CN108546771A - 杧果小孢拟盘多毛孢病菌lamp检测引物及其可视化检测方法和应用 - Google Patents

杧果小孢拟盘多毛孢病菌lamp检测引物及其可视化检测方法和应用 Download PDF

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石妞妞
阮宏椿
陈福如
杨秀娟
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Abstract

本发明提供了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用。本发明设计了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，见序列表。基于该引物建立的杧果小孢拟盘多毛孢病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现杧果小孢拟盘多毛孢病菌的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

Description

杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法 和应用
技术领域
本发明涉及一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用，专用于杧果小孢拟盘多毛孢病菌的快速可视化检测，可实现田间杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治领域。
背景技术
杧果(Mangifera indica L.)为世界著名的热带果树，属漆树科。杧果果实含有糖、蛋白质、粗纤维，杧果所含有的维生素A的前体胡萝卜素成分特别高，是所有水果中少见的。其次，维生素C含量也较高，矿物质、蛋白质、脂肪、糖类等也是其主要营养成分。杧果拟盘多毛孢叶斑病是由拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)为害造成的重要的杧果叶部病害，造成叶片枯死，树势衰弱。据报道，Pestalotiopsis calabae、P.mangiferae、P.congensis、P.annulata和P.funerea均可为害杧果造成灰斑病或叶斑病，本发明通过调查研究发现小孢拟盘多毛孢(P.microspora)造成杧果叶斑病，为害叶片和嫩稍，为害叶片形成圆形至不规则形病斑，后病斑处叶片灰褐色枯死，为害嫩稍，造成嫩稍上叶片褐色枯死，最后嫩稍枯死，严重时造成50％以上的产量损失，这是小孢拟盘多毛孢(P.microspora)为害杧果的首次报道。小孢拟盘多毛孢造成的杧果叶斑病与拟盘多毛孢属其他种如Pestalotiopsis calabae、P.mangiferae、P.congensis、P.annulata和P.funerea造成的病害症状相似，病原菌的形态特征也较相似，另外与炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、灰斑病(Cercospora mangiferae)等多个病害的症状也相似，难以从病害症状上明确病原菌，因此要断定造成杧果叶斑病的病原菌需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析加以确定，而这整个流程耗时长、效率低，难以做到及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足杧果拟盘多毛孢叶斑病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。
近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，PCR(polymerasechain reaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。
发明内容
针对没有现有技术对杧果小孢拟盘多毛孢病菌开展检测和鉴定的现状，本发明提供了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物，所述杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，各引物核苷酸序列为：
F3：5’-CGCATGAGCGTCTACTTCAA-3’；
B3：5’-CCCTCAGTGTAGTGACCCTT-3’；
FIP：5’-TCCATGGTACCGGGCTCGAG-GCTTCCGGCAACAAGTACG-3’；
BIP：5’-CGGTCCTTTCGGTCAGCTCTT-CCAGTTGTTTCCGGCACC-3’。
一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，利用正向外引物F3：5’-CGCATGAGCGTCTACTTCAA-3’、反向外引物B3：5’-CCCTCAGTGTAGTGACCC TT-3’、正向内引物FIP：5’-TCCATGGTACCGGGCTCGAG-GCTTCCGGCAACAAGTA CG-3’以及反向内引物BIP：5’-CGGTCCTTTCGGTCAGCTCTT-CCAGTTGTTTCCG GCACC-3’进行LAMP反应。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.特异性强、准确性高：本发明是根据杧果小孢拟盘多毛孢病菌β-tubulin基因序列在真菌种内的高度保守性和科属间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对杧果小孢拟盘多毛孢病菌具有特异扩增作用的4条LAMP引物。已经对不同地理来源的杧果小孢拟盘多毛孢病菌(P.microspora)、杧果拟盘多毛孢病菌(P.mangiferae)、杧果灰斑病菌(Pestalotiopsis calabae)杧果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、杧果尾孢属灰斑病菌(Cercospora mangiferae)、携带杧果小孢拟盘多毛孢病菌的植物组织和健康的杧果叶片组织进行了检测验证，只有杧果小孢拟盘多毛孢病菌和携带该病菌的组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物及检测方法用于检测杧果小孢拟盘多毛孢病菌准确可靠，能有效区分发生在杧果上症状特征相似的病害；
2.灵敏度高：LAMP对杧果小孢拟盘多毛孢病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达100fg，具有很高的灵敏度；
3.适用性广、实用性好：本发明的杧果小孢拟盘多毛孢病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的杧果组织进行检测，可实现杧果小孢拟盘多毛孢病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。
4.操作简便快速：LAMP是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明LAMP检测方法对杧果小孢拟盘多毛孢病菌的特异性检测结果：其中上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道M为5000bp DNAMarker，泳道1为阳性对照、泳道2-4为杧果小孢拟盘多毛孢病菌，泳道5-10分别为：杧果拟盘多毛孢病菌(P.mangiferae)、杧果灰斑病菌(P.calabae)杧果炭疽病(C.gloeosporioides)、杧果尾孢属灰斑病菌(C.mangiferae)香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、阴性对照。下图可视化显色结果1-4显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图2为本发明LAMP检测方法对杧果小孢拟盘多毛孢病菌的灵敏性检测结果：其中上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道M为5000bp DNAMarker，泳道1-9的模板DNA浓度分别为：10ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，泳道10为阴性对照。下图可视化显色结果中1-7显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
图3为本发明LAMP检测方法对杧果发病叶片组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果。上图中泳道M为5000bp DNA Marker，泳道1-6分别为杧果小孢拟盘多毛孢病菌DNA、杧果小孢拟盘多毛孢叶斑病自然发病的杧果叶片组织的DNA、人工接种杧果小孢拟盘多毛孢病菌发病的杧果叶片组织的DNA、健康杧果叶片组织的DNA、阳性对照、阴性对照。下图其中可视化显色结果1-3、5显示绿色荧光，其他不显示绿色荧光。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP引物设计
根据杧果小孢拟盘多毛孢病菌β-tubulin基因序列在真菌种内的高度保守性和科属间可变性的特点设计对杧果小孢拟盘多毛孢病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，其核苷酸序列分别为：
F3：5’-CGCATGAGCGTCTACTTCAA-3’；
B3：5’-CCCTCAGTGTAGTGACCCTT-3’；
FIP：5’-TCCATGGTACCGGGCTCGAG-GCTTCCGGCAACAAGTACG-3’；
BIP：5’-CGGTCCTTTCGGTCAGCTCTT-CCAGTTGTTTCCGGCACC-3’。
实施例2杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测方法的建立
1.待测样品DNA的提取：
①用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取0.1g菌丝粉于1.5mL离心管中，加入900μL2wt.％CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；
(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1)，温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；
(3)取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；
(4)取上清液350μL，加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；
(5)弃去上清液，加入700μL体积浓度为70％冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μL TE缓冲液，-20℃保存备用。
②用于检测杧果植株组织是否存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌时，采用NaOH快速裂解法提取杧果植株组织基因组DNA，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/L NaOH 30μL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5mL离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；
c.上清液中加入495μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增；
2.以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L F3，0.2mmol/L B3，1.6mmol/L FIP，1.6mmol/L BIP，Bst DNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液(40mM Tris-HCl,20mM(NH4)2SO4,20mM KCl,16mMMgSO4,1.6mol/L甜菜碱,2.0mM dNTPs,0.2％Trion X-100)，用无菌的超纯水补足25μL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。
实施例3杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测特异性测定
1.采用CTAB法提取3株杧果小孢拟盘多毛孢病菌(P.mangiferae)、杧果拟盘多毛孢病菌(P.mangiferae)、杧果灰斑病菌(P.calabae)杧果炭疽病(C.gloeosporioides)、杧果尾孢属灰斑病菌(C.mangiferae)香蕉枯萎病菌(F.oxysporum)的基因组DNA。
2.以提取供试菌的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L F3，0.2mmol/L B3，1.6mmol/L FIP，1.6mmol/L BIP，Bst DNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液(40mM Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mM KCl，16mMMgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2％Trion X-100)，用无菌的超纯水补足25μL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示，3株杧果小孢拟盘多毛孢病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性梯形条带，表明本发明的LAMP引物可以将杧果小孢拟盘多毛孢病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于杧果小孢拟盘多毛孢病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测灵敏性测定
1.采用CTAB法提取杧果小孢拟盘多毛孢病菌的基因组DNA；
2.将提取的杧果小孢拟盘多毛孢病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L F3，0.2mmol/L B3，1.6mmol/L FIP，1.6mmol/L BIP，Bst DNA聚合酶为8U，DNA模板1fg～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液(40mM Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mMKCl，16mM MgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2％Trion X-100)，用无菌的超纯水补足25μL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
4.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，未检测到杧果小孢拟盘多毛孢病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；没有出现条带则判断为阴性，未检测到杧果小孢拟盘多毛孢病菌。
5.检测结果
如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达100fg。
实施例5发病杧果叶片中杧果小孢拟盘多毛孢病菌的LAMP检测
1.采用CTAB法提取杧果小孢拟盘多毛孢病菌基因组DNA；采用NaOH快速裂解法提取杧果叶片组织基因组DNA。
2.以提取供试样品的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液(40mM Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mM KCl，16mM MgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2％Trion X-100)，用无菌的超纯水补足25μL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在杧果小孢拟盘多毛孢病菌。
4.检测结果
如图3所示，杧果小孢拟盘多毛孢病菌、杧果拟盘多毛孢叶斑病自然发病的叶片组织、人工接种杧果小孢拟盘多毛孢病菌发病的叶片组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，而健康杧果叶片组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带，表明本发明LAMP引物和检测方法还可用于田间杧果拟盘多毛孢叶斑病发病叶片的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgcatgagcg tctacttcaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccctcagtgt agtgaccctt 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tccatggtac cgggctcgag gcttccggca acaagtacg 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cggtcctttc ggtcagctct tccagttgtt tccggcacc 39

Claims (8)

1.一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物，其特征在于：所述杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，各引物核苷酸序列为：
F3：5’-CGCATGAGCGTCTACTTCAA-3’；
B3：5’-CCCTCAGTGTAGTGACCCTT-3’；
FIP：5’-TCCATGGTACCGGGCTCGAG-GCTTCCGGCAACAAGTACG-3’；
BIP：5’-CGGTCCTTTCGGTCAGCTCTT-CCAGTTGTTTCCGGCACC-3’。
2.一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：利用正向外引物F3：5’-CGCATGAGCGTCTACTTCAA-3’、反向外引物B3：5’-CCCTCAGTGTAGTGACCCTT-3’、正向内引物FIP：5’-TCCATGGTACCGGGCTCGAG-GCTTCCGGCAACAAGTACG-3’以及反向内引物BIP：5’-CGGTCCTTTCGGTCAGCTCTT-CCAGTTGTTTCCGGCACC-3’建立LAMP检测方法，对杧果小孢拟盘多毛孢病菌进行检测。
3.根据权利要求2所述的杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应体系为25μL，反应体系包括0.2mmol/L F3，0.2mmol/L B3，1.6mmol/L FIP，1.6mmol/L BIP，Bst DNA聚合酶为8U，DNA模板50～100ng，12.5μL的LAMP反应混合液，用无菌的超纯水补足25μL，其中，DNA模板从待检测杧果样品中提取。
4.根据权利要求3所述的杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应混合液含40mM Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，20mM KCl，16mM MgSO4，1.6mol/L甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2％Trion X-100。
5.根据权利要求4所述的杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应条件为63-65℃温育45-60min，85℃灭活5-10min。
6.根据权利要求2所述的杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。
7.根据权利要求2所述的杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP可视化检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，取2.0μL LAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
8.一种权利要求1中所述的LAMP检测引物的应用，其特征在于：LAMP检测引物应用于杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期诊断及病菌监测和鉴定。
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