CN110804675A - 不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱及其应用 - Google Patents
不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱及其应用。本发明以9对SSR引物等位片段的组合为基础，以8个不结球白菜品种/系为标准材料，通过DNA的提取、PCR扩增、PCR产物的鉴定、数据分析，最终构建得到DNA指纹图谱。该指纹图谱可以区分开供试的不结球白菜品种/系，可用于不结球白菜品种/系的鉴定或纯度分析。本发明与传统的形态学和细胞学鉴定检测相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱及其应用。
背景技术
白菜类作物是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)植物，它包含大白菜、不结球白菜和芜菁等多个栽培种群，是我国及东南亚地区重要的油料作物和蔬菜作物。我国作为白菜类作物的主要起源地，拥有丰富的白菜类蔬菜种质资源。不结球白菜(Brassicacampestris ssp.chinensis Makino)是其中很重要的一类，其原产于我国，俗称小白菜或青菜，北方称其为油菜，是人们喜爱的大众化蔬菜。目前市场上不结球白菜品种繁多，不同品种间茎叶的颜色存在差异，纤维素含量、多糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量等功能成分含量高低不一，口感、抗病性等也存在较大差异，仅通过外观形态往往很难鉴别。
简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)也称微卫星，在其基因组中座位两侧的DNA序列是相对保守的单拷贝序列，经扩增变异丰富的串联重复序列可获得其长度的多态性。除着丝粒及端粒区域以外，SSR位点广泛分布在真核生物的染色体上，具有多态性高、稳定性强、DNA用量少、操作简便、表现为共显性孟德尔遗传等特点，已经广泛应用于基因定位、图谱构建、多态性分析、种质资源的保存与利用、数量性状基因位点(QTLs)分析等诸多方面，是目前最有应用价值且应用最广泛的分子标记技术之一。此技术不受植株生长发育阶段和环境的影响，当出现假冒或有争议的情况时可有效地用此技术进行监督和仲裁，有利于品种的推广和保护。另外，对种植者来说选择一种优良品种，有助于获得较高的经济效益。
南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青、黄心黄、矮脚黄均是目前市场上的8份具有广泛代表性的优良不结球白菜品系，为了快速判断不结球白菜的品系，需建立有效可靠的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种不结球白菜品种南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系的微卫星DNA标记指纹图谱，并将其用于上述品种的鉴定或纯度分析，该指纹图谱与常规形态学和细胞学检测相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一组用于构建不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱的专用引物组，所述引物为9对SSR引物等位片段的组合，SSR引物序列如SEQ ID NO.1-18所示。
构建不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱的方法，包括以下步骤：分别提取不结球白菜南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系的基因组DNA，采用上述引物组进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，获得不结球白菜DNA指纹图谱。
利用上述引物组构建得到的不结球白菜DNA指纹图谱。
上述不结球白菜DNA指纹图谱在不结球白菜品种/系的鉴定或纯度分析上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明利用SSR分子标记来鉴定不结球白菜品种，通过构建基于每个不结球白菜品种的SSR分子标记指纹图谱，为种植者提供参考。能从遗传本质上对不结球白菜品系进行种质鉴定，准确、可靠。
2、当不结球白菜指纹图谱建立以后，在对某个未知样品进行真实检测时，几个小时就可以知道该不结球白菜DNA指纹，因此可以迅速判断出不结球白菜品种的真实性。
3、采用该发明，构建该DNA指纹图谱所用的样品可以根据需要不断增加，并对指纹进行实时更新。
4、本发明采用表的形式来说明DNA指纹图谱，并将其转换成了数码形式，便于计算机识别和分析。
附图说明
图1为引物对BraSSR01092的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A的标号代表引物对BraSSR01092，特征条带1大小为327bp。
图2为引物对BraSSR01139的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道B的标号代表引物对BraSSR01139，由上到下特征条带2大小为255bp，特征条带1大小为243bp。
图3为引物对BraSSR03057的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道C的标号代表引物对BraSSR03057，由上到下特征条带2大小为206bp，特征条带1大小为182bp。
图4为引物对BraSSR03058的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道D的标号代表引物对BraSSR03058，由上到下特征条带2大小为247bp，特征条带1大小为224bp。
图5为引物对BraSSR03121的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道E的标号代表引物对BraSSR03121，由上到下特征条带2大小为268bp，特征条带1大小为248bp。
图6为引物对BraSSR04005的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道F的标号代表引物对BraSSR04005，特征条带1大小为250bp。
图7为引物对BraSSR04046的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道G的标号代表引物对BraSSR04046，由上到下特征条带3大小为183bp，特征条带2大小为175bp，特征条带1大小为166bp。
图8为引物对BraSSR05032的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道H的标号代表引物对BraSSR03057，由上到下特征条带2大小为302bp，特征条带1大小为256bp。
图9为引物对BraSSR03118的PCR产物特征条带电泳图。电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道I的标号代表引物对BraSSR03118，由上到下特征条带3大小为339bp，特征条带2大小为318bp，特征条带1大小为304bp。
图10为南农五月慢9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图11为加拿大五月慢9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图12为四月白9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图13为矮颗黄心乌9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图14为青又青9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图15为苏州青自交系9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图16为黄心黄9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图17为矮脚黄自交不亲和系9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
图18为待测样9种引物对的PCR产物的电泳图谱，电泳图中M泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道A-I依次为为9种引物对BraSSR01092、BraSSR01139、BraSSR03057、BraSSR03058、BraSSR03121、BraSSR04005、BraSSR04046、BraSSR05032、BraSSR03118的扩增条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
南农五月慢植株直立，稍束腰，叶椭圆形，全缘，叶色深绿，叶柄浅绿色。抗寒力中等，耐热力中等，冬性强，抽薹迟。加拿大五月慢株型直立，束腰，叶色深绿，叶柄肥厚，呈青绿色，叶脉粗。生长势旺，耐寒性强，抽薹晚，品质佳。四月白植株直立，叶片卵圆形，叶色浅绿，叶面光滑，有褶皱。耐寒、耐热、冬性强。食用品质差。矮颗黄心乌外叶翠绿、内叶浅黄至金黄、叶面有较大核桃纹，叶柄短、白色或浅绿色品质佳、耐寒。成熟时，心叶紧抱或半抱。青又青植株直立，强束腰，叶片椭圆形，叶柄肥厚，青绿色，菜茎白，纤维细，味甜口感好。苏州青植株直立，稍束腰，叶片广卵圆或近圆形，叶片深绿，叶柄淡绿色。黄心黄植株外形美观紧凑，半包心，棵矮，黄心早。外叶亮绿色，叶片厚实而有光泽，叶皱多，心叶金黄色，梗白，纤维含量少口感极佳，耐寒性强。南农矮脚黄植株直立、束腰，叶片翠绿色，近圆形，较厚。质地脆嫩，纤维少，易煮熟，味甜，品质优。
南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青、黄心黄、矮脚黄均是目前市场上的优良不结球白菜品系，为了快速判断未知样品是否是上述8个品系，本发明建立了相对应的指纹图谱。
实施例1
不结球白菜DNA指纹图谱的构建
本实施例采用收集到的8份具有广泛代表性的不结球白菜品系为供试材料，用露地栽培苗提取DNA，进行SSR分析，建立与之相对应的指纹图谱。得到的指纹图谱再用于对这8种不结球白菜品种进行鉴定，并为其它不结球白菜的种质鉴定提供一条可供借鉴的有效方法。建立不结球白菜DNA指纹图谱的具体操作如下：
1、选用代表性不结球白菜品种
本实施例采用下表所示8份不结球白菜品种：
| 种类 | 编号 | 品种名 | 来源 |
| 不结球白菜 | 1 | 南农五月慢 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 2 | 加拿大五月慢 | 加拿大 |
| 不结球白菜 | 3 | 四月白 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 4 | 矮颗黄心乌 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 5 | 青又青 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 6 | 苏州青自交系 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 7 | 黄心黄 | 南京农业大学 |
| 不结球白菜 | 8 | 矮脚黄自交不亲和系 | 南京农业大学 |
2、不结球白菜品系的DNA提取及纯化
根据植物基因组DNA快速提取试剂盒(购自于杭州宝赛生物科技有限公司)说明书提取DNA。用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测定其浓度，稀释至20ng·μL-1，于-20℃下保存备用。
3、PCR扩增及电泳检测
采用SSR-PCR总体积为10μL的扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix为5μL，浓度为10μM正反向SSR引物各为1μL，浓度为50ng/μL模板DNA为1μL，用去离子无菌水补足10μL体系。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸l min，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
电泳步骤如下：扩增产物加3.33μL上样缓冲液，采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE缓冲液，50W恒功率电泳约1.5h，银染检测电泳结果。选择有代表性的多态性扩增条带构建供试材料的指纹图谱。
4、构建DNA指纹图谱
构建指纹图谱时，本着用最少引物、最少条带，又要把所有供试样品区分开来的原则，本实施例从59对引物中筛选出BraSSR01092 F and R；BraSSR01139 F and R；BraSSR03057 F and R；BraSSR03058 F and R；BraSSR03121 F and R；BraSSR04005 F andR；BraSSR04046 F and R；BraSSR05032 F and R；BraSSR03118 F and R这9对引物对。
引物序列如下表所示：
如图1-图9所示，从上述9对引物扩增出的条带中选取稳定性和重复性良好、多态性高的条带，可用于构建这8个不结球白菜品种的DNA指纹图谱。
由图1-图9总结得出条带赋值标准表：
根据每种不结球白菜呈现的条带信息，构建出8个品种的DNA指纹图谱，在该图谱中，每个品种都具有其特异的DNA指纹。为了描述方便，按照赋值标准表设定数字“00”表示图谱中对应引物没有扩增条带存在，“01”“02”“03”表示图谱中对应引物在确定位置上存在一条扩增条带，数字“12”“13”“23”表示图谱中对应引物在确定位置上存在两条扩增条带。最终，每个品种都拥有了一串短数字，如下表所示：
由此可知，8个品种的特征图谱数据为：010201021201121213，010201120201121223，010201021200010113，010112021201010123，011201010201031212，010101020201030213，010101010201020201，010102010101020101。图10-图17即8个标准品种的标准图谱。
实施例2
不结球白菜DNA指纹图谱用于不结球白菜的种质鉴定
判断待测样品是否为南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系8个品种中的一种，可按照如下方法对待测样品的DNA指纹进行鉴定：
提取待测样品DNA，用提取的DNA为模板，用SSR01092、SSR01139、SSR03057、SSR03058、SSR03121、SSR04005、SSR04046、SSR05032、SSR03118这9对引物对其进行SSR-PCR扩增，扩增产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，绘制出该待测样品的DNA指纹图谱，与实施例1构建的标准DNA指纹图谱进行比对，就可以知道待测样品是否是南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系8个品种中的一种。
实验结果见图18，可知待测样品的DNA指纹是010201021200010113，这与四月白的标准指纹是一致的，因此所检测的不结球白菜品种是四月白。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱及其应用
<130> 20191121
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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Claims (4)
1. 一组用于构建不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱的专用引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO. 1-18所示。
2.一种构建不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱的方法，其特征在于：包括以下步骤：分别提取不结球白菜南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系的基因组DNA，采用权利要求1所示的引物组进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，获得不结球白菜DNA指纹图谱。
3.利用权利要求1所示的引物组构建得到的不结球白菜DNA指纹图谱。
4.权利要求1所述的不结球白菜DNA指纹图谱在不结球白菜品种/系的鉴定或纯度分析上的应用。
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