR050-270,CoSSR052-600,CoSSR053-200,CoSSR053-140,CoSSR054-900,CoSSR062-180,CoSSR122-500,CoSSR122-400,CoSSR122-190,CoSSR122-170,CoSSR122-150,CoSSR146-700,CoSSR146-600,CoSSR146-500,CoSSR146-300,CoSSR146-250,CoSSR146-200,CoSSR174-285,CoSSR174-195,CoSSR176-190,CoSSR179-250,CoSSR184-200,CoSSR192-560,CoSSR192-450,CoSSR192-380,CoSSR195-310,CoSSR196-650,CoSSR196-250,CoSSR227-230,CoSSR227-100,CoSSR228-400,CoSSR229-210,CoSSR232-230,CoSSR232-260,CoSSR305-800,CoSSR305-400,CoSSR305-195,CoSSR305-180,CoSSR305-120,CoSSR305-085,CoSSR362-500,CoSSR362-270,CoSSR362-160,CoSSR362-140,CoSSR434-410,CoSSR434-180,CoSSR434-170,CoSSR434-650,CoSSR452-300,CoSSR452-180.

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

黄麻基因组DNA的提取，SSR引物扩增与筛选，PCR扩增产物的电泳检测，条带分子量大小的测定及黄麻微卫星DNA标记指纹图谱的构建。

具体步骤如下：

DNA提取：采用CTAB大量法提取黄麻基因组DNA。

扩增：PCR所用到的引物如表2所示。其中，11对SSR引物见申请专利“黄麻表达序列标签微卫星DNA标记”（专利号为2014100882191），其对应的表达序列标签SSR标记CcSSR001、CcSSR008、CcSSR025、CcSSR030、CcSSR038、CcSSR045、CoSSR050、CoSSR052、CoSSR053、CoSSR054、CoSSR062也已在专利“黄麻表达序列标签微卫星DNA标记”（专利号为2014100882191）中公开；编号为CoSSR122、CoSSR146、CoSSR174、CoSSR176、CoSSR179、CoSSR184、CoSSR192、CoSSR195、CoSSR196、CoSSR227、CoSSR228、CoSSR229、CoSSR232、CoSSR305、CoSSR362、CoSSR434、CoSSR452为新开发的基因组SSR标记，其对应的GenBank ID 为354991044、354991073、354991107、354991109、354991112、354991118、354991126、354991130、354991131、354991170、354991171、354991172、354991176、407915159、407915428、407915872、407915955。

PCR体系为10ul体系，每管PCR管中含：2.0ul 黄麻DNA，1.0ul 10×TaqBuffer，0.8ul Mgcl2，0.2ul dNTPs mixture，0.2ul Taq酶（2.5U），0.5ul 引物（ Forward+Reverse），5.3ul ddH₂O，加10.0ul石蜡覆盖，离心混匀。

将配制好的PCR管放入PTC-1000 PCR 仪中进行反应。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存30℃。PCR扩增反应结束后，每管加入4ul 6×loading Buffer，离心混匀。

PCR扩增产物通过9%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每管取7~8ul 扩增产物进行点样，每板胶电压约为200V，电流为100mA，功率不超过20W，电泳时间根据具体情况而定，一般为1.5h~2h。而后进行银染、显影，并做好标记。

表3 黄麻新开发的17对SSR引物的编号及序列

数据统计与分析：根据扩增产物的聚丙烯凝胶电泳结果，采用0、1读带，无条带的记为“0”，有条带的记为“1”。每个引物扩增的结果根据片段大小形成不同的等位片段组合，得到0,1数据。SSR引物等位片段组合的0,1数字串作为每一个品种的数字指纹。

本发明的积极效果如下：

(1) 在前期专利申请基础上（专利号为201410088219），分离并鉴定了17个适于黄麻品种/系的指纹图谱构建的微卫星DNA标记，标记的编号为CoSSR122、CoSSR146、CoSSR174、CoSSR176、CoSSR179、CoSSR184、CoSSR192、CoSSR195、CoSSR196、CoSSR227、CoSSR228、CoSSR229、CoSSR232、CoSSR305、CoSSR362、CoSSR434、CoSSR452。

(2) 本发明提供的指纹图谱在所收集的国内外58个黄麻品种（系）中具有特异性，具有良好的应用前景。与常规形态学检测相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。指纹图谱分析结果如表2所示。

附图说明

图1:黄麻品种卢滨圆果的特征引物CoSSR184电泳扩增图。其中，M为100 bp marker。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1黄麻微卫星DNA标记指纹图谱的构建：按照上述表2中各材料各引物(28对SSR引物)扩增情况，绘制58个黄麻品种(系)的DNA指纹图谱。在该DNA指纹图谱中，每个黄麻品种(系)均有其特异的DNA指纹，可以把这58个品种(系)彼此区分开(见图1与表2)。58个品种(系)的名称、来源等见表1。

实施例2将本发明的黄麻DNA指纹图谱用于某个黄麻种质资源的真实性检测：如供试材料中的黄麻179品种是圆果种黄麻品种审定的对照品种，如果对照品种出现问题，将导致整个区域试验失败。现有一批种子不能确定是否是真正的黄麻179种子，因此，按照本发明的方法建立这批种子的DNA指纹图谱，然后对照标准图谱进行对比鉴定。利用 “黄麻179” 的特征引物CoSSR305与CoSSR192对这批待测黄麻品种进行真实性检测。共检测192个样品，其中检测出具有“黄麻179”指纹（CoSSR305-120与CoSSR192-380）的样品189个，占检测样品总数的98.4%。鉴定结果为这批种子就是真实的“黄麻179”。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种黄麻微卫星DNA标记指纹图谱及其应用

<130> 34

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acagccatta ccaccacacc aaca 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtggtggga cacctggtgg a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaccaagca aggtgaatgc cc 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acactctaga taccttgatg gggctc 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcccaacat gcccatcaac ca 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgttccccac acaaaactga cttgc 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gccctctccc ataaatctaa tgccacc 27

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aatgtcaaag aagcactctg ccca 24

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggagagaga gagagagaga gagagag 27

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acaacacgta ccccacctta cgc 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggagtgtggt tagaccatga ggagt 25

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgattgcta acaacccaaa gttgct 26

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcggcgctgc aacactctca 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgtgggggtt ttaaccgggt gg 22

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgctgcaatg tggacaaaca tactcca 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tggtcaagag atgaatgtgc ataggct 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tggagcaaca cccaaatctt gtgaa 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acgtcacgaa gccttgacca aa 22

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtgttgtgt tgtgttggga ccac 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctactctgc tgcacggccc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caacaacagc aaccgccgcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggggacgacc tgtgccccaa 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccagcatctc ccatgcccac g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgttgctgct gctgctgctg a 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgcaagcttg ggtttggggg a 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tggcgatcga acgagcttct gg 22

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acttagcctt tgaggatggt tcccc 25

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gcggcgagcg aaaatagatt agcc 24

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagactgccc gccctttcgg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgggtatgga ggcgccaacg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggaagtggtg gtggagcggc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人共序列

<400> 32

ccctcaccta ccgccacgga 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

taccgttgcc acttgccgtt 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgcaaaaggt gaacacgcgc a 21

Claims

1.一种获取黄麻微卫星DNA标记指纹图谱的专用引物，其特征在于：所述引物为28对SSR引物等位片段的组合，其中17对SSR引物序列如SEQ ID NO. 1-34所示。

2.一种获取黄麻微卫星DNA标记指纹图谱的方法，其特征在于：提取黄麻基因组DNA，对权利要求1所述的28对SSR引物进行扩增与筛选，电泳检测，测定条带片段大小及构建微卫星DNA标记指纹图谱。

3.一种如权利要求1所述的专用引物获取得到的黄麻微卫星DNA标记指纹图谱，在黄麻品种/系的鉴定或纯度分析上的应用。