CN108165647A - 一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法 - Google Patents

一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法，设计了SSR分子标记引物SSR09133，以不结球白菜的DNA作为模板进行扩增，可以将未知品种的不结球白菜与苏州青、矮脚黄、乌塌菜三个品种区分开来。本方法不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有准确性高、重复性好、操作简单、耗时短的优点，具有较高的商业应用前景，值得大范围推广。

Description

一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记 方法
技术领域
本发明属于蔬菜品种鉴定与良种技术领域，具体涉及一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法。
背景技术
我国是农业大国和用种大国，农作物种业已经成为国家战略性和基础性核心产业，而种子质量更是促进农业长期稳定发展、保障国家粮食安全的根本。近半个世纪以来，我国在种业科技研究等方面取得了很大的成就。然而，随着农作物育种事业的迅猛发展，品种数目急剧增加，给种子市场管理提出了挑战。田间小区种植鉴定是法定的品种鉴定方法，虽然具有准确性、科学性等优点，但也存在工作量大，成本高，时间长，结果滞后等明显不足。此外，人为造假、掺假等假冒伪劣种子也导致了大量侵害农业生产的事故。
发明内容
解决的技术问题：本发明基于现有不结球白菜品种鉴定采用田间小区种植鉴定方法中存在的工作量大、成本高、时间长、结果滞后等明显不足，使用SSR分子标记技术进行鉴定，并具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点。
技术方案：
一种不结球白菜的SSR分子标记引物，其序列为：
SSR09133-F：5’-CTGACGGCAACCATAGAAGA-3’，
SSR09133-R：5’-ACAGTCGTGAGGTTCCCTTT-3’。
上述引物用于鉴定不结球白菜的分子标记方法，包括以下步骤：
步骤1，提取待鉴定不结球白菜的DNA；
步骤2，以步骤1提取的DNA作为模板，用上述引物对其进行PCR扩增；
步骤3，对步骤2的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
结果判断标准如下：检测的产物条带与苏州青、矮脚黄、乌塌菜中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种。
进一步地，步骤2中的PCR扩增体系包括：2×Taq MasterMix、10μM正向SSR引物、10μM反向SSR引物、50ng/μL DNA模板、去离子水。
进一步地，步骤2中的PCR扩增体系为10μL扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix5μL、10μM正向SSR引物1μL、10μM反向SSR引物1μL、50ng/μL DNA模板1μL、去离子水2μL。
进一步地，步骤2中PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
进一步地，步骤3中采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
上述引物在不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜鉴定中的应用。
有益效果：本发明利用开发的SSR分子标记引物对及其检测方法可以将不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜三个品种同时区分开来。本方法不受植株生长发育阶段和环境的影响，具有准确性高、重复性好、操作简单、耗时短的优点，具有较高的商业应用前景，值得大范围推广。
附图说明
图1为苏州青、矮脚黄、乌塌菜PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中：Marker为DL 1000Marker、1为不结球白菜苏州青泳道、2为不结球白菜矮脚黄泳道、3为不结球白菜乌塌菜泳道。
图2为烤青、605、上海矮箕青、暑热、苏州青、矮脚黄、乌塌菜七个不结球白菜品种的PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中：Marker为DL 1000Marker、A为不结球白菜烤青泳道、B为不结球白菜605泳道、C为不结球白菜上海矮箕青泳道、D为不结球白菜暑热泳道、1为不结球白菜苏州青泳道、2为不结球白菜矮脚黄泳道、3为不结球白菜乌塌菜泳道。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明利用不结球白菜数据库、SSR分子标记引物数据库及参考文献中报道的不结球白菜SSR引物中有目的性的筛选60对SSR引物，将上述60对SSR引物合成后进行引物多态性筛选；筛选的具体过程为：首先提取苏州青、矮脚黄、乌塌菜的DNA，然后以苏州青、矮脚黄、乌塌菜的基因组DNA为模板，60对SSR引物分别进行PCR扩增，扩增完毕后进行聚丙稀酰胺凝胶电泳，电泳完毕后对凝胶显染色，最后对每一对引物扩增出来的条带进行判断，如果某一对引物的扩增条带在三个不同品种中出现多态性，就确定这一对引物可以用于后续的精准鉴定试验，否则，表示这一对引物不适合用于鉴定苏州青、矮脚黄、乌塌菜这三个不结球白菜品种。最终，经过这一选择过程，选择出了用于后续鉴定试验的SSR分子标记引物SSR09133。
本发明提供了一种利用上述引物序列同时鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取被检测样品不结球白菜的基因组DNA；
(2)以待检测的不结球白菜基因组DNA为模板，使用SSR引物对SSR09133进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果检测的产物条带与苏州青、矮脚黄、乌塌菜其中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种。
实施例1
本实施例提供的鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法，包括以下步骤：
(1)不结球白菜基因组DNA的提取
根据植物基因组DNA快速提取试剂盒(购自于杭州宝赛生物科技有限公司)说明书提取DNA，简要如下：
1)取适量不结球白菜幼嫩叶片(100mg)于2mL离心管中，加入钢珠并置于液氮中冷却，使用植物组织研磨仪进行充分研磨；
2)加入500μL已在65℃预热的PL1(已经加入β-巯基乙醇至0.2％)以及5μLRNaseA，剧烈涡旋震荡，在65℃的水浴锅中温浴10min；
3)加入170μL的Buffer PL2溶液，充分混匀，室温放置5min，12000rpm离心5min，将上清转入一个新的离心管中；
4)向上述溶液中加入750μL的PL3溶液，立刻混匀，并将所得溶液转入吸附柱RB中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
5)向吸附柱中加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心1min，倒掉废液；
6)重复5步骤一次；
7)将吸附柱RB放回收集管中，12000rpm离心2min，除尽漂洗液；
8)取出吸附柱RB，放入新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入100μL双蒸水，室温静置3min，12000rpm离心1min，洗脱基因组DNA；
9)DNA经纯度及浓度检测，稀释到50ng/μL，存放于-20℃冰箱中备用。
苏州青序列：
CTGACGGCAACCATAGAAGAAAAACAAACCCTAGTTTTCATTTTCAAGGTTCCTCCCACCACCACCACCACCCACATGTAAGTTTGTTCTTCTTCTTCTCTTGCCAATTAAATTAGCTTTCTTTGATTTTCTCCTGCTAAGAATCTTAAAGGGAACCTCACGACTGT共167bp
矮脚黄序列：
CTGACGGCAACCATAGAAGAAGAAAAGCAAACCCTACTTTTCATCTTCAAGGTTCCTCCCACCACCACCACCACCACCACCCACATGTAAGTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCCTCCTGCAATTAAATTAGCTTTCTTTGGTTTCCTCCTGCTAAGAATCTTAAAGGGAACCTCACGACTGT共181bp
乌塌菜序列：
CTGACGGCAACCATAGAAGAAAAGCAAACCCTACTTTTCATCTTCAAGGTTCCTCCCACCACCACCACCACCACCACCCACATGTAAGTTTCTTCTTCTTCTTCTCCTCCTGCAATTAAATTAGCTTTCTTTGGTTTTCTCCTGCTAAGAATCTTAAAGGGAACCTCACGACTGT共175bp
(2)不结球白菜基因组SSR扩增
采用SSR-PCR总体积为10μL的扩增体系，具体包括：2×Taq MasterMix为5μL，浓度为10μM正反向SSR引物各为1μL，浓度为50ng/μL模板DNA为1μL，用去离子无菌水补足10μL体系。其中正反向引物为SSR09133，正向引物SSR09133-F序列为
5’-CTGACGGCAACCATAGAAGA-3’；反向引物SSR09133-R序列为
5’-ACAGTCGTGAGGTTCCCTTT-3’。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min,然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
PCR扩增结束后，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，1.5μL上样，160v电泳1.5～2.0h后，银染显色，拍照采集电泳图像并统计多样性。具体的凝胶溶液包括：聚丙烯酰胺溶液(具体溶液配制：称取142.5g丙烯酰胺以及7.5g甲叉-双丙烯酰胺，加水溶解并定容至500mL)7.5mL，10×TBE 3mL，去离子无菌水20mL，10％的过硫酸铵溶液200μL以及TEMED为40μL。
具体的染胶流程为：
(1)拆胶后放入0.2％AgNO3溶液并置于摇床上缓慢摇晃8～10min。
(2)倒掉AgNO3溶液并加入去离子水在摇床上缓慢摇晃1min。
(3)加入含有1.5％的氢氧化钠以及1.0％甲醛的显色液，摇床上缓慢摇晃，直至显色成功。
(4)倒掉显色液，去离子水清洗两遍，使用保鲜膜包裹，晾干观察。
如果检测的产物条带与苏州青、矮脚黄、乌塌菜其中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种。
图1为苏州青、矮脚黄、乌塌菜PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中：Marker为DL 1000Marker、1为不结球白菜苏州青泳道、2为不结球白菜矮脚黄泳道、3为不结球白菜乌塌菜泳道。
图2为烤青、605、上海矮箕青、暑热、苏州青、矮脚黄、乌塌菜七个不结球白菜品种的PCR扩增后的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中：Marker为DL 1000Marker、A为不结球白菜烤青泳道、B为不结球白菜605泳道、C为不结球白菜上海矮箕青泳道、D为不结球白菜暑热泳道、1为不结球白菜苏州青泳道、2为不结球白菜矮脚黄泳道、3为不结球白菜乌塌菜泳道。
从图1和图2可知以上四个不结球白菜电泳片段与苏州青、矮脚黄、乌塌菜电泳泳道有明显差异，即本发明中提及的引物对苏州青、乌塌菜、矮脚黄三个不结球白菜具有特异性可用来同时对三个品种进行鉴定。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种用于鉴定不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜的分子标记方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgacggcaa ccatagaaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagtcgtga ggttcccttt 20

Claims (7)

1.一种不结球白菜的SSR分子标记引物，其特征在于：其序列为：
SSR09133-F：5’-CTGACGGCAACCATAGAAGA-3’，
SSR09133-R：5’-ACAGTCGTGAGGTTCCCTTT-3’。
2.利用权利要求1所述的引物鉴定不结球白菜的分子标记方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，提取待鉴定不结球白菜的DNA；
步骤2，以步骤1提取的DNA作为模板，用上述引物对其进行PCR扩增；
步骤3，对步骤2的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
结果判断标准如下：检测的产物条带与苏州青、矮脚黄、乌塌菜中的一个条带一致，并且与其他两个条带存在多态性，则证明该检测样本与条带一致的品种为同一品种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中的PCR扩增体系包括：2× TaqMasterMix、10μM正向SSR引物、10μM反向SSR引物、50ng/μL DNA模板、去离子水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2中的PCR扩增体系为10μL扩增体系，具体包括：2× Taq MasterMix 5μL、10μM正向SSR引物 1μL、10μM反向SSR引物 1μL、50ng/μL DNA模板 1μL、去离子水2μL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中PCR扩增程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3中采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
7.权利要求1所述的引物在不结球白菜苏州青、矮脚黄、乌塌菜鉴定中的应用。
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