CN101525666B - 荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统，其中，所述检验系统是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统。本发明同时提供该检验系统的检验方法。

Description

荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统及方法

技术领域：

本发明涉及基因特异片段检验系统及方法，具体涉及大麻性别基因特异片段检验系统及方法。

背景技术：

大麻是一种古老的栽培植物，是世界上许多国家重要的经济作物，但因其含有毒性成分——四氢大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD)，已被联合国禁毒公约列为毒品。大麻为雌雄异株植物，雄性植株中不含THC和CBD或含量很少，雌性植株二者含量则相对较高，因此认为雌性植株具有药用价值和作为毒品的滥用潜力。然而大麻雌雄植株在幼苗时期难以区分，只有当植株开花后才能辨认，从而错过了铲除毒品原植物的最佳时期。因此大麻性别的鉴别、特别是早期鉴别对于打击毒品犯罪具有重大意义。

随着科学技术的发展，大麻性别检验技术也在飞速发展，早期是通过大麻外部形态及生理生化特征的差异鉴别大麻性别，相继发展到由细胞水平的差异和目前在DNA分子水平上研究大麻性别。从上世纪90年代至本世纪初国内外学者用扩增片段长度多态性(AFLP)或随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对大麻性别进行鉴定，找到了相应的大麻性别的AFLP标记和RAPD标记并进行了序列测定或转化为可靠性稳定性更好的SCAR(sequence characterized amplified regions)标记。这些DNA分子标记技术应用于雌雄异株植物的性别鉴别，相对于形态及生理生化特征的鉴别提高了鉴别结果的准确性和可靠性。

RAPD标记技术是Williams等(1990)提出的，其原理是用含有10个碱基随机序列组成的寡核苷酸做引物，通过PCR扩增获得长度不同的多态性DNA片段。它具有设计引物无须知道序列信息，不需要DNA探针，合成一套引物，可用于不同生物，技术简便，成本较低等优点。由于这些优点，使该技术在动植物及人类基因定位和作图研究中都得到了广泛的应用。如在大麻性别研究中Sakamoto等(1995)用15个随机引物扩增得到一条700bp的雄性特异带；Hong Shao等(2003)用15个随机引物对大麻雌雄株进行了RAPD分子标记，其中有一个引物扩增出雌株特异条带，找到了与雌性相关的特异标记。但RAPD标记技术的实验重复性差，每个标记提供的信息量少，不能鉴别杂合子和纯合子，检测受反应条件的影响较大，结果可靠性低。

AFLP标记技术是由Zabeau和Vos于1993年创立的，该技术结合了RFLP技术和RAPD技术的特点，使用人工接头(adaptor)与基因组DNA限制性内切酶酶切片段连接并以此为DNA模板，合成系列3’一末端，随机变化三个碱基且与人工接头系列互补PCR引物进行特异条件扩增，通过变性PAGE电泳检测后可获得多态性图谱，AFLP技术革新是继RFLP、SSR和RAPD之后近几年来，发展最快的DNA分子标记技术，在农业、林业、畜牧业、渔业、医学等生命科学领域中正得到广泛应用。如在大麻性别研究中Giuseppe等(2002)对雄和雌的BSA(bulked segregant analysis)进行AFLP分析，表明大麻雄性染色体的存在。V.M.Cristiana Moliternil(2004)利用意大利的雌雄异株栽培种大麻品种Fibranova，对大麻的性别差异进行了形态学及分子生物学研究。但AFLP技术需进行酶切位点和构建人工接头等，前期技术建立较复杂。

SCAR分子标记是1993年由Paran和Michelmore提出的基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，SCAR分子标记是在序列未知的DNA标记(RAPD，AFLP等)基础上，对其特异产物进行回收、克隆和测序，根据扩增产物的碱基序列重新设计特异引物，并以此引物对基因组DNA进行PCR扩增获得。新的SCAR引物一般是在原来标记引物的基础上延长了10个左右碱基，不仅加强了与模板的特异性结合，而且提高了退火温度，提高了转化后新标记检测的专一性。SCAR具有已知序列，标记共显性且简单易用、重复性好等优点。如Otto

等(2002)利用20条RAPD引物对雌雄异株和雌雄同株大麻栽培种进行分子标记，其中有2个引物产生了与雄性植株的特异带。将这两条带进行了分离、克隆和测序，并转换为了SCAR标记，通过F2检测这两个标记与雄性表现型紧密连锁，通过F2的遗传分析确定它们在Y染色体上。

从检测的角度来看，AFLP标记、RAPD标记和SCAR标记在国内主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术或琼脂糖电泳EB染色技术分析，相对于可应用荧光毛细管电泳技术检测的荧光标记大麻性别特异片段检验系统具有操作步骤多、耗时、灵敏度低，丙烯酰胺、EB染料试剂等对实验人员健康和环境等危害较大，对实验操作人员技术水平要求较高等缺点。特别是AFLP标记和RAPD标记的电泳图谱的谱带较多，结果不简单易判，给检验人员在分析识别时造成了一定的难度，可能造成误判或漏判，这是法庭科学鉴定中的最严重的错误。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有AFLP标记、RAPD标记和SCAR标记的上述缺点，本发明提供一种操作简单、检验时间短、结果可靠直观、扩增片段长度短的大麻性别基因检验系统及方法。

本发明提供一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统，其中，所述检验系统是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物、并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统，其中所述引物序列如下：

DM016：(F)5’FAM-GCCCAAGTTGCTGCTGAG3’

(R)5’CCCACCGTTTAGGGAGCA3’

DM029：(F)5’FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3’

(R)5’ACGTTGTTGCTCGTAAAT3’

本发明通过以待测大麻DNA为模板、以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物的PCR反应系统，成功的扩增出可用于大麻性别鉴定的长度较短的基因片段，此方法操作简单、检验时间短、结果可靠直观。

本发明还提供上述检验系统的检验方法，其中：

PCR反应体系的初始变性条件：92-98℃，2-11分钟；

变性条件：91-97℃，30秒钟-2分钟；

退火：54-66℃，30秒钟-2分钟，30循环；

延伸条件：69-75℃，1分钟；

终延伸：72℃，2分钟；

保温：4℃维持；

PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。

其中优选条件为：

PCR反应体系的初始变性条件：95℃，11分钟；

变性条件：94℃，30秒钟；

退火：60℃，30秒钟，30循环；

延伸条件：72℃，1分钟；

终延伸：72℃，2分钟；

保温：4℃维持。

所述电泳采用荧光毛细管电泳技术检测。

大麻是雌雄异株植物，其为二倍体，染色体数20条，18条为常染色体，2条为性染色体，大麻的性别主要由遗传物质决定，含有一个X和一个Y染色体的植株一般为雄株，含有两个X染色体的植株一般为雌株，但受环境等因素的影响，大麻的性别又表现出具有一定的可变性。

本发明检测毒品植物大麻基因组中性染色体上的特异片段，是用聚合酶链反应在一个反应中使用荧光标记引物同时扩增两个特异DNA片段来进行大麻的性别和初步的种属鉴定。

本发明以GENEBANK中的大麻X、Y染色体上的DNA序列为基础设计多对引物，经过大量试验挑选出具有对大麻性别特异型、扩增效率和特异性高的雄雌性引物各一对。实验表明该对引物具有组织同一性，在区分大麻雄性和雌性植株方面具有良好的表现特征，并且在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常参杂的植物：桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟的种属检验中表现出种属特异性。

本发明提供的同时鉴别雌、雄性大麻的荧光标记大麻X、Y染色体引物的复合扩增体系，将用于复合扩增分析的大麻雄、雌性寡核苷酸引物混合在同一个试管内。复合扩增体系中的大麻性别片段被位于该基因两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行FAM荧光标记。扩增产物为129个碱基和238个碱基，控制在300个碱基以内，实现对高度降解、腐败检材(如大麻烟、大麻脂)的检测。大麻雄、雌性植株检测结果见图3。

本发明首先在国内研制出大麻性别片段、并在单一反应中复合扩增的荧光标记复合扩增体系。为毒品原植物大麻的早期性别鉴别、为禁毒铲毒、维护社会稳定提供了一个有力的工具。

经过研究筛选出的DM016和DM029两对性别鉴定引物组合，其中DM016的扩增片段是238bp，DM029的扩增片段是129bp，目的片段相差100bp左右，适合用同一种荧光标记，并且扩增产物片段较小实现了高灵敏度和检测抗腐败样品的目的。两者在实验中的最佳退火温度均是60℃，引物间无稳定的二聚体或发夹结构，其复合扩增效率高，灵敏度强，能够满足大麻性别鉴别的需要。大麻雄、雌性植株检测结果见图3。

本发明在国内首先研制出大麻雄、雌性特异片段的荧光复合扩增检测体系，其所使用的毛细管电泳检测设备在全国大多数法医DNA实验室都已装备，较易推广和应用于全国毒品原植物大麻的早期性别鉴别和禁毒铲毒的实际案件中。

用DM016、DM029两对引物分别对内蒙、山西、甘肃、新疆、云南、贵州、安徽等八个不同产地的大麻雄、雌性样本进行扩增并测序，八个产地雄、雌性大麻的扩增片段大小一致。测序结果表明雄性扩增片段序列与GENEBANK中提供的序列比对一致，说明扩增片段在大麻植物中具有很好的稳定性。雌性扩增产物在扩增片段的第30个碱基与GENEBANK中的碱基不同，存在突变，但不影响结果判定。

在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常参杂的植物：桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟的种属检验中本复合扩增体系结果表现出种属特异性。

本发明的检验系统适合中国范围内种植的大麻。

附图说明

图1大麻性别种属特异性检测结果(琼脂糖电泳)

从左至右依次为：Kb为空白对照；

1-7：桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟、大麻雄性样本；

图2大麻性别种属特异性检测结果(荧光电泳)

从上至下依次为：1雌性大麻；2雄性大麻；3小麦；4桑叶；5烟叶；6核桃叶；7月季叶；8柿子叶；

图3使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对大麻雄、雌性植株检测结果(3100基因分析仪电泳)；

从上至下依次为大麻雌性样本、大麻雄性样本；

图4使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对大麻烟检测结果(横坐标为碱基数、纵坐标为相对荧光强度)；

本发明的有益效果如下：

1、灵敏度好，利于检验涉毒案件中常遇到的腐败干枯检材。

2、准确率高

采自不同产地的336份大麻样本，经过检测和数据统计并分析基因型和表型一致率达到95％以上。

3、具有种属特异性

在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常参杂的植物：桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟的种属检验中表现出种属特异性(图1、图2)。

具体实施方式：

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例：

使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对宁夏回族自治区固原市禁毒支队缴获的大麻烟进行检验。

一、以硅珠法提取大麻烟样品中的DNA，使用试剂和具体操作如下：

1、试剂配制：

Tris/NaCl(TES)消化缓冲液：100mM Tris-HCL，500mM NaCl，2％SDS，50mM DTT，0.25mg/mL Proteinase K，10mM EDTA，PH 8.0

吸附液：12g GuSCN溶于10mL 0.1M Tris-HCl(PH6.4)，加入0.8mL 0.5MEDTA(PH 8.0)和0.5mLTriton-X100

漂洗液1：12g GuSCN溶于10mL 0.1M Tris-HCl(PH6.4)

漂洗液2：50mM Tris-HCL，10mM EDTA，0.15mM NaCl(PH6.5)。用时取30mL加入无水乙醇70mL。

硅珠悬浮液：1mL去离子水加入0.06g硅珠。

2、DNA提取步骤：

1)取大麻烟约50mg研磨成粉末转移至1.5mL离心管中加入400μL Tris/NaCl(TES)消化缓冲液，56℃消化2小时，期间每半小时震荡混匀一次。

2)消化完毕后13000rpm离心2分钟，取上清液300μL置于新1.5mL离心管中，加入三倍体积的吸附液，震荡混匀，56℃保温15分钟。

3)取出离心管5000rpm离心15分钟，将上清液转移到另一新1.5mL离心管中，加入硅珠悬液40uL，混匀后吸附1小时，期间每10分钟混匀一次。

4)将离心管5000rpm离心10分钟，弃去上清液。加入500uL漂洗液1连同硅珠转移到新1.5mL离心管中，5000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5)加入500uL漂洗液2，震荡洗涤，5000rpm离心10分钟，弃上清废液。重复此步骤两次。

6)打开离心管盖，室温下挥发干燥硅珠10～15分钟。

7)加入TE缓冲液50uL，56℃孵育15分钟，其间振荡1次。

8)12000rpm离心2分钟，取上清进行后续PCR反应或4℃保存备用。

二、使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统进行PCR反应。

1、PCR反应体系：

2、PCR反应循环程序

1)将PCR扩增管置于热循环仪上。

2)使用下面推荐的程序进行热循环。

AB公司9600和9700热循环仪的扩增程序：

初始变性条件为：95℃，11分钟；

变性条件为：94℃，30秒钟；

退火条件为：60℃，30秒钟，30循环；

延伸条件：72℃，1分钟；

终延伸：72℃，2分钟；

保温：4℃维持；

3)扩增后的样品应尽快检测，否则应密封避光保存在-20℃。

三、扩增产物用ABI

3100遗传分析仪检测

1、按1∶100比例混合内标(LIZ-500，AB公司)和去离子甲酰胺配制成上样混合物，振荡混合均匀。

2、向96孔板的每孔中加入15μL上样混合物和1μL扩增产物，快速离心，避免产生气泡。

3、95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后将96孔板置于ABI

3100遗传分析仪中尽快电泳。

四、检验结果

使用3100型遗传分析仪对PCR扩增产物电泳检测后，采用GeneMapper ID3.2(AB公司)软件分析后得到各产物的片段长度(图4)。

获得结果证明所缴获的大麻烟均是由雌性大麻植株制备而来，说明此大麻烟是有组织的种植、与办案单位侦查结果相一致。

序列表

<110>公安部物证鉴定中心

<120>荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统及方法

<130>雌雄异株植物性别鉴定的研究进展

<140>CN 101525666

<141>2011-02-28

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Cannabis sativa

<400>1

gcccaagttgctgctgag

18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Cannabis sativa

<400>2

cccaccgtttagggagca

18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Cannabis sativa

<400>3

agcctgtctaagagtggg

18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Cannabis sativa

<400>4

acgttgttgctcgtaaat

18

Claims (4)

1.一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验方法，其特征在于：所述检验方法是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统进行反应，其中所述引物序列如下：

DM016：(F)5’FAM-GCCCAAGTTGCTGCTGAG3’

(R)5’CCCACCGTTTAGGGAGCA3’

DM029：(F)5’FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3’

(R)5’ACGTTGTTGCTCGTAAAT3’，

PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。

2.根据权利要求1所述的大麻性别基因特异片段检验方法，其特征在于：

所述PCR反应体系的初始变性条件：92-98℃，2-11分钟；

变性条件：91-97℃，30秒钟-2分钟；

退火：54-66℃，30秒钟-2分钟，30循环；

延伸条件：69-75℃，1分钟；

终延伸：72℃，2分钟；

保温：4℃维持；

PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。

3.根据权利要求2所述的大麻性别基因特异片段检验方法，其特征在于：

所述PCR反应体系的初始变性条件：95℃，11分钟；

变性条件：94℃，30秒钟；

退火：60℃，30秒钟，30循环；

延伸条件：72℃，1分钟；

终延伸：72℃，2分钟；

保温：4℃维持；

PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。

4.根据权利要求2或3所述的大麻性别基因特异片段检验方法，其特征在于：

所述电泳采用荧光毛细管电泳技术。

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