KR101624026B1

KR101624026B1 - 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101624026B1
Application number: KR1020140020712A
Authority: KR
Inventors: 정희영; 이승열; 강인규; 백창기; 윤태명
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2016-05-25
Also published as: KR20150099142A

Abstract

본 발명은 사과갈색무늬병균 검출 또는 진단을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 사과갈색무늬병균을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트; 이를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 사과갈색무늬병균 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 등온증폭반응용 프라이머 세트는 사과갈색무늬병균(Marssonina coronariae)의 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있어, 이를 이용하는 경우 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 갈색무늬병균을 검출할 수 있다. 또한 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)를 이용하여 자연광 하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 또한, 갈색무늬병균이 감염된 잎의 건전부위에서도 갈색무늬병의 감염을 진단할 수 있다. 따라서 사과재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 갈색무늬병균을 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 갈색무늬병균 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting of Marssonina coronariae, and uses thereof}

본 발명은 사과갈색무늬병균 검출 또는 진단을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 사과갈색무늬병균을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트; 이를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 사과갈색무늬병균 검출 방법에 관한 것이다.

갈색무늬병(Marssonina blotch disease, apple blotch disease)은 사과, 장미 등의 잎에 발생하는 질병으로 발병한 나무에 조기 낙엽을 유발하는 농업적으로 심각한 질병이다. 발병 초기에는 잎에 갈색 또는 황갈색 반점이 생기며, 점차 확대되어 불규칙한 병반(病斑)을 형성하고 병반 가장자리는 황색 또는 녹색의 얼룩무늬가 생기는데, 병반 내부에 흑색의 포자퇴를 형성하고 그곳에서 생겨난 분생포자가 비, 바람 등에 의해 비산하여 건전한 나무에 다시 질병을 일으킨다. 특히 갈색무늬병을 일으키는 갈색무늬병균(Marssonina spp .)은 다른 식물 병원균과는 달리 식물에 침입한 후, 통상 3∼4주 또는 그 이상의 잠복기간을 거친 후 동시다발적으로 대량 발생하여 7∼8월경에 과수의 조기낙엽을 초래하여 국내 과수재배에 있어 심각한 피해를 끼치고 있다.

이러한 갈색무늬병에 대한 진단은 국내외를 막론하고 지금까지 잎에 발생하는 병징 관찰에 의한 육안진단법이 행하여져 왔다. 하지만, 앞서 설명한 바와 같이, 갈색무늬병균은 장기간의 잠복기간 후에 동시다발적으로 발생하기 때문에, 육안으로 진단가능한 정도로 질병이 진행된 식물은 치료가 불가능하기 때문에, 재배농가에 막대한 손실을 주고 있는 실정이다. 갈색무늬병에 의한 피해로 국내의 경우 2002년과 2012년 갈색무늬병이 전국적으로 대발생하여, 사과 수확량의 약 40% 이상을 감소시키며 사과 재배농가에 큰 경제적 피해를 초래하였다.

따라서 갈색무늬병의 피해를 최소화하기 위해서는 질병이 발병되기 이전에 약제처리에 의한 예방이 필수불가결하기 때문에, 갈색무늬병의 감염을 조기에 신속하게 진단할 수 있는 기술개발이 절실히 요구되어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 갈색무늬병의 감염을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였으며, 그 결과 사과갈색무늬병균(Marssonina coronariae) 증폭을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제작하고 상기 프라이머를 사용하여 적정 온도 범위의 등온에서 증폭하는 경우, 사과갈색무늬병을 정확하게 진단 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2013-0049765호 한국공개특허 제10-2013-0049754호

따라서 본 발명의 목적은 사과갈색무늬병을 효과적으로 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 사과갈색무늬병균을 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 이외에 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 사과갈색무늬병 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 시료마쇄용 튜브 용기; 플라스틱 균질기; 및 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료마쇄용 튜브 용기는 멸균증류수를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온증폭반응용 PCR 튜브는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온증폭반응은 58℃ 내지 60℃의 온도 조건에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 단계일 수 있다.

또한, 본 발명은 (ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 58℃ 내지 60℃에서 60분 내지 90분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 등온증폭반응용 프라이머 세트는 사과갈색무늬병균(Marssonina coronariae)의 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있어, 이를 이용하는 경우 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 갈색무늬병균을 검출할 수 있다. 또한 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)를 이용하여 자연광 하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 사과재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 갈색무늬병균을 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 갈색무늬병균 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1의 상부에서 1~3은 본 발명의 등온증폭반응법에서 사용된 검체를 나타낸 것으로, 1은 갈색무늬병균을 나타낸 것이고, 2는 갈색무늬병에 감염된 사과잎을 나타낸 것이며, 3은 비감염된 건전 사과잎을 나타낸 것이다. 또한 하부에서 A는 상기 각각의 검체(갈색무늬병균, 이병잎 및 건전잎)를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 일정한 온도에서 유전자를 증폭한 후 전기영동결과를 나타낸 사진이며, B는 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)으로 염색한 결과이다.
도 2는 사과갈색무늬병 진단용 등온증폭반응의 적정온도를 설정하기 위하여 다양한 온도별 등온증폭반응 산물의 전기영동결과를 나타낸 것이다(M: 100 bp DNA ladder, 1: 50℃, 2: 52℃, 3: 54℃, 4: 56℃, 5: 58℃, 6: 60℃, 7: 65℃).
도 3은 본 발명의 사과갈색무늬병 진단용 등온증폭반응법의 현장진단을 위한 키트의 사용 프로토콜을 간략하게 나타낸 모식도이다.

본 발명은 사과갈색무늬병(Marssonia blotch disease, apple blotch disease)을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 사과갈색무늬병을 일으키는 사과갈색무늬병균(Marssonina coronariae, 완전세대: Diplocarpon mali)만을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다.

본 발명에서 “특이적”이라는 용어는 사과갈색무늬병을 일으키는 병원체에 해당하는 사과갈색무늬병균(Marssonina coronariae, 완전세대:Diplocarpon mali)에 해당하는 종만을 표적하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 사과갈색무늬병균(M. coronariae) 종 특이적 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 영역을 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머이다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 사용하였다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또한, 상기 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트 이외에 추가로 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 사과갈색무늬병 진단을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 “시료마쇄용 튜브 용기”라는 용어는 마쇄 시 식물체 시료를 담을 수 있는 용기를 의미하며, 여기에 멸균증류수가 포함될 수 있다.

본 발명에서 “플라스틱 균질기”는 식물체 시료를 마쇄하는 도구를 의미한다.

본 발명에서 “등온증폭반응용 PCR 튜브 용기”는 등온증폭반응을 시행하기 위한 용기를 의미하며, 여기에 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 분자유전학적 기법인 등온증폭반응을 이용하여 사과갈색무늬병균(M. coronariae) 종 특이적 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 영역을 증폭하여 기존의 PCR처럼 온도의 증감 없이 일정한 온도에서 증폭반응을 진행하여 사과갈색무늬병을 신속하고 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 식물체 검체는 감염이 의심되는 사과잎을 사용할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 사과갈색무늬병균(M. coronariae) 종 특이적 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 영역의 표적 서열을 증폭할 수 있다. 상기 등온증폭반응은 58℃ 내지 60℃ 범위에서 60분 이내에 수행될 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한, 사과 재배농가에서 보다 편리하게 사과갈색무늬병균을 검출하기 위하여, (ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계; (ⅱ) 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4의 등온증폭반응용 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 58℃ 내지 60℃에서 60분 내지 90분 동안 방치시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 통해 사과갈색무늬병균을 검출할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

사과갈색무늬병균의 종 특이적 유전자 증폭을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 개발

미국 국립생물공학정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터 베이스에 등록된 Marssonina속 곰팡이에 등록된 각 유전자들을 수집한 후 Marssonina 속 곰팡이에 등록된 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자들과 multiple alignment를 통해 갈색무늬병균(M. coronariae) 종 특이적 메탈로펩티다제(metallopeptidase) 유전자 염기서열을 분석(서열번호 5)을 분석한 결과, 약 814bp 크기의 DNA 단편에 해당하였으며, 이를 단백질로 변환하여 확인한 결과 partial sequence of metallopeptidase(putative domain 포함)로 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 상기 과정을 통해 규명된 서열번호 5로 표시되는 갈색무늬병균(M. coronariae) 종 특이적 시퀀스를 이용하여, 본 발명의 갈색무늬병균을 검출, 진단할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 하기 표 1과 같이 제작하였다.

본 발명의 사과갈색무늬병균 검출/진단을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트

Primer name	Sequence(5‘-3’)	Orientation	Length(mer)	서열번호
Mar-F3	GCT TAT CTC TGG CAA GCC TT	F(forward)	20	1
Mar-B3	CAC AGT CTT GGA GCA TCG T	R(reverse)	19	2
Mar-FIP*	CGG TGC ATT TGT TCG GCC TAG ATT TTT CAA AAT TGC CTA GCA CGG GA	F	47	3
Mar-BIP*	AGA GTG GAC ACA GGG TAC AGC GTT TTT TGC TTC GGA ACG CAT CAC	R	45	4

*FIP : forward inner primer, BIP : backward inner primer

< 실시예 2>

검체의 채집

갈색무늬병균, 갈색무늬병 감염잎, 건전 사과잎을 채집하여 전체 게놈 DNA를 추출하고 이후 등온증폭반응법의 주형(template)으로 사용하였다.

자세하게는, 4월 이후 사과나무에서 사과잎을 무작위로 채집한 뒤 300μl 멸균증류수를 포함하는 시료마쇄용 1.5ml 튜브에 넣고 마쇄한 후, 공경 0.45μm 필터로 마쇄액의 불순물을 제거하였으며, 이렇게 불순물이 제거된 여액의 상층액을 하기 실험에서 주형(template)을 위한 시료로 사용하였다.

또한 상기에서 사용한 갈색무늬병균은 본 연구실에서 이병 사과잎에서 분리한 균주를 사용한 것으로서, 전체 게놈 DNA 추출방법은 Liu 의 방법 (Liu et al., 2000; Rapid Mini-Preparation of Fungal DNA for PCR)의 방법에 준하여 추출하였다. 간략하게는, 하기와 같은 과정으로 추출하였다.

[ total genomic DNA 추출방법]

① 갈색무늬병 감염잎 0.1 g을 막자사발에 넣고, 500 ㎕ lysis buffer을 첨가하여 마쇄하여 1.5 ㎖에 포집함. 포집한 1.5 ㎖를 상온에서 10분간 방치함.

② 150 ㎕ sodium acetate (3M, pH 4.8)를 첨가하고 vortex mixer로 잘 섞음.

③ 10,000 X gravity에서 1분간 원심분리를 실시하고, 상청액을 새로운 1.5 ㎖ tube로 옮김.

④ 새로 옮긴 상청액을 한번 더 10,000 X gravity에서 1분간 원심분리함.

⑤ 상청액을 새로운 1.5 ㎖ tube로 옮긴 후 상청액과 동량의 2-propanol을 첨가하고 10,000 X gravity에서 3분간 원심분리함.

⑥ 1.5 ㎖ tube 아래쪽에 pellet를 확인하고, 상청액을 모두 버림.

⑦ 500 ㎕ 70 % ethanol을 첨가하고, 10,000 X gravity에서 3분간 원심분리함.

⑧ Pellet를 확인하고 상청액을 모두 버림. 증발기를 이용하여 10분간 pellet를 건조시킴(혹은 clean bench 내부에서 1시간 이상 건조함).

⑨ 건조된 pellet에 50 ㎕ TE 혹은 멸균증류수를 첨가하여 pellet를 용해함.

< 실시예 3>

등온증폭반응법의 시행 및 유용성 확인

상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 사과갈색무늬병균을 검출하는데 사용 가능한지를 확인하기 위하여, 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다. 이의 조성과 반응조건은 하기 표 2에서 나타내었다.

갈색무늬병균 증폭용 반응 조성물

내용물	용량(μl)
10× Bst polymerase buffer	2.5
10mM dNTP mixture	0.5
F3 primer (10 pmole)	0.4
B3 primer (10 pmole)	0.4
FIP primer (40 pmole)	1.6
BIP primer (40 pmole)	1.6
Bst polymerase (8 unit/μl)	1
template	1
멸균증류수	16
최종 용량	25 μl

상기 표 2의 조성으로 제조된 증폭 반응 조성물을 60℃의 반응 용기(waterbath)에서 60분 동안 방치하였다. 반응이 완료된 후에는 총 25μg의 반응물 중 10μl를 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지를 확인하였다. 이후 동일한 반응물로 반응(60℃, 1시간)시킨 후에 10,000배로 농축된 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain<invitrogen>을 반응물 25μl 당 0.5μl씩 첨가하여 발색 반응을 확인하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 갈색무늬병균과 갈색무늬병 감염잎에서 특이적인 DNA ladder 현상을 확인할 수 있었으며, 또한 DNA ladder 현상이 확인된 튜브에서 특이적으로 발색되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머 세트의 유의성을 입증할 수 있었다.

< 실시예 4>

등온증폭반응법( Loop mediated isothermal amplification : LAMP )의 적정 반응 온도 결정

등온증폭반응의 적정온도 범위를 최적 반응온도를 설정하기 위해 50, 52, 54, 56, 58, 60, 65℃로 각각 등온조건을 유지하고 실험을 수행하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 등온증폭반응 산물이 DNA ladder 현상을 보이는 시험구는 58℃ 및 60℃임을 확인할 수 있었다. 따라서 갈색무늬병 진단용 등온증폭반응법의 적정 온도범위는 58~60℃로 설정하였다.

< 실시예 5>

사과갈색무늬병 진단용 등온증폭반응법의 현장진단을 위한 키트 개발

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머 세트를 사과재배 지역에 적용하기 위해, 현장진단에 사용될 키트 구성품을 자체 개발하였으며, 이에 맞는 사용 프로토콜을 작성하였다.

<5-1> 키트 조성

① 시료마쇄용 1.5ml 튜브: 마쇄 시 식물체 시료를 담을 수 있는 용기로서 300μl 멸균증류수를 포함함

② 플라스틱 균질기: 식물체 시료를 마쇄하는 도구

③ LAMP 반응용 PCR 튜브: 등온증폭반응을 시행하기 위한 용기로서 상기 표 2의 조성물(단, template를 제외) 24μl를 포함함

<5-2> 프로토콜

① 마쇄 단계: 감염이 의심되는 식물체 시료를 채집한 뒤 시료마쇄용 1.5ml 튜브에 식물체 시료를 첨가한 다음, 플라스틱 균질기를 이용하여 마쇄함

② 반응 단계: LAMP 반응용 PCR 튜브에 상기 마쇄단계에서 제조된 마쇄액을 1방울 첨가한 뒤 60℃에서 60분간 방치함

③ 결과확인 단계: 상기 반응단계를 거친 반응액에 10,000배로 농축된 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 0.5μl 첨가한 뒤 형광색 발색 반응이 나타나면 갈색무늬병균 감염이라 판단하며, 주황색 발색 반응이 나타나면 비감염이라 판단함

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting of Marssonina coronariae, and uses thereof <130> PN1402-043 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mar-F3_outer forward primer <400> 1 gcttatctct ggcaagcctt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mar-B3_outer reverse primer <400> 2 cacagtcttg gagcatcgt 19 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mar-FIP_inner forward primer <400> 3 cggtgcattt gttcggccta gatttttcaa aattgcctag cacggga 47 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mar-BIP_inner reverse primer <400> 4 agagtggaca cagggtacag cgttttttgc ttcggaacgc atcac 45 <210> 5 <211> 814 <212> DNA <213> partial polynucleotide sequence of Marssonina coronariae's metallopepdiase gene <400> 5 cgcgcgaagc tgactatgaa caggtttcgc agaagattat ctccgtttct gggattattg 60 ctgatccagc tgtccaggca ttggaaggat gtgtcaccgt cagacgagca gacgatggct 120 tcccctcaac ggattggccc gtgtgcgaat cccacttcaa ggcgctcatt tttcttttcc 180 ccggaccgaa caggctgaga tttgatttta cgtcgccgaa actcgccaac aataatacca 240 gcaaccccat acactcctca tatattacta tacacatgat cccccccctt gcatccccgc 300 cgttacagct tgccattctc atgggcaagg actctccggg gacgtttgat gcctgcccac 360 aacgggtgga gaaggaggga aataaccttg caacggcaat ccagaaattc agaatggcgg 420 cttatctctg gcaagccttt accgtaggtt gctcaaaatt gcctagcacg ggagaatctc 480 aagtaacagt cgagatctag gccgaacaaa tgcaccggaa caagcttggg aggcgttgct 540 ggagggtaga agaagagtgg acacagggta cagcgagcat tcgagatcaa gcgactgggg 600 tgatgcgttc cgaagcaaga atccacgtga tacgatgctc caagactgtg gcggaactgc 660 gtgatttgga cattgcacag caaaaccctc aggctaagaa tagcggcggg ctcttcagta 720 ttgccttgga agctgtcaag gactacttta agccattgcc tgggcagaag caatatgtgt 780 ccgtgctgtt gctcgacgca cactgggaca aggc 814

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는, 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병 진단용 조성물.
제2항의 조성물을 포함하는 사과갈색무늬병 진단 키트.
제4항에 있어서,
상기 키트는 시료마쇄용 튜브 용기; 플라스틱 균질기; 및 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병 진단 키트.
제5항에 있어서,
상기 시료마쇄용 튜브 용기는 멸균증류수를 포함하는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병 진단 키트.
제5항에 있어서,
상기 등온증폭반응용 PCR 튜브 용기는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 프라이머로 구성되는 사과갈색무늬병을 진단하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트; 등온증폭 반응용 DNA 중합효소; dNTPs; 반응버퍼 및 증류수를 포함하는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병 진단 키트.
(a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 58℃ 내지 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법.
(ⅰ) 감염의심 식물체 시료를 마쇄하는 단계;
(ⅱ) 제3항의 사과갈색무늬병 진단용 조성물에 상기 (ⅰ) 단계에서 제조된 마쇄액을 첨가한 후 58℃ 내지 60℃에서 60분 동안 방치시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계가 완료된 반응물에 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(10,000X concentrate in DMSO, invitrogen)을 처리한 후 육안으로 형광색 발색 유무를 확인하는 단계를 포함하는 사과갈색무늬병균을 검출하는 방법.