CN106967797A

CN106967797A - 甜瓜种子纯度检测的特异性序列及检测方法和应用

Info

Publication number: CN106967797A
Application number: CN201710159976.7A
Authority: CN
Inventors: 沈佳; 张跃建; 寿伟松
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN106967797B

Abstract

本发明提供了一种快速、准确检测甜瓜种子纯度的特异性序列和方法。所述特异性序列，选自以下序列组中的一组或两组以上：SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02；SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04；一直到SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80。本发明还提供了一种甜瓜种子纯度检测的方法，包括如下步骤：(1)提取样本基因组DNA；(2)利用引物序列对样本线粒体基因组DNA进行PCR扩增和检测；(3)进行SSR多态性标记和特征条带统计；(4)计算甜瓜种子纯度。本发明首次基于甜瓜线粒体基因组父系遗传特性，开发了一套多态性较高的甜瓜线粒体基因组SSR标记，用于甜瓜种子纯度的快速检测和鉴定。

Description

甜瓜种子纯度检测的特异性序列及检测方法和应用

技术领域

本发明属于农业的蔬菜品种鉴定与良种领域，公开了一种快速、准确检测甜瓜种子纯度的方法。

背景技术

甜瓜果肉鲜美多汁，风味甜美，是我国重要作物，在我国经济作物生产中具有十分重要地位，且其种子单价高、销售利润可观。在甜瓜品种制种过程中，由于人工去雄不彻底，导致自交种混杂，是种子纯度降低最主要的因素，给生产和经营带来的商业隐患。此外，人为造假、掺假等假冒伪劣种子也导致了大量侵害农业生产的事故。

为了确保甜瓜生产安全，常规的种子纯度鉴定方法是田间形态学鉴定以及基于核基因组的分子标记鉴定。虽然田间形态学鉴定结果可靠，实施简单，但需要占据大量宝贵的温室空间，且检测周期长，耗时费工，难以满足实际生产需求；而随着基因技术的快速房展，基于核基因组的分子标记鉴定技术已经在一些蔬菜作物品种种子纯度检验中得到应用。

申请号为201310305714.9，公布号为CN103627786A的中国发明专利申请公开了一种甜瓜种子纯度检验的方法，是利用SSR分子标记对金露三号甜瓜种子进行纯度检验的方法。其利用一对SSR引物FLWSSRL和FLWSSRR对甜瓜杂交品种金露三号的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对金露三号杂一代种子样品进行检验。申请号为201410332784.8，公布号为CN104059992A的发明专利申请公开了一种基于EST-SSR标记的甜瓜品种绿天使杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种绿天使杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过GeneBank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer3.0在线引物设计，设计了57对EST-SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。但是核基因组的鉴定技术，由于亲本材料遗传背景不确定，需要大规模筛选核基因组特异标记，限制了品种纯度检测的效率。

发明内容

本发明所解决的现有技术的问题是：虽然基于核基因组DNA的鉴定技术在解决了常规田间形态学鉴定费时费力，但是现有的基于甜瓜种子的纯度的鉴定方法集中在对于甜瓜核基因组DNA的鉴定，而针对核基因组DNA的鉴定技术，由于亲本材料遗传背景不确认，需要大规模筛选核基因组特异标记，从而限制了甜瓜品种纯度检测的效率。

本发明基于前期发现，即甜瓜线粒体基因组表现出的独特的父系遗传特性，设计了基于甜瓜线粒体基因组的引物序列，用来检测甜瓜品种纯度。甜瓜线粒体基因组表现出的独特的父系遗传特性，为甜瓜种子纯度鉴定提供了优良的检测载体，具有以下优越性：(1)父系遗传，通过父本材料的花粉进行传播，可鉴定、追溯品种的父本来源；(2)单亲遗传，检测结果清晰明了，可快速判断品种纯度；(3)多态性高，甜瓜线粒体基因组庞大，存在大量重复序列，序列变异速度高于核基因组；(4)表现中性，遗传方式独立于核基因组，并不与不良性状存在连锁关系；(5)拷贝数多，相对其他核基因组分子标记所具有更高的稳定性及检测效率。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种用于甜瓜种子纯度检测的特异性序列，所述序列选自以下序列组中的一组或两组以上：

SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02；SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04；SEQ ID NO.05和SEQ ID NO.06；SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08；SEQ ID NO.09和SEQ ID NO.10；SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28；SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.33和SEQID NO.34；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44；SEQ IDNO.45和SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50；SEQID NO.51和SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58；SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；SEQ ID NO.61和SEQ IDNO.62；SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；SEQ ID NO.67和SEQID NO.68；SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74；SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76；SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；或者SEQ IDNO.79和SEQ ID NO.80。

本发明还提供了一种甜瓜种子纯度检测的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取被测样本的基因组DNA；

(2)利用引物序列对样本线粒体基因组DNA进行PCR扩增和检测；

(3)对检测结果进行SSR多态性标记和特征条带统计；

(4)计算甜瓜种子纯度。

优选的，以上方法中，步骤(1)中所述被测样本包括亲本材料和群体材料。

优选的，以上方法中，步骤(2)中所述引物序列选自以下序列组中的一组或两组以下：

优选的，以上方法中，步骤(2)中所述PCR扩增为Touch-Down PCR。

优选的，以上方法中，Touch-Down PCR扩增程序为：94-95℃预变性2-5min；然后94-95℃变性20-30s，65-70℃退火50s-2min，72℃延伸30-60s，共5-8个循环，每个循环退火温度降低2℃；然后94-95℃变性20s，55-60℃退火1min，72℃延伸30-60s，共7-10个循环，每个循环退火温度降低1℃；然后94-95℃变性20-30s，50-55℃退火30s，72℃延伸30s，共13-18个循环；最后72℃延伸5min保存。

优选的，以上方法中，步骤(2)中采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

优选的，以上方法中，步骤(2)中采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

优选的，以上方法中，步骤(4)中根据甜瓜群体材料的特征条带结果，分别统计与父本材料和母本材料条带一致的个体数量，计算种子纯度。

本发明还提供了以上所述的特异性序列在甜瓜种子纯度检测领域中的应用。

本发明所取得的有益效果是：本发明通过提供一种利用线粒体基因组SSR标记快速检测甜瓜种子纯度的方法，该套标记的发明用于甜瓜种子纯度检测，不仅具有试验结果的可靠性及稳定性等基本特点，在实际应用过程中还具有快速、高效等优点，适宜于构建大规模品种的线粒体基因组特异性指纹图谱、大量样品种子纯度的快速检测以及假冒伪劣品种的鉴定等。该方法不仅避免了田间表型鉴定的繁杂耗时工作，而且较基于核基因组分子标记更加高效，能快速检测甜瓜种子纯度和真伪，大幅度提高工作效率，将有力促进甜瓜品种保护以及生产、经营者的合法权益。

附图说明

图1是多态性引物在‘夏蜜’亲本材料的PCR扩增结果，其中Marker为DL2000Marker，M为母本，P为父本，ddH₂O为阴性对照；

图2是引物mtSSR34对‘夏蜜’亲本及其杂交种的PCR扩增结果，其中Marker为DL2000Marker，M为母本，P为父本，1-50为‘夏蜜’杂交种；

图3是引物mtSSR20对‘夏蜜’亲本及其杂交种的PCR扩增结果，其中Marker为DL2000Marker，M为母本，P为父本，1-50为‘夏蜜’杂交种；

图4是引物mtSSR15对‘夏蜜’亲本及其杂交种的PCR扩增结果，其中Marker为DL2000Marker，M为母本，P为父本，1-50为‘夏蜜’杂交种。

具体实施方式

如上所述，本发明提供了一种用于甜瓜种子纯度检测的特异性序列。

甜瓜线粒体基因组SSR标记是基于甜瓜线粒体基因组中的简单串联重复序列的侧翼保守序列开发的一类分子标记，特异性扩增在遗传学上定义为一个位点的DNA片段。一般扩增片段长度为100-200bp，检测方便。同时由于检测载体为线粒体基因组，具有父系遗传以及多拷贝的特点，因此具有带型单一、简单，重复性及稳定性好等优点。所以，本发明将甜瓜线粒体基因组SSR标记成为甜瓜品种分子育种、品种鉴定以及种子纯度检测的首选。在该基础上，针对线粒体基因组DNA设计了40对特异性引物序列，对甜瓜线粒体基因组进行SSR标记，然后利用亲本材料之间的多态性标记，从中筛选出18对特异性引物序列，准确分辨品种群体中自交种和杂交种，计算种子纯度。

甜瓜属作为线粒体父系遗传的植物，相比较于其他的线粒体父系遗传的植物，甜瓜线粒体基因组更加复杂，基因组更加庞大，包含不同的scaffold。所以在前期设计引物进行多态性标记时，需要付出大量的工作。另一方面，因为甜瓜的线粒体基因组的特殊性，具有大量重复序列，所以通过筛选出的40对引物的一种或者多种组合，其具有很高的实用性。

在本发明的一种优选实施方式中，采用以下序列组中的一种或者两种以上可以用于甜瓜种子的多态性标记，进一步用来鉴定种子纯度：SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02；SEQID NO.03和SEQ ID NO.04；SEQ ID NO.05和SEQ ID NO.06；SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08；SEQ ID NO.09和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQID NO.20；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；SEQID NO.37和SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.48；SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50；SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.53和SEQID NO.54；SEQ ID SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58；NO.59和SEQ ID NO.60；SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；SEQ IDNO.65和SEQ ID NO.66；SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68；SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；SEQID NO.71和SEQ ID NO.72；SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74；SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76；SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；或者SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80。例如，采用引物序列组：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68可以用于鉴定甜瓜种子的纯度。采用引物序列组组合，包括：SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30，引物序列组SEQI ID NO.39和SEQ ID NO.40，鉴定甜瓜种子纯度。采用两组或两种以上序列组鉴定甜瓜种子纯度，相互之间可以用来验证结果的可靠性。因为这40组序列在甜瓜中多态性较高，所以，通过这些序列对之间的随机组合，例如SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02，与SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04序列组合可以用于检测某个甜瓜品种的种子纯度；再如采用序列SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，与序列SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22，与序列SEQ ID NO.37和序列SEQ ID NO.38组合可以用于检测另外一个甜瓜品种的种子纯度。因为发明人所设计的引物序列在甜瓜属中高的多态性，因此可以适用于不同甜瓜品种的种子纯度的检测，实用性非常高。

同时本发明还提供了一种基于甜瓜线粒体基因组SSR标记进行甜瓜种子纯度检测的方法。

其中在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了一种基于线粒体基因组SSR标记快速检测甜瓜种子纯度的方法，其包含以下步骤：

(1)亲本材料及品种群体材料DNA的提取；

(2)亲本材料之间标记的Touch-Down PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(3)亲本材料之间多态性标记以及特征条带统计；

(4)多态性线粒体SSR标记特征描述及群体纯度检测，根据甜瓜群体材料的特征条带结果，获得与父本、母本材料条带一致个体数量，由此计算种子纯度。

其中，Touch down PCR是一种寻找最佳复性温度的方法。随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。利用“热循环PCR仪”在连续的循环中逐渐降低复性温度的方法来确定最适的Ta值，所以只用一次PCR就可以确定最适Ta值，避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化与测定工作。采用Touch down PCR的方法可以简化退化温度的优化程度，同时提高实验效率。

下面对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要说明的是，以下采用的甜瓜品种仅仅是作为品种代表，本发明所设计的40对引物可以适用于不同甜瓜品种的种子纯度的检测。

实施例一

(一)甜瓜线粒体基因组DNA引物序列的设计

根据甜瓜线粒体基因组DNA序列，设计了大量的引物序列，超过600对以上的引物序列，然后经过常规实验的筛选，筛选出40对引物，40对引物具有较高的多态性，将这些引物进一步用作甜瓜品种纯度的检测。

表1用于线粒体基因组SSR标记的引物序列及相关信息

(二)对甜瓜线粒体进行多态性SSR标记和纯度鉴定

1.甜瓜材料的准备：以甜瓜新品种‘夏蜜’及其亲本为实例样品(夏蜜品种浙江省农业科学院蔬菜研究所培育的品种，可以通过购买得到)，55℃浸种崔芽后播种于穴盘内，于两叶一心期进行移栽，并在幼苗期进行单株编号，随机选取亲本材料以及‘夏蜜’材料50株，取幼嫩叶片备用。

2.甜瓜基因组DNA提取

根据植物基因组DNA快速提取试剂盒(购自于杭州宝赛生物科技有限公司)说明书提取DNA，简要如下：

(1)取适量甜瓜幼嫩叶片(100mg)于2mL离心管中，加入玻璃珠并置于液氮中冷却，使用植物组织研磨仪进行充分研磨；

(2)加入500μL已在65℃预热的PL1(已经加入β-巯基乙醇至0.2％)以及5μL RNaseA，剧烈涡旋震荡，在65℃的水浴锅中温浴10min；

(3)加入170μL的Buffer PL2溶液，充分混匀，室温放置5min，12000rpm离心5min，将上清转入一个新的离心管中；

(4)向上述溶液中加入750μL的PL3溶液，立刻混匀，并将所得溶液转入吸附柱RB中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心1min，倒掉废液；

(6)重复(5)步骤一次；

(7)将吸附柱RB放回收集管中，12000rpm离心2min，除尽漂洗液；

(8)取出吸附柱RB，放入新的1.5mL离心管中，在吸附柱中加入100μL双蒸水，室温静置3min，12000rpm离心1min，洗脱基因组DNA；

(9)DNA经纯度及浓度检测，稀释到50ng/μL，存放于-20℃冰箱中备用。

3.甜瓜线粒体基因组SSR扩增

采用标准SSR-PCR扩增体系，总体积为25μL，具体包括：2×Taq MasterMix为12.5μL，正反向线粒体SSR引物终浓度为0.4μM，模板DNA为50ng，用去离子无菌水补足25μL体系。

其中，正反向线粒体SSR引物为表1中所列出的所有引物，将不同组的正反向引物分别加入到不同的PCR试管中，配制共计40组扩增体系样品。

PCR扩增体系采用Touch-Down程序，具体程序为：

94℃预变性2min；然后94℃变性20s，68℃退火1min，72℃延伸30s，共6个循环，每个循环退火温度降低2℃；然后94℃变性20s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共9个循环，每个循环退火温度降低1℃；然后94℃变性20s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；最后72℃延伸5min，16℃保存。

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增结束后，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，0.8～1.0μL上样，200v电泳2.5～3.0h后，银染显色，拍照采集电泳图像并统计多样性。具体的凝胶溶液包括：取丙烯酰胺溶液(具体溶液配制：称取145g丙烯酰胺以及5g甲叉-双丙烯酰胺，加水溶解并定容至500mL)25mL，5×TBE 15mL，去离子无菌水35mL，10％的过硫酸铵溶液750μL以及TEMD为60μL。

具体的染胶流程为：

(1)拆胶后放入去离子水中清洗一遍；

(2)加入0.2％的硝酸银溶液，并在摇床上缓慢摇晃8～10min；

(3)倒掉硝酸银溶液，再用去离子水清洗两遍；

(4)加入含有1.5％的氢氧化钠以及0.4％甲醛的显色液，摇床上缓慢摇晃，直至显色成功；

(5)倒掉显色液，自来水清洗两遍，使用保鲜膜包裹，晾干观察。

5.多态性线粒体SSR标记筛选

在甜瓜‘夏蜜’亲本材料之间进行多态性分析，随机选取母本及父本材料各10株，分别建立母本、父本DNA混池，进行多态性线粒体SSR标记筛选。经多次实验重复，在40对线粒体SSR标记中，有39对标记可扩增出稳定且清晰的条带，不同引物扩增的条带大小为100～200bp之间，其中在亲本之间表现为多态性的标记有18对，如图1所示，占总标记数的45％。

6.多态性标记对‘夏蜜’群体种子纯度的鉴定

实验选用由步骤5制备筛选的引物序列，对夏蜜群体种子纯度进行鉴定。实验过程中，分别以引物mtSSR34(即引物序列SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68)，引物mtSSR20(即引物序列SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40)，引物mtSSR15(即引物序列SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.30)为例，对夏蜜群体种子纯度进行鉴定。

其中，甜瓜群体种子纯度的计算公式为：

种子纯度＝杂交种子数/供检测样品种子数×100％

(1)使用引物mtSSR34对‘夏蜜’亲本材料及50个‘夏蜜’单株进行PCR扩增，在49个单株中都能扩增出‘夏蜜’父本材料特异性条带，1个单株(单株9)的扩增条带与‘夏蜜’母本材料一致(如图2所示)。因为甜瓜线粒体基因组表现出独特的父系遗传，而单株9的扩增条带与“夏蜜”母本材料一致，因此，推断单株9为母本自交种，‘夏蜜’群体的杂交率及纯度为98％。

(2)使用引物mtSSR20对‘夏蜜’亲本材料及50个‘夏蜜’单株进行PCR扩增，在49个单株中都能扩增出‘夏蜜’父本材料特异性条带，1个单株(单株9)的扩增条带与‘夏蜜’母本材料一致(如图3所示)。因此，推断单株9为母本自交种，‘夏蜜’群体的杂交率及纯度为98％。

(3)使用引物mtSSR15对‘夏蜜’亲本材料及50个‘夏蜜’单株进行PCR扩增，在49个单株中都能扩增出‘夏蜜’父本材料特异性条带，1个单株(单株9)的扩增条带与‘夏蜜’母本材料一致(如图4所示)。因此，推断单株9为母本自交种，‘夏蜜’群体的杂交率及纯度为98％。

基于以上结果，引物mtSSR34、mtSSR20和mtSSR15均能准确分辨‘夏蜜’群体中的自交种和杂交种，并快速鉴定种子的纯度，且相互验证结果的可靠性。

实施例二

将实施例一通过引物进行多态性检测的结果与田间试验结果进行对比，分别将夏蜜品种母本、父本以及夏蜜群体按照表2进行编号。按照《甜瓜种质资源描述规范和数据标准》对雌花花瓣形状、子房形状、成熟果果皮底色、成熟种子颜色分别进行描述，结果见表2。

表2田间试验结果

其中，表2中a为第一雌花节位上雌花花瓣形状，主要针对雌花开放时花瓣顶端形状，b为第一雌花节位雌花开放时子房的外部轮廓形状，c为甜瓜果实成熟时果实表面的颜色，d为甜瓜果实成熟后，成熟种子表面的颜色。

从表2可以看出，夏蜜9的形状表现与夏蜜母本一致，与采用引物序列检测的结果相一致。

以上仅仅是本发明的一个具体实施方式，本发明的发明人还采用了其他的甜瓜品种进行了实验，引物序列检测结果同田间检测结果均保持一致。本发明所设计的引物序列具有很高的实用性，可以用于甜瓜品种种子纯度的检测。

综上所述，本发明首次基于甜瓜线粒体基因组父系遗传特性，开发了一套多态性较高的甜瓜线粒体基因组SSR标记，用于甜瓜种子纯度的快速检测，并为进一步构建甜瓜品种的特异性线粒体指纹图谱，追溯花粉污染来源以及鉴定假冒伪劣品种奠定基础。本发明以甜瓜品种‘夏蜜’为示例，也可应用于其他甜瓜品种种子纯度的鉴定。实验过程中共设计了40对甜瓜线粒体SSR标记在甜瓜‘夏蜜’亲本材料之间进行多态性分析，共检测到18对多态性标记。基于这些多态性标记对‘夏蜜’群体进行鉴定，杂交种的特异条带与父本一致，自交种的特异条带与母本一致。因此可以利用甜瓜线粒体父系遗传特性，快速准确鉴定‘夏蜜’种子纯度，鉴定群体中表现为母本材料特异条带单株的比率就是自交种子的比率。

应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 甜瓜种子纯度检测的特异性序列及检测方法和应用

<130> OICN1701

<160> 80

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctcaatgc aatatgagtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taaagaaagc gaaaggactg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taatctccat tttccatgct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attaggcgac cacgtaatag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaggttagga aggagaggag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcttcgatag tccaatcgtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgccattctt agcagactat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagcctaatc tcccactctg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaccagttga ggaatgaaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaaccttga actgaaaacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctatcctgta tccggagcta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctacgcttc aagaaagaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgggacacaa tgtaatcttt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttgtttacg cagttcttca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgagtcaca tcaggaggaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tttgcttttc aactcctctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tagcggaccg tcaaatatag 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gacgacctct ctgtcttgtc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttcctccgg tttagtaggt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcctattcct cagactttgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caaaggatca gagttccaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tttcttcctc ttccctatga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgtaccagaa gcttacaacc 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcctcgtcct tgagataag 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

attcacgtcc aattcaaatc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

taaatcagtc cttcgcaaat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccatcctgca gctttatatc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccaaggatag aaggagttga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atcttgatcg atttgaggaa 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tgggagatta aatcgagaaa 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aacaagggct tgatcttatc t 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agcgattcag atcattatgg 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aagaggtgag ttcggacag 19

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gggcagttca gtagagaaaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acaagggaca gaagaaaggt 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggcttccta ttaatccact 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aattccccaa cttcttcagt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gcaattccaa atgtgaagtc 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aagccaagcg agagttaag 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

aagagaaaga aaggggaaaa 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ttcttgtcca aaatgaggtt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

cagggaagaa gtatgtgacc 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

taaggctggt aaaggtatgc 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tttgacggtc cactatcttc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cccatttctc acattcattc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tatgaatctc gatgggatct 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctccgatcga actactaagg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gtatcggcta gtggattgac 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ctccgatcga actactaagg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gtatcggcta gtggattgac 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcctttccag tctcttatgc 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gaagaagttt cattcgatgc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ttcctcttgt tgaaatgctt 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cccttgcagc ttagttgtag 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cctttcttag gtccctttct 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gtatggatcg atatccctga 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tgagtcatga taggtgcaaa 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

accagtcaat caatccgtag 20

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gttcatccca tctcgctac 19

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gtagacggaa atcctcctgt 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tcaatgagga aagctctcag 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

aaggagtgga actcagtgaa 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gaaggagtca atgaacaagg 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

cgtccagtct ttctggtaat 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

cttcctcctc ctacactggt 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gaaaagaggt gggaagaatc 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

attcacgtcc aattcaaatc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

atgcgtagaa ggagtcagaa 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gcaggttaag caggttaaaa 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

taaagagacc cgactcaaga 20

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ctagtttctg gtccggataa a 21

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ttcttgttag tggattcttt cc 22

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tatgtagcaa tcatccttcc a 21

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

ggatctctct cttgccttat g 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

tggtagttct tgctttgtct c 21

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

tgactttcaa aagggtaagt g 21

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

ctaccttctg ggctaacttt c 21

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gagggctaga atacgactga c 21

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

agactgctca gactgctatt g 21

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

attattggct agggaagaga a 21

Claims

1.一种用于甜瓜种子纯度检测的特异性序列，其特征在于，所述序列选自以下序列组中的一组或两组以上：

SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02；SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04；SEQ ID NO.05和SEQID NO.06；SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08；SEQ ID NO.09和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；SEQID NO.23和SEQ ID NO.24；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.33和SEQ IDNO.34；SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39和SEQID NO.40；SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50；SEQ IDNO.51和SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56；SEQID NO.57和SEQ ID NO.58；SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64；SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；SEQ ID NO.67和SEQ IDNO.68；SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；SEQ ID NO.73和SEQID NO.74；SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76；SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；或者SEQ IDNO.79和SEQ ID NO.80。

2.一种甜瓜种子纯度检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取被测样本的基因组DNA；

(2)利用引物序列对样本线粒体基因组DNA进行PCR扩增和检测；

(3)对检测结果进行SSR多态性标记和特征条带统计；

(4)计算甜瓜种子纯度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述被测样本包括亲本材料和群体材料。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述引物序列选自以下序列组中的一组或两组以下：

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增为Touch-Down PCR。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，Touch-Down PCR扩增程序为：94-95℃预变性2-5min；然后94-95℃变性20-30s，65-70℃退火50s-2min，72℃延伸30-60s，共5-8个循环，每个循环退火温度降低2℃；然后94-95℃变性20s，55-60℃退火1min，72℃延伸30-60s，共7-10个循环，每个循环退火温度降低1℃；然后94-95℃变性20-30s，50-55℃退火30s，72℃延伸30s，共13-18个循环；最后72℃延伸5min保存。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

8.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中根据甜瓜群体材料的特征条带结果，分别统计与父本材料和母本材料条带一致的个体数量，计算种子纯度。

10.权利要求1所述的特异性序列在甜瓜种子纯度检测领域中的应用。