CN113278727A - 基于issr指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于作物遗传育种领域,涉及菜用黄麻种质的快速筛选,特别是指基于ISSR指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法及其应用。步骤如下:提取待检测的菜用黄麻总DNA;以黄麻总DNA为模板,依次以ISSR引物鉴别组中的1号、2号、3号引物为ISSR引物,进行PCR扩增;分析PCR扩增后的条带,根据常见菜用黄麻品种的ISSR引物鉴别组中的每条引物呈现的条带信息建立DNA指纹图谱,鉴定待测菜用黄麻的品种。本发明中通过ISSR引物UBC814,UBC854,UBC872,UBC874,UBC878扩增的谱带的多态性可将5个菜用黄麻品种完全区分开,并且通过提高退火温度大大提高了DNA扩增条带的特异性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域,涉及菜用黄麻种质的快速筛选,特别是指基于ISSR指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法及其应用。
背景技术
菜用黄麻为锻树科(Tiliaceae)黄麻属(Corchorus)一年生草本植物,属于黄麻(Corchorusolitorius L.)作物中可食用的品种类。菜用黄麻主要食用嫩茎和幼叶,嫩茎质地爽脆,幼叶软滑清香,风味独特,口感极佳,常食具有补钙、硒、微量元素及健脾胃、润肠通便、降血压、祛疲劳、抗癌等功效(李初英等,2015)。菜用黄麻栽培过程病虫害极少,全生产过程可不打任何农药,是绿色有机生态的保健功能型蔬菜品种。目前菜用黄麻主要依靠形态表型差异进行品种分类,但是大多数形态性状易受环境因素影响,且因形态鉴定工作量大、周期长、成本高、受季节限制,很难满足种质鉴定和良种选育的要求。DNA分子标记技术是一种快速高效的遗传分析方法,具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点,已开始广泛应用于作物遗传育种研究和品种鉴定。
桂麻菜1号:(桂)登(蔬)2014002,从南宁市西乡塘区心圩镇收集的地方黄麻菜种质资源经筛选、鉴定育成。红茎,叶绿色。桂麻菜2号(桂)登(蔬)2014003,从南宁市武鸣区里建镇收集的地方黄麻菜种质资源,经筛选、鉴定育成。白茎,叶绿色。桂麻菜1号和桂麻菜2号,以高抗氧化活性、天然富硒、高膳食纤维、耐高温多湿为典型特征,是目前最受欢迎的药食两用蔬菜,成为高温多湿的华南地区的主栽品种。桂麻菜1号和桂麻菜2号的食用部位嫩茎叶总多酚含量高达363.5 mg/100g,总黄酮含量高达317 mg/100g,是目前报道叶菜类总多酚、总黄酮含量最高的菠菜的2倍以上;膳食纤维含量高达3.17 g/100g,为大白菜(0.6g/100g)的5.28倍。硒蛋白含量为0.081 mg/kg,硒代氨基酸含量占总硒含量的百分比为88.5%(>65%),达富硒蔬菜的标准(《富硒农产品》(GH/T 1135-2017))。这两个品种具有耐高温和多湿的特性,广泛适宜在华南地区种植,填补了华南地区7-10月份叶菜类蔬菜淡季的缺口。
桂麻菜3号:皖品鉴登字第1809017,从广东潮汕“潮汕红茎麻菜”变异单株系选育,粉红茎、叶绿色。桂麻菜4号:皖品鉴登字第1809018,从广东潮汕“潮汕红茎麻菜”变异单株系选育,粉红茎、叶浅绿色。桂麻菜5号:皖品鉴登字第1809019,从广东潮汕“潮汕红茎麻菜”变异单株系选育,白色茎、叶绿色。桂麻菜3号、桂麻菜4号和桂麻菜5号,以耐盐为典型特征,为盐碱地区蔬菜种植提供新的选择。桂麻菜3号和桂麻菜4号均表现为中耐NaCl和Na2SO4;桂麻菜5号表现高耐NaCl和中耐Na2SO4,在盐碱地区的合浦、厦门、新疆等地区得到推广种植,很好的解决了盐碱地区缺乏耐盐特色蔬菜品种的问题。
然而由于这5种常见的采用黄麻品种的生活习性、植物性状、遗传基因均比较相近,单纯靠看外表或单纯靠一个基因去鉴定,并不能实现快速的鉴别。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提出一种基于ISSR指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法及其应用,以ISSR引物扩增谱带构建指纹图谱表,并引入带型编号和扩增谱带位点编号信息,可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和更新,是一种开放性的,由一系列若干个指纹图谱表构成的DNA指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过程中DNA指纹图谱检索更简便快速,适合在农业生产中推广应用。
本发明的技术方案是这样实现的:
基于ISSR指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法,步骤如下:
(1)提取待检测的菜用黄麻总DNA;
(2)以步骤(1)的黄麻总DNA为模板,依次以ISSR引物鉴别组中的1号、2号、3号引物为ISSR引物,进行PCR扩增;
(3)分析步骤(2)PCR扩增后的条带,根据常见菜用黄麻品种的ISSR引物鉴别组中的每条引物呈现的条带信息建立DNA指纹图谱,鉴定待测菜用黄麻的品种。
所述常见菜用黄麻品种为桂麻菜1号、桂麻菜2号、桂麻菜3号、桂麻菜4号和桂麻菜5号。
所述步骤(2)中ISSR引物鉴别组中的1号、2号、3号引物分别为UBC814、UBC854和UBC872或UBC814、UBC854和UBC874或UBC814、UBC854和UBC878;UBC814序列为5'-CTCTCTCTCTCTCTCTA-3'、UBC854序列为5'-TCTCTCTCTCTCTCTCRG-3'、UBC872序列为5'-GATAGA TAGATAGATA-3'、UBC874序列为5'- CCCTCCCTCCCTCCCT-3'、UBC878序列为5'-GGATGGATGGA TGGAT-3',其中R = (A , G)。
所述步骤(2)中PCR扩增程序为:94℃预变3 min,94℃ 30 s,56℃ 20 s,72℃ 20s,扩增35个循环,最后72℃延伸3 min。
所述步骤(3)中DNA指纹图谱的构建方法为:以常见菜用黄麻品种编号和扩增谱带带型为纵列,每条谱带的位点编号为横行,在每一纵横交结处,有扩增谱带用“1”表示,没有扩增谱带用“0”表示,分别获得每条引物对不同菜用黄麻品种的ISSR指纹图谱表。
所述的方法在鉴定菜用黄麻种质资源中的应用。
本发明具有以下有益效果:
本发明中通过ISSR引物UBC814,UBC854,UBC872,UBC874,UBC878扩增的谱带的多态性可将5个菜用黄麻品种完全区分开,并且通过提高退火温度大大提高了DNA扩增条带的特异性和准确性,该方法通过引入带型编号和扩增谱带,可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和更新,并是一种开放的,由一系列若干个指纹图谱表构成的DNA指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过程中DNA指纹图谱检索更简便快速,更适合在农业生产中推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为引物UBC814和UBC854凝胶电泳图谱检测,M:marker 5000。
图2为引物UBC872和UBC878凝胶电泳图谱检测,M:marker 5000。
图3为引物UBC874凝胶电泳图谱检测,M:marker 2000。
图4为利用本申请的分子标记检测待测菜用黄麻品种1号(M: BM5000 marker)。
图5为利用本申请的分子标记检测待测菜用黄麻品种2号(M: BM5000 marker)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、菜用黄麻总DNA的提取
菜用黄麻总DNA在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20min,取出后待用,按照下述步骤提取DNA:
(1)在65℃水浴中预热CTAB(0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0,0.025 mol/L EDTA-Na2pH8.0,1.4 mol/L NaCl,2% CTAB(w/v))提取液;
(2)在液氮中研磨2~3 g新鲜或-80℃冷冻的叶片;
(3)迅速加入CTAB提取液,混匀,倒入离心管中,65℃水浴30 min,其间不断轻轻摇动;
(4)加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,12000 rpm,常温离心10 min;
(5)取上清,按提取液:5M NaCl:无水乙醇=1:1:1的比例加入5M NaCl和无水乙醇制备混合液,颠倒混匀;
(5)吸取上清,将混合液转移到DNA纯化柱中;
(6)12000 rpm,常温离心30 s,弃去收集管内的液体,重复此步骤直至将混合液全部转移完;
(7)加入700 μL 75%乙醇,12000 rpm,常温离心30 s,弃去收集管内的液体,重复该步骤1次;
(8)12000 rpm,空甩柱子2 min;
(9)将离心柱放入新的1.5 ml的EP管,向离心柱中央加入50 μL ddH20水,静置2min;
(10)12000 rpm,离心1min,弃去离心柱,离心管收集的液体即为纯化的DNA;
(11)用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性,-20 ℃保存备用。
2、菜用黄麻分子标记ISSR引物的应用
本发明所用的ISSR(Inter-simple sequence repeat)引物由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建,其原理是在SSR的3’或5’端锚定2-4个碱基作为引物,对两侧具有反向排列SSR的一段序列进行扩增,锚定碱基避免了SSR在基因组上的滑动,大大提高了PCR扩增的稳定性和可重复性。本发明所用的具体引物序列信息如下:
UBC814:CTCTCTCTCTCTCTCTA
UBC854:TCTCTCTCTCTCTCTCRG
UBC872:GATAGATAGATAGATA
UBC874:CCCTCCCTCCCTCCCT
UBC878:GGATGGATGGATGGAT
其中:R = (A , G)。
3ISSR-PCR扩增与凝胶电泳检测
将该分子标记引物用于PCR检测,其中20 μl反应体系中包括50 ng黄麻DNA模板,2×Taq Mix(南京诺维赞)10 μl,1.2 μM ISSR引物,用ddH2O补足20 μl。该反应混合物的扩增程序如下:94℃预变3 min,94℃ 30 s,56℃ 20 s,72℃ 20 s,扩增35个循环,最后72℃延伸3 min,PCR反应产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,上样量为5 μl/样。
3、菜用黄麻DNA指纹图谱构建
根据每条引物呈现的条带信息建立DNA指纹图谱:以菜用黄麻品种编号和扩增谱带带型为纵列,每条谱带的位点编号为横行,在每一纵横交结处,有扩增谱带用“1”表示,没有扩增谱带用“0”表示,分别获得每条引物对不同菜用黄麻品种的ISSR指纹图谱表,以桂麻菜1号为对照,引物UBC814对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表如下(表1):
表1:引物UBC814对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC814扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C、D、E、F表示。
引物UBC814在5种菜用黄麻品种中共有3种不同类型的DNA指纹图谱(图1,表1),其中桂麻菜1号,桂麻菜2号和桂麻菜4号的条带类型一致,桂麻菜3号和桂麻菜5号的分子图谱中均不同于其他3个品种,表明UBC814能准确区分桂麻菜3号和桂麻菜5号这两个品种的分子指纹图谱。
表2:引物UBC854对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表。
注:引物UBC854扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C表示。
引物UBC854在5个菜用黄麻品种有3个不同类型的DNA图谱(表2,图1),其中桂麻菜1号和桂麻菜2号的带型一致,桂麻菜3号和桂麻菜5号的带型一致,而桂麻菜4号有其独特条带类型,因此引物UBC854能准确鉴别桂麻菜4号品种。
表3:引物UBC872对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC872扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C、D、E、F表示。
引物UBC872在5个菜用黄麻品种有3个不同类型的DNA图谱(表2,图2),其中桂麻菜1号和桂麻菜4号的带型一致,桂麻菜3号和桂麻菜5号的DNA图谱的条带特征一致,而桂麻菜2号有其独特条带类型,因此引物UBC872的指纹图谱能准确将桂麻菜2号品种与其它品种区分。
表4:引物UBC874对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC874扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C、D、E、F、G表示。
表5:引物UBC878对5个菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC878扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C、D、E、F表示。
引物UBC874和UBC878在5种菜用红麻品种中有两种类型的DNA指纹图谱,其中桂麻菜2号在引物UBC874和UBC878的DNA指纹图谱不同于其它四个品种(表4,表5,图2,图3),因此引物UBC874和UBC878也可作为鉴定桂麻菜2号品种的特异引物。
应用例1
取待测菜用黄麻品种1号,用引物鉴别组UBC814、UBC854和UBC872,对该品种进行ISSR分子标记鉴定,在用UBC814引物进行筛选鉴定时,得到的DNA指纹图谱如下(图4A,表6):
表6:引物UBC814对待测菜用黄麻品种构建DNA指纹图谱表
由上表可知,该待测菜用黄麻品种为桂麻菜1号、桂麻菜2号或桂麻菜4号中的一种,继续将该待测桂麻菜品种,用UBC854引物进行筛选鉴定,得到的DNA指纹图谱如下(图4B,表7):
表7:引物UBC854对待测菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
由上表可知,该待测菜用黄麻品种为桂麻菜1号或桂麻菜2号中的一种,继续将该待测桂麻菜品种,用UBC872引物进行筛选鉴定,得到的DNA指纹图谱如下(图4C,表8):DNA图谱显示该未知品种的条带与UBC872引物中桂麻菜2号DNA指纹图谱一致,表明该未知菜用黄麻品种为桂麻菜2号。进一步用引物UBC878对该未知品种进行分子标记检测,凝胶结果显示,该品种在引物UBC878的DNA条带特征也与桂麻菜2号条带的特征一致(图4D),进一步确认该未知品种为桂麻菜2号。表明用该分子标记鉴别桂麻菜品种的真实可靠性。
表8:引物UBC872对待测菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC872扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C、D、E、F表示。
应用例2
取另待测菜用黄麻品种2号,通过分子标记引物鉴别组UBC814、UBC854和UBC874,在用UBC814引物进行筛选鉴定时,得到的DNA指纹图谱表如下(图5A,表9):
表9:引物UBC814对待测菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
由上表可知,该待测菜用黄麻品种为桂麻菜1号、桂麻菜2号或桂麻菜4号中的一种,继续将该待测桂麻菜品种,用UBC854引物进行筛选鉴定,得到三条DNA图谱带型(图5B),其DNA指纹图谱表,如下表(表10):通过比对分析得出该品种的DNA指纹图谱特征类型与桂麻菜4号的图谱类型一致,表明该未知品种为桂麻菜4号。
表10:引物UBC854对菜用黄麻品种构建的DNA指纹图谱表
注:引物UBC854扩增条带从大到小的编号顺序分别用A、B、C表示。
实施效果分析
本发明中通过ISSR引物UBC814,UBC854,UBC872,UBC874,UBC878扩增的谱带可将5个菜用黄麻品种完全区分开,并且通过提高退火温度大大提高了DNA扩增条带的特异性和准确性,该方法通过引入带型编号和扩增谱带,可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和更新,并是一种开放的,由一系列若干个指纹图谱表构成的DNA指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过程中DNA指纹图谱检索更简便快速,更适合在农业生产中推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.基于ISSR指纹图谱系统鉴别常见菜用黄麻品种的方法,其特征在于,步骤如下:
(1)提取待检测的菜用黄麻总DNA;
(2)以步骤(1)的黄麻总DNA为模板,依次以ISSR引物鉴别组中的1号、2号、3号引物为ISSR引物,进行PCR扩增;
(3)分析步骤(2)PCR扩增后的条带,根据常见菜用黄麻品种的ISSR引物鉴别组中的每条引物呈现的条带信息建立DNA指纹图谱,鉴定待测菜用黄麻的品种。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述常见菜用黄麻品种为桂麻菜1号、桂麻菜2号、桂麻菜3号、桂麻菜4号和桂麻菜5号。
3. 根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中ISSR引物鉴别组中的1号、2号、3号引物分别为UBC814、UBC854和UBC872或UBC814、UBC854和UBC874或UBC814、UBC854和UBC878;UBC814序列为5'-CTCTCTCTCTCTCTCTA-3'、UBC854序列为5'-TCTCTCTCTCTCTCTCRG-3'、UBC872序列为5'- GATAGA TAGATAGATA-3'、UBC874序列为5'-CCCTCCCTCCCTCCCT-3'、UBC878序列为5'- GGATGGATGGA TGGAT-3',其中R = (A , G)。
4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中PCR扩增程序为:94℃预变3 min,94℃ 30 s,56℃ 20 s,72℃ 20 s,扩增35个循环,最后72℃延伸3 min。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中DNA指纹图谱的构建方法为:以常见菜用黄麻品种编号和扩增谱带带型为纵列,每条谱带的位点编号为横行,在每一纵横交结处,有扩增谱带用“1”表示,没有扩增谱带用“0”表示,分别获得每条引物对不同菜用黄麻品种的ISSR指纹图谱表。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在鉴定菜用黄麻种质资源中的应用。
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