CN106048001A - 分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法 - Google Patents

分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，包括以下步骤：(1)获取病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的DNA样本；(2)将待测DNA样本通过检测引物进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，然后构建系统发育树分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系；其中，检测病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的四个基因序列，所述四个基因序列包括：ITS序列、β‑微管蛋白基因、翻译延长因子基因1‑α和3‑磷酸甘油醛脱氢酶，引物如序列表SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.3；SEQ.ID.No.4；SEQ.ID.No.5；SEQ.ID.No.6；SEQ.ID.No.7；SEQ.ID.No.8所示。采用本发明分析的方法，对拟盘多毛孢的属种进行鉴定，避免同一类的拟盘多毛孢分为不同的属种。用四个基因对拟盘多毛孢进行鉴定分类，鉴定分类精度高。

Description

分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法
技术领域
本发明涉及拟盘多毛孢分类领域，特别涉及分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法。
背景技术
杨梅(Myrica rubra)是我国常绿果树，具有很高的经济和生态价值。1999年，杨梅枝枯病这种新的病害最初发生在我国浙江省台州市黄岩区，经研究确定是由拟盘多毛孢引起。近年几来危害了浙江、贵州、四川和福建等杨梅主要产区。病害严重时可在1至4年侵染整棵杨梅树直至死亡。
拟盘多毛孢是由Steyaert(1949)建立的，Jeewon等通过分子系统学研究显示它是单元属，并讨论分属的重要特征。拟盘多毛孢一直被认为是病原菌直到1990年Espinosa-Garcia and Langenheim首次报道枯斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsis funereal)为红杉(Sequoia sempervirens)的重要内生真菌。
在真菌索引网上记载拟盘多毛孢属的种已有253种。已调查的植物病原拟盘多毛孢和内生的拟盘多毛孢种大多数种相同。拟盘多毛孢属的大多数种过去一直被当作植物病原真菌来研究，直到20世纪90年代才开始研究植物内生拟盘多毛孢。迄今为止，关于从4个序列分析杨梅拟盘多毛孢病原菌和内生菌之间关系的还未见报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，从而克服对拟盘多毛孢进行分类时，同一种类的拟盘多毛孢因其内生或寄生习性而被鉴定成不同的属种，造成重复分类过多的缺点。
为实现上述目的，本发明提供了分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，包括以下步骤：
(1)获取病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的DNA样本；
(2)将待测DNA样本通过检测引物进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行测序，然后分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系；其中，检测病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的四个基因序列，所述四个基因序列包括：ITS序列、β-微管蛋白基因、翻译延长因子基因1-α和3-磷酸甘油醛脱氢酶，引物如序列表SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.3；SEQ.ID.No.4；SEQ.ID.No.5；SEQ.ID.No.6；SEQ.ID.No.7；SEQ.ID.No.8所示。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中获取病原与内生拟盘多毛孢的DNA样本的步骤如下：
(1)标本采集；
(2)样本的分离、纯化；将消毒后的样品至于灭菌后的培养基上进行培养3-20天，然后进行单孢纯化，将纯化好的菌株移植于培养基上，至于黑暗条件下培养，待菌落长大至直径为5-6厘米时，停止培养。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中样品在培养基上培养的温度为25℃，纯化好的菌株在培养基上培养的温度为25℃。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系的步骤包括：
(1)对自测序以及下载的序列进行比对，所有的点到位都作为无序、不加权处理，碱基缺失被看做数据缺失；
(2)用ITS序列、β-微管蛋白基因、翻译延长因子基因1-α和3-磷酸甘油醛脱氢酶4个基因序列来做系统发育树分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系。
用于分析拟盘多毛孢关系基因的检测引物，所述检测引物具有序列表如SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.3；SEQ.ID.No.4；SEQ.ID.No.5；SEQ.ID.No.6；SEQ.ID.No.7；SEQ.ID.No.8所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用本发明分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，对拟盘多毛孢的属种进行鉴定，在对拟盘多毛孢属进行分类时，避免同一类的拟盘多毛孢也分为不同的属种，重复分类过多。采用四个基因对拟盘多毛孢进行鉴定分类，鉴定分类精确度高。
(2)采用本发明的方法，操作过程简单方便，节省时间，减少分子污染，且效率高，耗材少，精度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本实施例对杨梅病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢进行分析鉴定。分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，包括以下步骤：
1、获取病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的DNA样本；
获取内生拟盘多毛孢的步骤如下：
a.样本采集(健康植物器官)，采用五点取样法；
b.样本的分离、纯化；将选取的样品用自来水冲洗干净后晾干，依次用75％的酒精、次氯酸钠(1.3％的有效氯)和75％的酒精浸泡1、3和0.5min，最后用无菌水清洗3次。将消毒后的组织块裁剪成边长约5mm的小块，置于PDA培养基上，以25℃恒温培养3-20d。同时，将最后一次清洗组织块的无菌水涂布至PDA培养基上作对照，同时还打开一个新的空白平皿，放置于超净工作台上10min作对照，以保证分离到内生菌。在同等条件下培养，若涂布无菌水的培养基平皿和空白平皿上无任何菌落长出，从分离的植物组织长出真菌，则证明所分离到的真菌是植物内生的，而不是植物组织表面或空气中的附生菌。用稀释法作单孢纯化，对不易产孢菌株用灭过菌的康乃馨叶组织诱发产孢。将纯化好的菌株移植于PDA平板培养基上，置黑暗条件25℃培养5-7天，待菌落长大到直径为5-6厘米时，停止培养，放在4℃冰箱中备用。
获取病原拟盘多毛孢的步骤如下：
a.样本采集(有病植物器官)，采用五点取样法；
b.样本的分离、纯化；将选取的样品用自来水冲洗干净后晾干，依次用75％的酒精、次氯酸钠(1.3％的有效氯)和75％的酒精浸泡1、3和0.5min，最后用无菌水清洗3次。将消毒后的组织块(取病健交接处)裁剪成边长约5mm的小块，置于PDA培养基上，以25℃恒温培养3-20d。用稀释法作单孢纯化，对不易产孢菌株用灭过菌的康乃馨叶组织诱发产孢。将纯化好的菌株移植于PDA平板培养基上，置黑暗条件25℃培养5-7天，待菌落长大到直径为5-6厘米时，停止培养，放在4℃冰箱中备用。
提取病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的DNA步骤如下：
a.用灭过菌的研钵和研棒，研磨菌丝，可以先加250微升SDS(SDS在37度水浴)，把菌丝研碎，再加250微升SDS冲洗，常温静止10分钟，之后加NaAC(3M)或醋酸铵，150微升，混匀。
b.离心15分钟，12000转。
c.提取上清液移入离心管，再加NaAC(3M)或醋酸铵，150微升离心15分钟，12000转。
d.提取上清液加异丙醇或无水乙醇360-400微升，上下颠倒，再离心10分钟，12000转。目的：沉淀DNA
e.把上清液倒掉，加入300微升70-75％乙醇，均匀颠倒，离心2-3分钟，12000转，重复此步骤。
f.晾干(约30分钟)加30微升TE buffer或ddH2o保存。
g.电泳检测。
2、将待测DNA样本通过检测引物进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行测序，然后分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系；其中，检测病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的四个基因序列，所述四个基因序列包括：ITS序列、β-微管蛋白基因、翻译延长因子基因1-α和3-磷酸甘油醛脱氢酶。
其中，ITS扩增引物序列为通用引物ITS4和ITS5，ITS4即如SEQ.ID.No.1所示(5’-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3’)，ITS5即如SEQ.ID.No.2所示(5’-GGA AGT AAA AGTCGTAAC AAG G-3’)；β-微管蛋白基因(Beta-tubulin gene,β-tub)扩增引物序列为BT2A和BT2B，BT2A即如SEQ.ID.No.3所示(5’-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3’)，BT2B即如SEQ.ID.No.4所示(5’-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3’)；翻译延长因子基因1-α(tef1-α)PCR扩增的引物序列EF1-728F和EF1-986R，EF1-728F即如SEQ.ID.No.5所示(5’-CAT CGA AGT TCG AGA AGG-3’)，EF1-986R即如SEQ.ID.No.6所示(5’-TAC TTG AAG GAACCC TTA C-3’)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDH))Gpd-1和Gpd-2GCC，Gpd-1即如SEQ.ID.No.7所示(CAA CGG CTT CGG TCG CAT TG)，Gpd-2GCC即如SEQ.ID.No.8所示(AAG CAG TTG GTT GTG C)。
检测基因包括以下步骤：
a.用MightyAmp DNA Polymerase Ver.2试剂进行PCR，扩增反应在50μL反应体系中进行，PCR体系成分如下：2×MightyAmp Buffer Ver.2 25μL，引物各15pmols、粗提样品或生体约100ng、MightyAmp DNA聚合酶1μL(宝生物工程技术服务(大连)有限公司)。PCR(扩增热循环反应程序设置如下：(1)ITS的扩增程序：98℃下初始变性2min，接下来为94℃下变性40sec，50℃下引物退火60sec，68℃下延伸60sec，30个循环结束后在68℃下延伸10min。(2)β-微管蛋白基因的扩增程序：98℃下初始变性2min，接下来为94℃下变性30sec，55℃下引物退火30sec，68℃下延伸60sec，35个循环结束后在68℃下延伸10min。(3)翻译延长因子基因1-α的扩增程序：98℃下初始变性2min，接下来为94℃下变性35sec，52℃下引物退火50sec，68℃下延伸60sec，35个循环结束后在68℃下延伸10min。(4)3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDH))的扩增程序：98℃下初始变性2min，接下来为94℃下变性40sec，54℃下引物退火50sec，68℃下延伸60sec，35个循环结束后在68℃下延伸10min。扩增产物采用毛细血管电泳仪电泳，PCR扩增产物在上海立菲生物技术有限公司测序。取得的序列在text文本进行整理。
b.使用CLUSTALX(1.83)对自测序以及从GenBank上下载的序列进行比对，用PAUP4.0b10软件，用1000次重复启发式搜索，所有的位点都作为无序、不加权处理，碱基缺失被看做数据缺失。用Treeview32软件识别系统树。
c.3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDH))、β-微管蛋白基因和翻译延长因子1-α基因序列扩增、测序，结合已有和补充的DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)ITS序列等4个序列来做系统发育树分析病原与内生拟盘多毛孢的关系，确定杨梅同种病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢是同一个物种。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的DNA样本；
(2)将待测DNA样本通过检测引物进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行测序，然后构建分子系统发育树进行分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系；其中，检测病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的四个基因序列，所述四个基因序列包括：ITS序列、β-微管蛋白基因、翻译延长因子基因1-α和3-磷酸甘油醛脱氢酶，引物如序列表SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.3；SEQ.ID.No.4；SEQ.ID.No.5；SEQ.ID.No.6；SEQ.ID.No.7；SEQ.ID.No.8所示。
2.根据权利要求1所述的分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，其特征在于，所述步骤(1)中获取病原与内生拟盘多毛孢的DNA样本的步骤如下：
(1)标本采集；
(2)样本的分离、纯化；将消毒后的样品至于灭菌后的培养基上进行培养3-20天，然后进行单孢纯化，将纯化好的菌株移植于培养基上，至于黑暗条件下培养，待菌落长大至直径为5-6厘米时，停止培养。
3.根据权利要求2所述的分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中样品在培养基上培养的温度为25℃，纯化好的菌株在培养基上培养的温度为25℃。
4.根据权利要求1所述的分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中分析确定病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系的步骤包括：
(1)对自测序以及下载的序列进行比对，所有的点到位都作为无序、不加权处理，碱基缺失被看做数据缺失；
(2)用ITS序列、β-微管蛋白基因、翻译延长因子基因1-α和3-磷酸甘油醛脱氢酶4个基因序列来做系统发育树分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢的关系。
5.用于分析病原拟盘多毛孢和内生拟盘多毛孢之间关系基因的检测引物，其特征在于，所述检测引物具有序列表如序列表引物如序列表如SEQ.ID.No.1；SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.3；SEQ.ID.No.4；SEQ.ID.No.5；SEQ.ID.No.6；SEQ.ID.No.7；SEQ.ID.No.8所示。
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