CN117535440A - 新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病检测用引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病检测用引物及检测方法。所述引物包括上游引物Neo‑JC‑F和下游引物Neo‑JC‑R；步骤包括：提取柑橘叶DNA；以步骤1提取的柑橘叶DNA为模板，采用上游引物Neo‑JC‑F和下游引物Neo‑JC‑R，进行真菌核糖体基因转录间隔区ITS的扩增得到PCR扩增产物；使用琼脂糖凝胶进行电泳分离，加入核酸染料，电泳跑胶后检测荧光信号；如果存在293bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。本发明特异引物针对柑橘病样总基因组DNA可以扩增出293bp的目标条带，特异性强，不会检测出炭疽菌、镰刀菌、链格孢及柑橘基因组DNA，受外源基因组DNA干扰小，准确度高；检测时间短、操作简单，不需要复杂的检测场所和实验室。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及一种新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病检测用引物及检测方法。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，其种植面积1.42亿亩，年产约1.5亿吨，居世界水果产量第一位。柑橘种类繁多，种质资源丰富，目前栽培面积4247.3万亩，产量5121.9万吨（国家统计局2020年数据），约占世界柑橘产量的26%。湖北省柑橘栽培面积在全国排第六位，产量第三位，占全省水果总产量的60%以上，是我国柑橘产业主优势区域布局中的重要产区。
柑橘在全世界范围内具有长期的选育和栽培历史，近年来随着全球柑橘种质和苗木的频繁交流，促进了柑橘病害的起源和扩散。柑橘病害种类繁多，其中危害程度因地区和品种而异，同时随着新品种的推广、种植区域的扩大和栽培技术的改变，优势病害也发生了一些变化。柑橘病害常见的病原包括真菌，细菌和病毒。这些病害的发生和危害造成果实减产，对柑橘产业造成了严重的损失。Ma等2023年在《Plant Disease》杂志上报道由新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis rosae）引起的柑橘叶枯病是湖北省柑橘产区中新发现的一种病害，该病害在柑橘幼苗育苗圃内发病率在10%左右，严重危害了柑橘幼苗的生长发育。
传统真菌病原菌的鉴定需要病原菌分离纯化培养、形态学观察、致病性测定和分子鉴定等一系列的过程，顺利的话整个过程完成至少需要大约10-20天。如果不顺利，例如：病原菌分离纯化过程中产生其他杂菌污染分离培养基会延长鉴定时间，或在分子鉴定中单个基因无法准确鉴定病原物而需要多个基因同时扩增也会延长鉴定时间，而长时间的分离鉴定会耽误病害的最佳防治时机。同时传统的鉴定存在费时费力费钱等缺点，无法满足柑橘产业需求中病原物的精准鉴定和快速防控的要求。为防止新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病在柑橘苗圃中快速蔓延，影响柑橘产业的发展，急需建立一种快速、精准的鉴定新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病检测方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术问题：对新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病检测中存在费时费力费钱等缺点，无法满足柑橘产业需求中病原物的精准鉴定和快速防控的要求。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病菌检测用引物，所述引物包括上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R；
所述上游引物Neo-JC-F的核苷酸序列为：5’-TAGGTCTTCTTATAGCTG-3’；
所述下游引物Neo-JC-R的核苷酸序列为：5’-CTACAACTAATAAAAGAAGTAG-3’。
本发明还提供一种新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病菌检测方法，包括以下步骤：
步骤1.提取柑橘叶DNA；
步骤2.以步骤1提取的柑橘叶DNA为模板，采用上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R，进行真菌核糖体基因转录间隔区ITS的扩增得到PCR扩增产物，目标条带大小为293bp；
步骤3.取步骤2的PCR扩增产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳分离，加入核酸染料，电泳跑胶后检测荧光信号；
如果存在293bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。
进一步地，所述提取柑橘叶DNA包括以下步骤：
步骤1.1.取感染叶枯病的柑橘叶片，并用液氮在研磨机上迅速研磨成细粉状，得到样品；
步骤1.2.在研磨好的样品中加入1mL CTAB提取缓冲液和10μL 1M/LDTT，振荡混匀；
步骤1.3.置于65℃水浴锅水浴20 min，期间上下颠倒至少1次；
步骤1.4.于室温下，进行离心，离心条件为：13000 rpm，10 min；
步骤1.5.吸取上清，并转入新的离心管，加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置5min分层；
步骤1.6.于室温下，进行离心，离心条件为：13000 rpm，5 min；
吸取上清约600μL至新的离心管中，加入2倍等体积无水乙醇，轻柔颠倒混匀，将离心管静置于室温30min；
步骤1.7.于室温下，进行离心，离心条件为：室温离心12000 rpm，5min；
后用75%乙醇重复洗涤沉淀两次；
步骤1.8.弃掉上清后快速离心2min，用10μL枪头吸弃微量上清乙醇液体；
步骤1.9.将离心管开盖置于通风橱中干燥，然后加30～50μL ddH2O溶解，-20℃保存。
进一步地，所述步骤2中进行PCR扩增，其反应体系总体积为25μL，反应组分为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R各1μL，总DNA 1μL，双蒸水9.5 μL；
PCR扩增的反应程序为：
循环条件为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；
共30个循环，并于72℃延伸5 min。
进一步地，所述步骤3包括以下步骤：
取10μLPCR扩增产物，使用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，按照体积比1:10000比例加入Super Red核酸染料，120V电泳跑胶20分钟，于凝胶成像系统下检测荧光信号，如果存在293bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。
通过以上技术方案，本发明至少具备以下有益效果：
(1)本发明针对柑橘病样总基因组DNA可以扩增出293 bp的目标条带，特异性强，不会检测出炭疽菌、镰刀菌、链格孢及柑橘基因组DNA，受外源基因组DNA干扰小，准确度高；
(2) 本发明检测时间短、操作简单，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约5个小时，常规方法至少需要10-20天；
(3) 本发明适用于柑橘引种检疫以及柑橘抗新拟盘多毛孢引起的叶枯病早期感染或者早期无症状植株检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测引物Neo-JC-F/Neo-JC-R扩增的新拟盘多毛孢侵染柑橘叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测引物Neo-JC-F/Neo-JC-R扩增的不同病原菌侵染柑橘叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测引物Neo-JC-F/Neo-JC-R扩增的田间疑似柑橘叶枯病的病样基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。
本发明要解决的问题是提供一种由新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis rosae）引起的柑橘叶枯病检测用引物及快速检测方法，检测引物序列为：
上游引物Neo-JC-F：5’-TAGGTCTTCTTATAGCTG-3’；
下游引物Neo-JC-R：5’-CTACAACTAATAAAAGAAGTAG-3’。
检测方法如下：
1.感染叶枯病的柑橘叶片（约0.05～0.10g）用液氮在研磨机上迅速研磨成细粉状；
2.在研磨好的样品中加入1mL CTAB提取缓冲液和10μL1M/L DTT，振荡混匀；
3.置于65℃水浴锅水浴20min，期间上下颠倒几次；
4.室温离心13000rpm，10min；
5.吸取上清转入新的离心管，加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置5min分层；
6.13000 rpm，5 min，吸取上清约600μL至新的离心管中，加入2倍等体积无水乙醇，轻柔颠倒混匀，将离心管静置于室温30 min；
7.室温离心12000 rpm，5 min，后用75%乙醇重复洗涤沉淀两次；
8.弃掉上清后快速离心2 min，用10μL枪头吸弃微量上清乙醇液体；
9.将离心管开盖置于通风橱中干燥，然后加30～50μLddH2O溶解，-20℃保存。
用上述提取的总DNA为模板，利用设计的特异引物Neo-JC-F/Neo-JC-R进行真菌核糖体基因转录间隔区ITS的扩增得到PCR扩增产物，目标条带大小为293bp。引物序列为：
上游引物Neo-JC-F：5’-TAGGTCTTCTTATAGCTG-3’；
下游引物Neo-JC-R：5’-CTACAACTAATAAAAGAAGTAG-3’。
PCR扩增的反应体系总体积为25μL，反应组分为：2×Taq Master Mix 12.5 μL（CWBIO公司），10μM的上下游引物Neo-JC-F/Neo-JC-R各1μL，总DNA 1μL，双蒸水9.5μL；PCR扩增的反应程序为：94℃ 5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共30个循环，72℃延伸5min。
取10μL步骤(2)的PCR扩增产物，使用1.2％琼脂糖凝胶（m/V）进行电泳分离，按照体积比1:10000比例加入Super Red核酸染料（Biosharp公司），120V电泳跑胶20分钟，于凝胶成像系统下（BioRad公司）检测荧光信号，如果存在293bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。
请观察附图1，是特异引物Neo-JC-F/Neo-JC-R检测新拟盘多毛孢菌株人工接种的柑橘发病叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为100bpMarker；泳道1为清水空白对照；泳道2样品为人工接种新拟盘多毛孢菌后发病的柑橘叶片。
请观察附图2，是特异引物Neo-JC-F/Neo-JC-R检测由不同病原菌引起的柑橘病样的琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为100bp Marker；泳道2-5样品为田间有叶枯症状的柑橘病样，所有4株感染叶枯病的柑橘均检测出新拟盘多毛孢菌的存在；泳道6样品为清水空白对照；泳道7-8样品为柑橘健康叶片基因组DNA特异引物扩增阴性对照；泳道9-11样品为炭疽菌引发柑橘病样；泳道12-14镰刀菌引发柑橘病样；泳道15-16链格孢引发柑橘病样。
请观察附图3，是特异引物Neo-JC-F/Neo-JC-R检测田间疑似柑橘田间病样的琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为100bp Marker；泳道1样品为清水空白对照；泳道2样品为柑橘健康叶片基因组DNA特异引物扩增阴性对照；泳道3-14样品为田间疑似柑橘叶枯病的病样品。
通过上述附图可以得知：
(1) 本发明针对柑橘病样总基因组DNA可以扩增出293bp的目标条带，特异性强，并且不会检测出炭疽菌、镰刀菌、链格孢及柑橘基因组DNA，受外源基因组DNA干扰小，准确度高；
(2) 本发明检测时间短、操作简单，不需要复杂的检测场所和实验室，完成整个检测程序约5个小时，常规方法至少需要10-20天；
(3) 本发明适用于柑橘引种检疫以及柑橘抗新拟盘多毛孢引起的叶枯病早期感染或者早期无症状植株检测。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病菌检测用引物，其特征在于，所述引物包括上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R；
所述上游引物Neo-JC-F的核苷酸序列为：5’-TAGGTCTTCTTATAGCTG-3’；
所述下游引物Neo-JC-R的核苷酸序列为：5’-CTACAACTAATAAAAGAAGTAG-3’。
2.一种新拟盘多毛孢引起的柑橘叶枯病菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.提取柑橘叶DNA；
步骤2.以步骤1提取的柑橘叶DNA为模板，采用上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R，进行真菌核糖体基因转录间隔区ITS的扩增得到PCR扩增产物，目标条带大小为293bp；
步骤3.取步骤2的PCR扩增产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳分离，加入核酸染料，电泳跑胶后检测荧光信号；
如果存在293bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。
3.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述提取柑橘叶DNA包括以下步骤：
步骤1.1.取感染叶枯病的柑橘叶片，并用液氮在研磨机上迅速研磨成细粉状，得到样品；
步骤1.2.在研磨好的样品中加入1mLCTAB提取缓冲液和10μL1M/LDTT，振荡混匀；
步骤1.3.置于65℃水浴锅水浴20min，期间上下颠倒至少1次；
步骤1.4.于室温下，进行离心，离心条件为：13000rpm，10min；
步骤1.5.吸取上清，并转入新的离心管，加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置5min分层；
步骤1.6.于室温下，进行离心，离心条件为：13000rpm，5min；
吸取上清约600μL至新的离心管中，加入2倍等体积无水乙醇，轻柔颠倒混匀，将离心管静置于室温30min；
步骤1.7.于室温下，进行离心，离心条件为：12000rpm，5min；
后用75%乙醇重复洗涤沉淀两次；
步骤1.8.弃掉上清后快速离心2min，用10μL枪头吸弃微量上清乙醇液体；
步骤1.9.将离心管开盖置于通风橱中干燥，然后加30～50μLddH2O溶解，-20℃保存。
4.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中进行PCR扩增，其反应体系总体积为25μL，反应组分为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的上游引物Neo-JC-F和下游引物Neo-JC-R各1μL，总DNA1μL，双蒸水9.5μL；
PCR扩增的反应程序为：
循环条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s；
共30个循环，并于72℃延伸5min。
5.根据权利要2所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括以下步骤：
取10μLPCR扩增产物，使用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，按照体积比1:10000比例加入Super Red核酸染料，120 V电泳跑胶20分钟，于凝胶成像系统下检测荧光信号，如果存在293 bp的DNA特异性条带，则确定所检测的病菌为新拟盘多毛孢。
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