CN104673930A - 一种罂粟的pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种罂粟的PCR检测方法，是以真核生物rDNA-ITS通用引物对待测样品进行PCR扩增，再对PCR阳性产物进行克隆、测序，将测序结果进行BLAST分析，最终对检测样品进行鉴定。本检测方法有别于其它检测方法，可以用于快速检测鉴定罂粟植物材料，有利于打击非法种植罂粟，遏制毒品犯罪，保障人民群众的生命安全。

Description

一种罂粟的PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种罂粟的检测方法，尤指一种以rDNA-ITS通用引物经PCR(聚合酶链式反应)方法检测罂粟植物材料。
背景技术
罂粟(Papaver somniferum)是加工制作麻醉药品与毒品(鸦片、吗啡、海洛因)的一种特殊经济作物。鸦片，是从婴粟的蒴果上割取的汁液加工制成，又名阿片、阿芙蓉、洋药、土药、烟土、大烟等。在未加工的状态下是一种不透明的乳白色汁液，在婴粟植物的各个部位都能发现，但最主要的还是集中在未成熟蒴果的活性成分里。这种乳白色的汁液一接触空气即被氧化，变成暗棕色的粘稠物质，触摸时有粘性，且有一股淡淡的清香味，然后需要在阳光下暴晒几天，塑成糕饼状、球状或块状的生鸦片。一个蒴果可以连续分泌鸦片好几天，而且可以被切割6次之多，平均每只产量80毫克，一公顷婴粟可生产8-15公斤生鸦片。
鸦片是一种杀害千百万人的毒品，吸食鸦片对人体的伤害是很大的，长期吸食鸦片，可使人先天免疫力丧失，因而人体的整体衰弱使得鸦片成瘾者极易患上或感染各种疾病，寿命也会缩短；过量吸食鸦片可引起急性中毒，可因呼吸抑制而死亡。鸦片害人身体，痹人意志，使民人无力耕种，军人丧失战斗力。就大方面而言，其结果可使民族生存受到威胁。
婴粟在中国的种植，开始时候只作为药用物质，种植范围有限，后来混合于烟草一起吸食，促进其种植范围的扩大，中华人民共和国成立初期，鸦片的毒害进一步扩大，政府组织全国性的禁毒，打击鸦片泛滥，国家又限制其种植，一直到现在，婴粟在中国的种植仅限于法律允许的范围内种植。
目前国际上解决鸦片及其衍生物给社会造成的危害问题，主要是通过限制婴粟的种植范围来实现的。《中华人民共和国治安管理处罚法》第七十一条对非法种植罂粟、非法买卖、运输、携带、持有少量等行为也作出了明确的处罚解释。但农村非法种植罂粟时有发生且有扩大走势，因此有必要对罂粟植物材料进行准确鉴定。传统的罂粟植物鉴定方法主要是依据其形态学或者解剖学特征进行的，而由于在分类学中近缘物种的罂粟属植物结构非常相似，这给罂粟的物种准确鉴定带来一些困难，如鉴定工作周期较长、鉴定范围窄等，且容易出错。因此，有必要建立一种能准确鉴定罂粟的快速分子检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种罂粟的PCR检测方法，该方法是以真核生物rDNA-ITS通用引物对待测材料的DNA提取物进行PCR扩增，本检测方法有别于其它检测方法，可用于快速检测出待测样品是否为罂粟。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种罂粟的PCR检测方法，该方法是以真核生物rDNA-ITS通用引物对待测样品进行PCR扩增，再对PCR阳性产物进行克隆、测序，将测序结果进行BLAST分析，最终对检测样品进行鉴定。
所述待测样品采用简易碱法提取DNA。上述PCR产物大小为635bp。
对本发明方法详细叙述如下：
一、引物选取：
选取真核生物通用引物ITS4(正向引物)、ITS5(反向引物)。
二、DNA的简易碱法提取：
采取下述简易方法提取罂粟DNA：
(1)分析天平称重，称取20mg样品组织置于灭菌过的1.5mL离心管中。
(2)配制0.5mol/L NaOH溶液。
(3)在装有样品组织的1.5mL离心管中加入100μL 0.5mol/L NaOH溶液。
(4)研磨破碎细胞匀浆，10000rpm离心2min。
(5)快速移取5μL上清提取液，加入495μL Tris-Hcl缓冲液(PH＝8，0.1mol/L)，混匀，作为DNA模板粗提物，对DNA粗提产物用试剂盒进行纯化。
三、PCR过程：
采用上述引物对罂粟的DNA进行PCR检测。预期PCR产物为635bp。
PCR反应体系为50μl，具体见下表1：
表1 PCR反应体系各主要成分及用量
组分 初始浓度 用量
PCR Buffer(含Mg2+) 10× 5.0μl
dNTPs 10mmol/L 1.0μl
正向引物 12.5pmol/μl 4.0μl
反向引物 12.5pmol/μl 4.0μl
TaqDNA酶 5U/μl 0.4μl
DNA模板 50ng/μl 4.0μl
ddH2O 31.6μl
反应条件：扩增条件为94℃预变性5min，然后进入72℃，在72℃加入用缓冲液稀释的Taq DNA聚合酶。再94℃变性30min，55℃复性30s，72℃延伸30s，在此条件下进行30个循环，最后72℃再延伸10min，保持在4℃。
向冷却至50-60℃的2.0％琼脂糖胶液中加入GoldViewI型核酸染色剂溶液使其终浓度为0.5μg/ml，待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。将10μl PCR扩增产物与2μl 6×上样缓冲液混匀，用微量可调移液器小心加入槽中，以2000bpDNA Marker作为标准分子量，电压保持在120V，电流在80mA以上进行电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳，用凝胶成像仪进行观察。结果扩增出的条带与预期的大小相符。
将所扩增到的片段回收，并连接到T-载体上，再转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态中，挑选白色菌落进行测序。测序完成后，将所扩增序列进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对分析，结果表明所扩增序列与罂粟属(Papaver somniferum)的相似度为100％，与罂粟亚种(Papaver somniferum subsp)的相似度为99％。表明本实验方法完全可以用于快速检测罂粟。
与现有技术相比，本发明的优点是：本方法采用简易碱法提取待测样品组织DNA，然后进行rDNA-ITS的PCR扩增，再对PCR阳性产物进行克隆、测序，最后将所扩增测序进行BLAST分析，从而达到检测鉴定样品品种的目的，该方法对有别于其它检测方法，可以用于快速检测出待测样品是否为罂粟。
附图说明
图1是对罂粟rDNA-ITS作PCR的电泳图。
其中，M为2000bp分子量标记；1为阴性对照(不加模板DNA)；2-4为罂粟叶片。
图2是待检测的罂粟rDNA-ITS的PCR扩增产物序列。
图3是对所扩增序列进行BLAST分析结果图。
具体实施方式
采用本发明的方法对来自湖南隆回的罂粟植株叶片进行PCR检测，以不加罂粟模板DNA为阴性对照，见图1，结果显示，罂粟叶片为阳性，扩增出预期635个碱基的条带。将所扩增到的片段回收，进行测序，测序结果见图2，序列如SEQ ID No.1所示。将所扩增序列进行BLAST分析，见图3，结果显示所扩增序列与罂粟属(Papaver somniferum)的相似度为100％；与罂粟亚种(Papaversomniferum subsp)的相似度为99％。说明本发明的方法能快速检测出罂粟植株。

Claims (2)

1.一种罂粟的PCR检测方法，其特征在于：该方法是以真核生物rDNA-ITS通用引物对待测样品进行PCR扩增，再对PCR阳性产物进行克隆、测序，将测序结果进行BLAST分析，最终对检测样品进行鉴定。
2.如权利要求1所述的一种罂粟的PCR检测方法，其特征在于：所述待测样品采用简易碱法提取DNA。
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