ES2960514T3 - Procedimiento y kit para la identificación de Vaccinium myrtillus - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona un método para la identificación de Vaccinium myrtillus en una composición botánica y un kit diseñado específicamente para su implementación. El método de la invención se basa en la detección, utilizando amplificación por PCR, de fragmentos de ácido nucleico dentro de una región genómica de Vaccinium myrtillus, concretamente la región genómica dentro del espaciador interno transcrito 1, la región genómica del ARN ribosomal 5.8S y el espaciador interno transcrito 2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento y kit para la identificación deVaccinium myrtillus
La presente invención proporciona un procedimiento para la identificación deVaccinium myrtillusen una composición botánica, que se basa en la detección de fragmentos genómicos específicos mediante amplificación por PCR. La invención proporciona además un kit específicamente diseñado para aplicar el procedimiento de la invención.
Antecedentes de la invención
Los extractos vegetales se utilizan ampliamente en la industria médica, nutracéutica, cosmética y alimentaria. Uno de los principales problemas que se plantean al tratar con extractos vegetales es el de determinar no sólo su composición química, sino también su origen botánico, para excluir el riesgo de falsificación.
Los procedimientos basados en la genética para determinar el origen botánico de los materiales vegetales son conocidos en la técnica (Parker, J., et al., Field-based species identification of closely-related plants using real-time nanopore sequencing). Sci Rep, 2017. 7(1): p. 8345; Group, C.PW., A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(31): p. 12794-7; Fazekas, A.J., et al., DnA barcoding methods for land plants. Methods Mol Biol, 2012. 858 (223). Dichos procedimientos se basan en la comparación del ADN presente en el material vegetal con secuencias de ADN conocidas presentes en bases de datos de acceso público. Por ejemplo el documento WO 2006/020147 (The Regents of the University of California) desvela un procedimiento para identificar componentes genéticos biológicos individuales presentes en una mezcla botánica, basándose dicho procedimiento en una combinación de PCR específica de locus genómico, polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) y análisis de secuencias. Se dice que el procedimiento es capaz de proporcionar información sobre los componentes biológicos de la composición sin requerir un conocimiento previo sobre qué botánicos pueden estar presentes y de detectar e identificar componentes biológicos desconocidos que puedan estar presentes en la mezcla.
También se desvela procedimientos para la identificación genética de plantas a partir de muestras botánicas en CN102146477, CN106119394, CN1372005, CN107142329, CN107653330, CN105624291, CN105603107, ES21 76066, CN104673930, CN102222969, CN102732513, CN105063203, JP2007282626. En algunos casos, los procedimientos para la identificación de especies botánicas se basan en la detección, mediante amplificación por PCR, de secuencias específicas localizadas dentro del locus codificador del ARN ribosómico nuclear que contiene las regiones ITS-1 y/o ITS-2 del espaciador transcrito interno (ITS). En algunos casos (CN1052429, CN105603107, ES2176066), los procedimientos tienen por objeto identificar adulteraciones en productos comercializados que contienen materiales vegetales.
Jaakola L et al., Food Chemistry vol. 123, no. 2 (2010) pp. 494-500divulga la identificación de especies de bayas comercialmente importantes mediante un enfoque combinado de código de barras de ADN y análisis HRM (High Resolution Melting), utilizando pares de cebadores diseñados que permiten la identificación específica de especies de bayas silvestres.Vaccinium myrtillusse identifica mediante el análisis HRM de un amplicón localizado en la región ITS (Internal Transcribed Spacer) obtenido con los cebadores ITSVm2f e ITSVm2r.
El documento CN108642207 desvela la construcción de un mapa alélico de la planta de arándano, y un procedimiento para la identificación de variedades de arándano y especies afines utilizando la amplificación p Cr con cebadores específicos.
Marieschi M. et al, Food Chemistry vol. 202 (2016) pp. 438-444 desvela un procedimiento basado en Regiones Amplificadas Caracterizadas por Secuencia (SCAR) para detectar la presencia de V. myrtillus y especies adulterantes útil para el análisis de múltiples lotes.
Koskima Ki JJ et al., European Journal of Plant Pathology, Kluwer Academic Publishers - vol. 125 no. 4 (2009) pp. 629 640 divulga la expresión relativa de genes de arándano cuantificados por PCR en tiempo real con SYBR-verde como reportero fluorescente.
Cuando los materiales vegetales se procesan y, en particular, cuando se someten a procedimientos de extracción, el ADN se degrada dando lugar a fragmentos de tamaño y cantidad variables en función del procedimiento de extracción y que no pueden compararse directamente con secuencias de ADN conocidas, lo que dificulta, si no imposibilita prácticamente, la aplicación a los extractos de los procedimientos de identificación genómica que pueden aplicarse a los materiales de partida.
Los extractos deVaccinium myrtillusse utilizan ampliamente en productos farmacéuticos, cosméticos, nutracéuticos y dietéticos debido a sus conocidas propiedades beneficiosas para la salud. Los beneficios clínicos delV.myrtilluscomo suplemento dietético y terapéutico se han atribuido a la presencia de abundantes cantidades de flavonoides y antocianinas. Para los fabricantes de extractos, es importante garantizar que los extractos deV. myrtilluscumplen las especificaciones requeridas en cuanto a componentes químicos y origen botánico puro declarado. Por lo tanto, sería deseable proporcionar un procedimiento que permita identificarV. myrtillusen una composición botánica, por ejemplo, en un extracto vegetal, asegurando altos niveles de precisión y especificidad de especie, particularmente cuandoV. myrtillusestá en mezcla con especies contaminantes estrechamente relacionadas.
Descripción de la invención
Estos objetivos se logran mediante la presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, y que proporciona un procedimiento para la identificación específica y precisa deVaccinium myrtillusen una composición botánica mediante la detección de un fragmento de ácido nucleico que está contenido en el ADN residual de extractos deV. myrtillus.
Específicamente, el procedimiento de la invención comprende detectar, en una muestra de composición botánica, un fragmento de ácido nucleicoespecífico de V. myrtilluslocalizado dentro del espaciador transcrito interno 1, el gen de ARN ribosómico 5.8S y el espaciador transcrito interno 2, en el que dicho fragmento de ácido nucleico consiste en SEQ ID NÚM.:1 o una secuencia que comprende SEQ ID NÚM.: 1 que se selecciona del grupo de SEQ ID NÚM.:2, 3 y 4.
De acuerdo con la presente invención, los cebadores utilizados para la amplificación por PCR se seleccionan entre los siguientes pares:
(i) SEQ ID NÚM.:5 y SEQ ID NÚM.:6;
(ii) SEQ ID NÚM.:7 y SEQ ID NÚM.:8;
(iii) SEQ ID NÚM.:9 y SEQ ID NÚM.: 10;
(iv) SEQ ID NÚM.: 11 y SEQ ID NÚM.: 12;
De acuerdo con la presente invención, la PCR es una PCR en tiempo real (rtPCR) y el procedimiento de invención comprenden las siguientes etapas:
(a) aislar ácidos nucleicos de una muestra de composición botánica;
(b) realizar una rt-PCR en los ácidos nucleicos aislados, utilizando:
o un par de cebadores seleccionados del grupo que consiste en:
(i) SEQ ID NÚM.:5 y SEQ ID NÚM.:6;
(ii) SEQ ID NÚM.:7 y SEQ ID NÚM.:8;
(iii) SEQ ID NÚM.:9 y SEQ ID NÚM.: 10;
(iv) SEQ ID NÚM.: 11 y SEQ ID NÚM.: 12; y
o una sonda de recocido dentro de la región de ácido nucleico amplificada por los cebadores, dicha sonda tiene la secuencia SEQ ID NÚM.: 13;
(c) determinar la presencia del producto de amplificación,
por lo que la detección del producto de amplificación es indicativa de la presencia deVaccinium myrtillusen la composición botánica.
De acuerdo con la invención, la composición botánica es una mezcla de plantas o partes de las mismas, por ejemplo, hojas, frutos, corteza, raíces, incluidos extractos vegetales y, en particular, extractos de frutos, destinados al consumo o a un uso terapéutico. En una realización preferente, la composición botánica es un producto que contiene un extracto de frutos deVaccinium myrtillus,solo o en combinación con especies afines comoEmpetrum nigrum, Sambucus nigra, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium corymbosumyVaccinium macrocarpon.
El aislamiento de ácidos nucleicos implica su separación y purificación de otros componentes de la mezcla o extracto vegetal y puede realizarse con técnicas convencionales utilizando kits disponibles en el mercado. En particular, el ADN genómico puede aislarse mediante protocolos de extracción-precipitación o procedimientos basados en membranas de sílice o de intercambio aniónico.
La tecnología PCR en tiempo real es conocida en la técnica y combina la química de la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de moléculas reporteras fluorescentes para supervisar la producción de productos de amplificación durante cada ciclo de la reacción PCR. La amplificación del ADN diana se obtiene mediante ciclos repetidos de desnaturalización seguidos de recocido del cebador y la sonda y de extensión del cebador catalizada por la ADN polimerasa. La amplificación del ADN se controla en cada ciclo de la PCR midiendo una señal fluorescente producida, por ejemplo, por colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con el ADN de doble cadena o por sondas de ADN específicas de secuencia consistentes en oligonucleótidos marcados con un reportero fluorescente que permite la detección tras la hibridación de la sonda con su ADN diana complementario. Entre los colorantes intercalantes adecuados se incluyen SYBR® (Verde I, Verde II, Oro), LCGreen®,Sy TO-(9,13, 16, 60, 62, 64, 82), BOBO-3, LCGreen®, POPO-3,b EbO,TO-PRO3,PicoGreen®, SYTOX Naranja y colorantes fluorescentes similares disponibles en el mercado (fluoróforos).
La sonda de oligonucleótido está marcada con un reportero fluorescente (fluoróforo) en un extremo y un inactivador de fluorescencia en el extremo opuesto de la sonda. La actividad exonucleasa 5' de la polimerasa escinde la sonda liberando la molécula informadora, lo que provoca un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Los ejemplos de fluoróforos incluyen 5- o 6-carboxifluoresceína (5- o 6-FAM), tetraclorofluoresceína (TET), hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína succinimidiléster (JOE), tetrametilrhodamina (TAMRA), 5-carboxitetrametilrhodamina (TAMRASE), carboxi-X-rhodamina (ROX), ácido 4-(dimetilaminoazo)benceno-4-carboxílico (DABCYL). Algunos ejemplos de inactivadores son los de la familia BHQ (Black Hole Quencher®), NFQ-MGB (inactivador no fluorescente y aglutinante de surco menor), éster succinimidílico de ácido carboxílico QSY 7 o 21.
Los parámetros y condiciones de la rtPCR, tal como la temperatura y la duración de cada ciclo de desnaturalización y recocido, pueden ajustarse en función del fragmento de ácido nucleico a amplificar, del conjunto de cebadores utilizados en la amplificación y de otras variables, como sabe cualquier experto en la técnica. En una realización preferente de la invención, los fragmentos de ácido nucleico desvelados en la presente memoria se amplifican con los cebadores (i) a (iv) aplicando las siguientes condiciones:
- etapa inicial de desnaturalización a 95°C durante 180 seg
- ciclos de 2 etapas de 15 s a 95 °C (1° etapa) y 15 s a 62-68,5 °C (2° etapa) repetidos de cuarenta (40) a cincuenta (50) veces.
Las combinaciones específicas de cebadores y sonda de acuerdo con la invención permiten la identificación específica deVaccinium myrtillusen composiciones botánicas que contienen especies estrechamente relacionadas tal comoEmpetrum nigrum, Sambucus nigra, Vaccinium oxycoccos, Vaccinium corymbosumyVaccinium macrocarpon.Como se informó en la sección experimental, el uso de una sonda diferente de la sonda específicade Vaccinium myrtillusSEQ ID NÚM.:13 y del mismo modo el recocido con fragmentos SEQ ID NÚM.:1-4, suprime la capacidad del sistema para identificarVaccinium myrtillusen mezcla conEmpetrumutilizando los mismos cebadores y condiciones rt-PCR desvelados anteriormente. Esto denota la especificidad de la combinación seleccionada de cebadores, sonda y la eficacia de las condiciones de rtPCR de acuerdo con la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la identificación deVaccinium myrtillusen una composición botánica. El kit de la invención comprende al menos un par de cebadores seleccionados de (i) a (iv) y la sonda como se ha definido anteriormente. Además, el kit puede comprender, en recipientes separados, los reactivos necesarios para realizar la (rt)PCR, en particular los desoxinucleótidos y la ADN polimerasa, y los reactivos para aislar, purificar y, opcionalmente, cuantificar el ADN. El kit también puede contenera DndeVaccinium myrtilluscomo control positivo y agua o tampón libre de nucleasas como control negativo, así como un folleto con las instrucciones para realizar el ensayo PCR.
En una realización preferente de la invención el kit contiene:
- un tubo o vial que contenga todos los reactivos necesarios para realizar el análisis (ADN polimerasa, dNTPs, tampón, química de sonda, cebadores y sonda)
- un tubo o vial que contenga el control positivo (ADN deVaccinium myrtillus)
-un tubo o vial que contenga el ADN de control negativo (agua libre de nucleasas) El kit puede utilizarse con todos los sistemas de PCR en tiempo real disponibles en el mercado.
Descripción de las figuras
Figura 1:Protocolo de amplificación rt-PCR.
Figura 2:Resultados de la amplificación rt-PCR (a) y análisis de la curva de fusión (b) del ADN genómico aislado de frutos congelados deVaccinium myrtillus.
Figura 3:Análisis de la curva estándar paraVaccinium myrtillus.
Figura 4:Amplificación rt-PCR basada en sonda con sonda M-FAM específica paraV. myrtillusNTC: control negativo.
Figura 5:(a) Amplificación rt-PCR basada en sonda con sonda M-FAM específica paraV. myrtillusen una mezcla de muestras con una proporción indicada en la leyenda. NTC: control negativo; (b) Amplificación rt-PCR basada en sonda con sonda E-HEX específica paraE. nigrumen una mezcla de muestras con una proporción indicada en la leyenda. NTC: control negativo.
Figura 6:Correlación entre la media de Cq y el porcentaje de especies diana paraV. myrtillus.
Figura 7:Esquema experimental utilizado para el análisis rt-PCR de muestras de extracto seco.
Figura 8:Amplificación rt-PCR de ADN residual aislado de muestras de extracto seco deVaccinium myrtillus.El control positivo es el ADNg extraído de frutos congelados deVaccinium myrtillus. a) Primer conjunto L; b) Primer conjunto S.
Figura 9:Análisis en gel de agarosa de los amplicones de rt-PCR.
Figura 10:Análisis de alineación de los amplicones secuenciados (arriba) y matriz de identidad de secuencia relativa (abajo).
Figura 11:rt-PCR deVaccinium myrtillusE. ET 36 % Amplificación y curvas de fusión.
Figura 12:rt-PCR deVaccinium myrtillusE. ET. 36% con el procedimiento basado en sondas. PTC: control positivo (ADNg extraído de frutos congelados deV. myrtillus);NTC: control negativo.
SECCIÓN EXPERIMENTAL - procedimientos generales
Extracción de ADN genómico (ADNg)
La extracción de ADN se llevó a cabo utilizando el protocolo NucleoSpin® plant II descrito por el proveedor (Macherey nagel. Cat. 740770.250 - July 2014/Rev.09).
Purificación del ADN residual a partir del extracto seco.
La primera purificación se realizó utilizando el protocolo del kit NucleoSpin® plant II Maxi tal y como describe el proveedor (Macherey nagel. Cat. 740770.250 - July 2014/Rev.09), con algunas modificaciones que se indican a continuación.
- Pesar 3-5 g de extracto seco en un tubo cónico de 50 ml
- Añadir 3 ml de agua destilada
- Añadir 9 ml de tampón de lisis
- Agitar por vortex durante 30 segundos
- Transferir la muestra a un filtro NucleoSpin® Maxi
- Centrifugar 5 min a 4500 x g, recoger el flujo transparente y desechar el filtro NucleoSpin Maxi
- Añadir 20 ml de tampón de unión
- Agitar por vortex durante 30 seg.
- Cargar la muestra en una columna NucleoSpin® Plant II Maxi
- Centrifugar durante 3 min a 4500 x g y desechar el flujo.
- Repetir la carga para toda la muestra en reposo
- Añadir 4 ml de tampón de lavado (PW1) a la columna NucleoSpin® Plant II Maxi
- Centrifugar durante 3 min a 4500 x g y desechar el flujo.
- Añadir 10 ml de tampón de lavado (PW2) a la columna NucleoSpin® Plant II Maxi
- Centrifugar durante 3 min a 4500 x g y desechar el flujo.
- Añadir 2 ml de tampón de lavado (PW2) a la columna NucleoSpin® Plant II Maxi
- Centrifugar durante 12 min a 4500 x g y desechar el flujo.
- Colocar la columna NucleoSpin® Plant II Maxi en un nuevo tubo de recolección (50 ml)
- Pipetear 1000 j l de tampón de elución (PE) (65°C) sobre la membrana.
- Incubar la columna NucleoSpin® Plant II Maxi durante 5 min a 65°C
- Centrifugar durante 3 min a 4500 x g para eluir el ADN
La segunda purificación se realizó mediante el protocolo del kit ReliaPrep™ DNA Clean-UP and Concentration System, tal como describe el proveedor (Promega. Cat. A2893).
Cuantificación del ADN
El ADN se cuantificó mediante el instrumento NanoQuant Plate™. La cuantificación se realizó mediante el procedimiento UV. La absorbancia a 260 nm se utilizó para cuantificar el ADN, ya que 1 DO a 260 nm corresponde a 50 jg / j l de ADN. Se determinó la relación de absorbancia 260 nm/280 nm para evaluar la pureza del ADN.
rt-PCR y análisis de la curva de fusión
La amplificación rt-PCR se llevó a cabo utilizando la química basada en SYBR Verde o sonda, tal como describe el proveedor (SsoAdvanced™ Universal SYBR®Green Supermix, BioRad Cat. N. 1725272; SsoAdvanced™ Universal Probes Supermix, BioRad Cat. N. 1725281), con un protocolo de amplificación basado en 3 etapas, como se indica en laFigura 1.
PCR en tiempo real
Preparar la mezcla de la siguiente manera, volumen final 20 jl:
Cargar la muestra en un instrumento de tiempo real (BioRad o equivalente) y ajustar el siguiente procedimiento:
Adquisición tras la segunda etapa de ciclado.
Secuenciación del ADN
El ADN amplificado se purificó en gel de agarosa y el fragmento purificado se secuenció mediante la generación de dos secuencias para cada muestra: una se genera utilizando el cebador directo y la otra utilizando el cebador inverso. Cada tubo de secuenciación se preparó mezclando el ADN purificado y TRIS-HCl 5 mM pH 8,0 para obtener la concentración solicitada para la secuenciación (en función de la longitud de la secuencia, 2-5 ng/jL).
Las secuencias se analizaron utilizando el software BioEdit o BLAST para comparación e identificación.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Validación del procedimiento
Se purificó y cuantificó el ADNg (Tabla 1) para la fruta congelada deVaccinium myrtillus ysus especies contaminantes/relacionadas que se indican a continuación:
Tabla 1.Cuantificación del ADNg extraído para todas las especies analizadas en el presente informe.
La configuración de los parámetros de la reacción rt-PCR, en términos de Cq (ciclo de cuantificación) y pico Tm (temperatura de fusión), se evaluaron inicialmente utilizando el ADNg extraído de la fruta congelada deVaccinium myrtillus(Figura 2). Los resultados de la rt-PCR mostraron que los cebadores diseñados permiten la amplificación de una única región de ADN para todos los conjuntos de cebadores (Tablas 2 y 3).
Tabla 2
Tabla 3
La rt-PCR también se realizó con ADN aislado de especies contaminantes/relacionadas deV. myrtillusy los resultados mostraron que es posible distinguir los diferentes ADN utilizando los conjuntos de cebadores y, en particular, los cebadores pequeños 2 (Tabla 4).
Tabla 4-Resultados de los picos de la curva de fusión
La linealidad de la curva de amplificación también se evaluó con la generación de la curva estándar paraVaccinium myrtillusutilizando el conjunto de cebadores pequeños 2(Figura 3). Se puede observar que la linealidad ha quedado garantizada en el intervalo de concentración ensayado (casi 0,0625 - 8,0o ng/pl).
Con el fin de mejorar la capacidad del procedimiento para distinguir entreVaccinium myrtillusy especies contaminantes/relacionadas, la rtPCR se llevó a cabo con la sonda Minor Groove Binding-Probe (M-FAM -SEQ ID NÚM.: 13) diseñado específicamente para permitir la amplificación de secuencias deV. myrtillus.
En un experimento comparativo, la rtPCR se realizó con el uso simultáneo de las sondas de unión a surco menor SEQ ID NÚM.: 13 (M-FAM) y SEQ ID NÚM.: 14 (E-HEX).
Para probar el procedimiento basado en la sonda se han llevado a cabo diferentes subconjuntos de experimentos, resumidos en la siguiente tabla.
Tabla 5
Los resultados de amplificación fueron proporcionales al contenido de la especie diana(Figura 6).
Ejemplo 2 - Identificación del ADN residual del extracto seco deVaccinium m yrtillus
Para cada muestra, se realizaron dos aislamientos independientes de ADN residual (réplicas biológicas) y para cada ADN extraído se probaron tres réplicas técnicas,Figura 7.
Todo el procedimiento se realizó inicialmente con cuatro muestras: 32549/H76, 32549/H80, 32549/H83, 32549/H84. Tras el aislamiento y la cuantificación del ADN residual(Tabla 6), se analizaron las características de amplificación de estas muestras mediante rt-PCR (Cq y Tm) en comparación con las del control positivo(Figura 8 y Tabla 7).
Tabla 6 - Cuantificación del ADN residual
Tabla 7 - Resumen de los resultados de rt-PCR
Los resultados de la amplificación rt-PCR con todas las muestras mostraron que:
- se amplificó el ADN del control positivo y de todas las muestras analizadas;
- el control negativo (sin ADN) no mostró ninguna señal de amplificación;
- el control positivo y las muestras mostraron valores iguales para los picos de Tm.
Este resultado indica que los amplicones tienen las mismas características en términos de longitud y/o composición de bases nucleotídicas.
Además, los resultados de Cq están correlacionados con la cantidad de ADN analizada, lo que significa que la amplificación es específica para la diana seleccionada.
Para verificar si los amplicones generados tienen la misma secuencia del control positivo, todas las secuencias amplificadas se purificaron en gel de agarosa(Figura 9) y los fragmentos purificados se secuenciaron(Figura 10). El análisis en gel de agarosa confirmó las diferencias de longitud de los amplicones: el fragmento generado con el conjunto de cebadores S muestra una longitud de aproximadamente 130 pb, mientras que el fragmento generado con el conjunto de cebadores L muestra una longitud de aproximadamente 270 pb. Además, a partir del análisis del gel de agarosa es posible también observar la presencia de productos rt-PCR no específicos, como enla Figura 9,carril 4 para la muestra 32549/H83_1 en que son visibles dos bandas, en buena concordancia con los resultados del pico Tm(Figura 8, b).
Todas las secuencias generadas se alinearon considerando únicamente la parte con parámetros de secuenciación de alta calidad. Los resultados de la secuenciación(Figura 10) mostraron que todas las secuencias de amplicones (pequeños y grandes) son idénticas a la secuencia de la referencia estándarVaccinium myrtillus.
Ejemplo 3 - Identificación del ADN residual del extracto etanólico seco deVaccinium m yrtillusal 36% (E. ET.)El análisis del ADN residual también se realizó en muestras con código Indena 9042202, MIRTILLO (V. MYRTILLUS) E. ET 36% tras la fase de mezcla de polvo seco, 32788/M1,32786/M2, 32788/M2. Las muestras anteriores 32549/H76, 32549/H80 y 32549/H83 se probaron nuevamente como muestras de control.
Para optimizar el procedimiento de purificación, tras la primera etapa de purificación del ADN, el ADN residual aislado se procesó con un Kit ReliaPrep™ (Promega). Los resultados en términos de cantidad de ADN (ng/ pL) y calidad (relación 260/280) en las dos etapas de purificación (Tabla 8) revelaron que tanto la concentración como la purificación son mejores introduciendo la segunda etapa.
Tabla 8 - Cuantificación del ADN residual - E. ET. 36%
El análisis rt-PCR se realizó utilizando SYBR verde(Figura 11) y procedimientos basados en sondas(Figura 12), de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente.
Los resultados indican que:
(a) todas las muestras analizadas mostraron el mismo pico de Tm del control positivo(Figura 11yTabla 9) cuando se analizaron con el procedimiento SYBR verde:
Tabla 9 - Resultados resumidos de rt-PCR, procedimiento SYBR verde - E. ET. 36 %
(b) todas las muestras analizadas se detectaron con la sonda específica para la secuencia deV. myrtillus(Figura 12yTabla 10) cuando se analizaron con el procedimiento basado en la sonda.
Tabla 10 - Resultados resumidos de la rt-PCR, procedimiento basado en sonda - E. ET. 36%
Ejemplo 4 - Kit para el análisis
El kit está compuesto por:
- Un tubo de 1,5 ml que contiene todos los reactivos necesarios para realizar el análisis (ADN polimerasa, dNTP, tampón, química de sonda, cebadores y sonda)
- Un tubo de 1,5 ml que contiene el control positivo (ADN deVaccinium myrtillus)
-Un tubo de 1,5 ml que contiene el ADN de control negativo (agua libre de nucleasas)
El kit puede utilizarse con todos los sistemas de PCR en tiempo real disponibles en el mercado (por ej., BioRad CFX96™, BioRad CFX96™, bCube®, Roche LightCycler® 480, etc)

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la identificación deVaccinium myrtillusen una composición botánica, que comprende detectar a partir de una muestra de la misma, mediante amplificación por PCR, un fragmento de ácido nucleico deV. myrtilluslocalizado dentro del espaciador transcrito interno 1, la región genómica del ARN ribosómico 5,8S y el espaciador transcrito interno 2, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
(a) aislar los ácidos nucleicos de dicha muestra;
(b) realizar una PCR en tiempo real sobre el ácido nucleico aislado, utilizando:
- un conjunto de cebadores seleccionados del grupo que consiste en:
(i) SEQ ID NÚM.:5 y SEQ ID NÚM.:6;
(ii) SEQ ID NÚM.:7 y SEQ ID NÚM.:8;
(iii) SEQ ID NÚM.:9 y SEQ ID NÚM.: 10;
(iv) SEQ ID NÚM.: 11 y SEQ ID NÚM.: 12; y
- una sonda de recocido dentro de la región de ácido nucleico amplificada por los cebadores, dicha sonda consiste en la secuencia SEQ ID NÚM.: 13;
(c) determinar la presencia del producto de amplificación,
por lo que la detección del producto de amplificación es indicativa de la presencia deVaccinium myrtillusen la composición botánica.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores (i) se utiliza en la etapa (b).
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha rt-PCR se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
- etapa inicial de desnaturalización a 95°C durante 180 seg;
- ciclos de 2 etapas de 15 s a 95 °C (1° etapa) y 15 s a 62-68,5 °C (2° etapa) repetidos de 40 a 50 veces.
4. El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que la composición botánica es un extracto vegetal.
5. Un kit para la identificación deVaccinium myrtillusen una composición botánica, que comprende un conjunto de cebadores y una sonda como se define en la reivindicación 1.
6. El kit de la reivindicación 5, que comprende además una ADN polimerasa, una mezcla de desoxinucleótidos (dNTP), soluciones tampón.
7. El kit de las reivindicaciones 5-6, que comprende además, en recipientes separados, una muestra de ácido nucleicode Vaccinium myrtilluspara su uso como control positivo y agua libre de nucleasas o solución tampón como control negativo.
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