CN103627786A - 一种甜瓜种子纯度检验的方法 - Google Patents

一种甜瓜种子纯度检验的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甜瓜种子纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对金露三号甜瓜种子进行纯度检验的方法。其利用一对SSR引物FLWSSRL和FLWSSRR对甜瓜杂交品种金露三号的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对金露三号杂一代种子样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。适用于对金露三号及其亲本真实性和种子纯度的检验。

Description

一种甜瓜种子纯度检验的方法
技术领域
本发明属于种子质量检验技术领域，涉及杂交甜瓜种子纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对甜瓜金露三号种子进行纯度检验的方法。
背景技术
金露三号是由合肥丰乐种业股份有限公司培育的高产优质杂交甜瓜新品种（详见《遗传资源来源披露登记表》），具有优秀的田间农艺性状。该品种在杂交制种过程当中,需要通过母本人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，将会极大地影响制种纯度。传统的杂交种纯度检测方法为种植鉴定,依赖于品种表型差异，通过成株外观形状比较鉴定，鉴定时间长、费用高、难度较大和准确性差,特别是在田间表型鉴定主要依靠鉴定人员对相关品种及其亲本的熟悉程度，是一种完全的经验型判断，鉴定人员本身素质的高低直接关系鉴定纯度及鉴定成功与否，因此田间鉴定越来越不适宜现代种业的发展需要。
SSR(Simple Sequence Repeat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础上发展起来的一种新的分子标记技术，具有高度多态性、共显性、保守性、且仅需少量的DNA、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点，在动物、植物、微生物等研究领域中得到了广泛应用，并已开始应用于甜瓜的遗传多样性分析及杂交种纯度的鉴定研究。本研究利用金露三号杂交种与双亲在一些SSR位点上的差异,寻找合适的引物扩增出杂交种与双亲差异明显的稳定条带，用于金露三号的室内纯度检测。为金露三号纯度鉴定提供一个准确、稳定、快捷、实用的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够对甜瓜种子进行准确、稳定、快捷且实用的检验方法。
其技术方案是：一种甜瓜种子纯度检验的方法，按下述步骤操作：
1）DNA提取：
f)将甜瓜种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2-3片真叶时，取2.5-3.5cm2的叶片于小研钵中，加入4×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管，65℃水浴半小时；
g)加入与提取缓冲液等体积的的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，12000rpm离心10分钟，吸其上清置于另一离心管，加入冰冻无水乙醇，-20℃冰柜内放置60分钟沉淀DNA；
h)12000rpm离心10分钟，弃上清；加浓度为75%的乙醇，静置4分钟去盐，弃去乙醇；
i)离心管置于加热通风烘箱中，65℃风干；
j)加灭菌双蒸水溶解待用；
上述4×CTAB提取缓冲液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵,1.4mol/L的氯化钠NaCl，0.1mol/L的Tris-Cl缓冲液（pH8.0），0.02mol/L的乙二胺四乙酸和0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成；
上述苯酚-氯仿-异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为1：24︰1；
2）PCR反应：
在PCR管中分别加入DNA模板、改性缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及双蒸水；先94℃预变性4分钟；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环；72℃延伸7分钟，95℃水浴4分钟变性后置冰上；
上述改性缓冲液为10×PCR缓冲液+2×10-3mol/L氯化镁；
上述引物FLXGSSRL序列为5’-GATTCATTAGGCGGTGAG-3’；
上述引物FLXGSSRR序列为5’-CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’；
3）琼脂糖凝胶电泳检测：
将琼脂糖加入100ml的5×TBE中搅拌混合均匀后加热，配制成浓度为3%的琼脂糖溶液，室温下冷却至55-65℃，每200ml琼脂糖溶液中加入0.5μg的核酸染料sybe Green I，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插梳；待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1.5×TBE电泳液的电泳槽中，以电泳液高出凝胶0.5cm为宜，点样；设定电压200V，电泳半小时，关闭电源，使用紫外凝胶成像系统拍照；
4）受检种子纯度计算：
用上述方法分别获取甜瓜杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100%。
其技术效果是：本发明利用一对SSR引物FLXGSSRL和FLXGSSRR对甜瓜杂交品种金露三号的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对金露三号杂一代种子样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致（详见附表1）。
附表1：应用SSR分子标记室内检测纯度与田间种植鉴定纯度对照表
样品编号 田间鉴定结果(%) 室内鉴定结果(%)
1 96.6％ 96.9％
2 100.0％ 98.9％
3 97.1％ 96.7％
4 99.6％ 97.1％
5 96.6％ 94.1％
6 99.1％ 97.2％
7 96.6％ 96.9％
8 97.1％ 96.1％
9 100.0％ 96.6％
10 98.1％ 96.3％
11 95.6％ 94.7％
12 98.1％ 97.7％
13 96.6％ 95.3％
14 99.6％ 97.9％
15 98.6％ 95.2％
16 96.6％ 95.7％
17 96.6％ 95.7％
18 100.0％ 98.2％
19 99.6％ 97.2％
20 100.0％ 97.5％
由上表分析，两种方法检测纯度的平均值分别为98.1%和96.6%，t测验二者差异不显著，说明了不同方法检测纯度结果的一致性。因而SSR分子标记技术适用于金露三号品种及其亲本真实性和种子纯度的检验。
附图说明
图1是甜瓜金露三号亲本及其F1的特征谱带。
图中13、14、16、17、18为金露三号父本带型（200bp）；19、21、22、23、24为金露三号母本带型（250bp）；1-12为金露三号杂种一代种子带型（包括父本200bp和母本250bp的带型）。
具体实施方式
一种甜瓜金露三号种子纯度检验的方法，按下述步骤操作：
1）DNA提取：
将甜瓜金露三号种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2-3片真叶时，取3cm2左右的叶片于小研钵中，加入700ul的4×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入1.5ml离心管，65℃水浴半小时；
加入与提取缓冲液等体积的的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，手摇10分钟，12000rpm离心10分钟，吸上清300ul于另一离心管，加入700ul的冰冻无水乙醇，-20℃冰柜内放置60分钟沉淀DNA；
12000rpm离心10分钟，弃上清；加400ul浓度为75%的乙醇，静置4分钟去盐，弃去乙醇；
离心管置于加热通风烘箱中，65℃风干；
加200ul灭菌双蒸水溶解待用。
上述4×CTAB提取缓冲液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵CTAB,1.4mol/L的氯化钠NaCl，0.1mol/L的Tris-Cl缓冲液（pH8.0），0.02mol/L的乙二胺四乙酸和0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成。
上述苯酚-氯仿-异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为1：24︰1;
2）1%琼脂糖凝胶检测DNA产物。
3）PCR反应：
⑴反应体系（20ul）：在PCR管中分别加入2ul DNA模板、改性缓冲液、1.8ul的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP(2.0×10-3mol/L)、1.0ul的引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、0.2ul的Taq酶及13ul的双蒸水ddH2O；
上述改性缓冲液为10×PCR缓冲液+2×10-3mol/L氯化镁。Mg+2一方面促进DNA
杂交另一方面在一定浓度下可以促进聚合酶的活性。
上述引物FLXGSSRL序列为5’-GATTCATTAGGCGGTGAG-3’；
上述引物FLXGSSRR序列为5’-CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’。
⑵反应程序：先94℃预变性4分钟；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环；72℃延伸7分钟，95℃水浴4分钟变性后置冰上。
4）琼脂糖凝胶电泳检测：
⑴琼脂糖凝胶制备
将3g琼脂糖加入100ml的5×TBE中搅拌混合均匀后加热，配制成浓度为3%的琼脂糖溶液，室温下冷却至55-65℃，每200ml琼脂糖溶液中加入0.5μg的核酸染料sybe Green I，然后将其倒入专用琼脂糖制胶模板内，插好梳子。
⑵点样
待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1.5×TBE电泳液的电泳槽中，以电泳液液面高出凝胶0.5cm左右为宜。用分样器分别吸取4μLPCR扩增产物，依次加入琼脂糖凝胶的对应点样孔内。
⑶电泳
连接好电泳槽与电泳仪的电极后，设定电压200V，接通电源，电泳30分钟，关闭电源，停止电泳。
⑷观察：将胶板取下放置于紫外荧光观测系统下，观测、照相并记录结果。
5）受检种子纯度计算
用上述方法分别获取甜瓜金露三号杂交一代和亲本种子电泳谱带（见图1。杂交种有清晰的两条带型，为200bp和250bp；父本有一条200bp的带型，母本有一条250bp的带型），将受检样品中有清晰的两条带型进行计数，受检样品的种子纯度采用下式计算：
受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100%。

Claims (1)

1.一种甜瓜种子纯度检验的方法，按下述步骤操作：
1）DNA提取：
a)将甜瓜种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2-3片真叶时，取2.5-3.5cm2的叶片于小研钵中，加入4×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管，65℃水浴半小时；
b)加入与提取缓冲液等体积的的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，12000rpm离心10分钟，吸其上清置于另一离心管，加入冰冻无水乙醇，-20℃冰柜内放置60分钟沉淀DNA；
c)12000rpm离心10分钟，弃上清；加浓度为75%的乙醇，静置4分钟去盐，弃去乙醇；
d)离心管置于加热通风烘箱中，65℃风干；
e)加灭菌双蒸水溶解待用；
上述4×CTAB提取缓冲液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵,1.4mol/L的氯化钠NaCl，0.1mol/L的Tris-Cl缓冲液（pH8.0），0.02mol/L的乙二胺四乙酸和0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成；
上述苯酚-氯仿-异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为1：24︰1；
2）PCR反应：
在PCR管中分别加入DNA模板、改性缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及双蒸水；先94℃预变性4分钟；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环；72℃延伸7分钟，95℃水浴4分钟变性后置冰上；
上述改性缓冲液为10×PCR缓冲液+2×10-3mol/L氯化镁；
上述引物FLXGSSRL序列为5’-GATTCATTAGGCGGTGAG-3’；
上述引物FLXGSSRR序列为5’-CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’；
3）琼脂糖凝胶电泳检测：
将琼脂糖加入100ml的5×TBE中搅拌混合均匀后加热，配制成浓度为3%的琼脂糖溶液，室温下冷却至55-65℃，每200ml琼脂糖溶液中加入0.5μg的核酸染料sybe Green I，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插梳；待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1.5×TBE电泳液的电泳槽中，以电泳液高出凝胶0.5cm为宜，点样；设定电压200V，电泳半小时，关闭电源，使用紫外凝胶成像系统拍照；
4）受检种子纯度计算：
用上述方法分别获取甜瓜杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100%。
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