CN113981131B - 鉴别无籽油棕的ssr标记引物、应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及种苗繁育技术领域，涉及一种基于与无籽相关的S‑RNase基因序列设计SSR引物、应用及利用SSR标记鉴别无籽油棕的方法，先提取油棕种苗的DNA，再进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色，即可根据电泳条带鉴别出无籽和有籽油棕。本发明所述的鉴别无籽油棕的方法，无需等到油棕树结果，在苗期即可准确鉴定出将来会产生无籽果实的油棕种苗，鉴定准确率高，能够保证油棕种苗的纯度，对于油棕种苗质量控制具有重要意义。

Description

鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法
技术领域
本发明属于种苗繁育技术领域，涉及分子标记应用的鉴定方法，具体涉及利用SSR标记技术的应用、鉴别无籽油棕的方法。
背景技术
油棕是世界重要的油料作物，果实是唯一的产油器官，中果皮压榨得到棕榈油，种子破壳后得到种仁，种仁压榨得到棕榈仁油。目前，商业品种大多为薄壳种(Tenera)和厚壳种(Dura)，油脂压榨过程中均需要破壳工序，其中薄壳种由厚壳种和无壳种(Pisifera)杂交得来。在对油棕种质资源进行鉴定过程中，我们发现一类无籽油棕。具体表现为果实中没有种子和种壳，全部为果肉(图1)。无籽油棕在榨油过程中无需破壳工序，可以直接压榨，减少了加工成本，产油率也会相应提高。
无籽油棕品种的推广需要大量无籽油棕种苗，种苗的早期鉴定至关重要。油棕商业育苗主要采用种子育苗和组培育苗，幼苗生长3-4年才会开花结果，无籽性状才能观察到。因此，在育苗阶段鉴定种苗基因型十分必要。SSR分子标记技术步骤简单、时间短、成本低，在其他作物中也有大量成功应用的报道。在对无籽、无壳、薄壳油棕雌花转录组分析的基础上，选取可能导致无籽的S-RNase基因为目的基因，在NCBI中下载金鱼草S-RNase基因序列(HE805271.1和AJ315593.1)、茄科S-RNase基因序列(D63887.1和AB568389.1)、蔷薇科S-RNase基因序列(FJ543097.1和AF327223.1)，将这些序列与油棕基因组比对，发现与油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列相似度较高，随后用这些基因组序列在WebSat在线工具(https://bioinfo.inf.ufg.br/websat/)上设计了20对SSR引物，在华大基因合成引物，最后用于鉴别无籽油棕实验。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于与无籽相关的S-RNase基因序列设计SSR引物，应用SSR分子标记技术在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定，对于油棕种苗质量控制及种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种鉴别无籽油棕的SSR标记引物，包括两对引物组，分别为P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的另一目的在于提供鉴别无籽油棕的SSR标记引物在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定中的应用。
本发明的再一目的在于提供鉴别无籽油棕的方法，步骤如下：
步骤S1，取0.05-0.1g油棕叶片提取基因组DNA，稀释浓度到200ng/μl；
步骤S2，配制20ul反应体系对DNA进行PCR扩增，扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃，55℃退火25个循环，每个循环45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存；
步骤S3，PCR产物中加入1μl 6×染料混合，取0.8-1.0μl混合液，在6％聚丙烯酰胺凝胶上点样，电泳后银染，观察250-500bp之间的条带情况进行无籽油棕鉴定：250-500bp之间有条带的为有籽油棕(厚壳种、薄壳种、无壳种)，没有条带的为无籽油棕。
进一步地，步骤S2中，反应体系包含1μl基因组DNA，0.4μl dNTPs，2μl含有MgCl2的10×RealTimes buffer，2μl RealTimes Taq DNA聚合酶5Uμl-1，0.8μl正向引物10μM，0.8μl反向引物10μM，13μl灭菌超纯水。
所用引物P16的正向引物序列为：5'-TTAAACGATGAATCCGAGCC-3'，反向引物序列为：5'-CGTGAAGGAGGAGGAAGAAAA-3'；P19的正向引物序列为：5'-TGGTGACGAACATTACCTTGAG-3'，反向引物序列为：5'-TCTCCTGCCCTGATTCTTTAAC-3'。或者由油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列设计的其他用于鉴别无籽油棕的引物，以及这些引物序列衍生的其他用于鉴别无籽油棕的引物序列。
本发明鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法具有以下的有益效果：
早期鉴别无籽油棕可以节省育苗成本，促进无籽油棕品种的推广。油棕从种苗定植到结果需3-4年时间，而等到结果性状稳定并发现不是无籽油棕植株可能需要花费大量的人力、物力和财力，从而给种植园造成经济损失，提高无籽油棕推广的成本。本发明采用SSR分子标记技术鉴别无籽油棕，可以在育苗阶段将无籽油棕鉴别出来，无需等到多年以后发现果实不是无籽再剔除，从而避免了前期种植过程中人力、物力和财力的浪费，对于油棕种苗质量控制及油棕种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
附图说明
图1是无籽油棕果实剖面。
图2是本发明共20对SSR标记在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，2000bp；每个标记下4个样品依次为厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕。
图3是本发明标记P16在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，2000bp；Dura为厚壳种(有籽)，Pisifera为无壳种(有籽)，Tenera为薄壳种(有籽)，Seedless为无籽油棕。
图4是本发明标记P19在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的1.0μl PCR扩增产物电泳图。其中，M是DNA分子量标记，从下至上的条带依次为100bp，250bp，500bp，1000bp，2000bp；Dura为厚壳种(有籽)，Pisifera为无壳种(有籽)，Tenera为薄壳种(有籽)，Seedless为无籽油棕。
图5是本发明标记P16和P19在厚壳种(有籽)、无壳种(有籽)、薄壳种(有籽)、无籽油棕中的0.8μl PCR扩增产物电泳图。其中，D1和D2为厚壳种(有籽)，P1和P2为无壳种(有籽)，T1和T2为薄壳种(有籽)，S1和S2为无籽油棕。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一
(1)合成用于鉴别无籽油棕的20对SSR分子标记引物，其引物编号，引物设计基因组序列模板，SSR位点，正向和反向引物序列，PCR产物大小如表1所示。
表1根据油棕KE607205.1、ASJS01098507.1、CM002081.1基因组序列设计的20对引物信息
Figure BDA0003391698180000041
Figure BDA0003391698180000051
(2)种苗叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取0.05-0.1g油棕种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净工作台中自然风干，加入TE溶解，即可得到油棕种苗DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物，对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃。55℃退火25个循环，每个循环45s。72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存。
(4)1.0μl PCR扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离条带；电泳条件为6％PAGE，100V、400mA，电泳时间为2h 10min；使用硝酸银进行染色并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行无籽油棕鉴别：电泳凝胶上大约250-500bp处观察条带。
鉴别效果：
实验材料：1份厚壳(有籽)、1份无壳(有籽)、1份薄壳(有籽)、1份无籽(来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所)。
实验方法：1、将油棕果实进行整体形状对比及剖开对比；2、采用本发明所述的鉴别无籽油棕的方法(取油棕叶片提取DNA，进行PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照)。
实验结果：SSR标记P16，P19在250-500bp之间，在有籽和无籽果实类型件有差异条带，可以鉴别有籽和无籽油棕。P1-P15，P17-P18，P20在所有果实类型中都没有差异条带，无法鉴别无籽油棕(图2)。
实施例二
(1)合成用于鉴别无籽油棕的分子标记引物P16，其中正向引物序列为：5'-TTAAACGATGAATCCGAGCC-3'，反向引物序列为：5'-CGTGAAGGAGGAGGAAGAAAA-3'。
(2)种苗叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取0.1g油棕种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净工作台中自然风干，加入TE溶解，即可得到油棕种苗DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物，对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃。55℃退火25个循环，每个循环45s。72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存。
(4)1.0μl PCR扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离条带；电泳条件为6％PAGE，100V、400mA，电泳时间为2h 10min；使用硝酸银进行染色并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行无籽油棕鉴别：电泳凝胶上大约250-500bp处观察条带。
鉴别效果：
实验材料：30份厚壳(有籽)、30份无壳(有籽)、30份薄壳(有籽)、10份无籽(来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所)。
实验方法：1、将油棕果实进行整体形状对比及剖开对比；2、采用本发明所述的鉴别无籽油棕的方法(取油棕叶片提取DNA，进行PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照)。鉴别结果如表2所示。
实验结果：标记P16在392bp附近，在有籽和无籽油棕中有差异条带，可以鉴别无籽油棕，如图3所示。
表2无籽油棕鉴别效果
样品数量 果实类型 条带情况 鉴定结果 准确率
30 厚壳(有籽) 有条带 有籽 100％
30 薄壳(有籽) 有条带 有籽 100％
30 无壳(有籽) 有条带 有籽 100％
10 无籽 无条带 无籽 100％
实施例三
(1)合成用于鉴别无籽油棕的分子标记引物P19，其中正向引物序列为：5'-TGGTGACGAACATTACCTTGAG-3'，反向引物序列为：5'-TCTCCTGCCCTGATTCTTTAAC-3'。
(2)种苗叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取0.05g油棕种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净工作台中自然风干，加入TE溶解，即可得到油棕种苗DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物，对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃。55℃退火25个循环，每个循环45s。72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存。
(4)1.0μl PCR扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离条带；电泳条件为6％PAGE，100V、400mA，电泳时间为2h 10min；使用硝酸银进行染色并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行无籽油棕鉴别：电泳凝胶上大约250-500bp处观察条带。
鉴别效果：
实验材料：30份厚壳(有籽)、30份无壳(有籽)、30份薄壳(有籽)、10份无籽(来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所)。
实验方法：1、将油棕果实进行整体形状对比及剖开对比；2、采用本发明所述的鉴别无籽油棕的方法(取油棕叶片提取DNA，进行PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照)。鉴别结果如表3所示。
实验结果：标记P19在295bp附近，在有籽和无籽油棕之间有差异条带，可以鉴别无籽油棕，如图4所示。
表3无籽油棕鉴别效果
样品数量 果实类型 条带情况 鉴定结果 准确率
30 厚壳(有籽) 有条带 有籽 100％
30 薄壳(有籽) 有条带 有籽 100％
30 无壳(有籽) 有条带 有籽 100％
10 无籽 无条带 无籽 100％
实施例四
(1)合成用于鉴别无籽油棕的分子标记引物P16和P19，其中P16的正向引物序列为：5'-TTAAACGATGAATCCGAGCC-3'，反向引物序列为：5'-CGTGAAGGAGGAGGAAGAAAA-3'；P19的正向引物序列为：5'-TGGTGACGAACATTACCTTGAG-3'，反向引物序列为：5'-TCTCCTGCCCTGATTCTTTAAC-3'。
(2)种苗叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取0.05-0.1g油棕种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净工作台中自然风干，加入TE溶解，即可得到油棕种苗DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物，对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，退火温度从65°降到56℃，运行10个循环，每个循环降低1℃。55℃退火25个循环，每个循环45s。72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，之后4℃保存。
(4)0.8μlPCR扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离条带；电泳条件为6％PAGE，100V、400mA，电泳时间为2h 10min；使用硝酸银进行染色并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行无籽油棕鉴别：电泳凝胶上大约250-500bp处观察条带。
鉴别效果：
实验材料：30份厚壳(有籽)、30份无壳(有籽)、30份薄壳(有籽)、10份无籽(来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所)。
实验方法：1、将油棕果实进行整体形状对比及剖开对比；2、采用本发明所述的鉴别无籽油棕的方法(取油棕叶片提取DNA，进行PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照)。鉴别结果如表4所示。
实验结果：标记P16在392bp，P19在295bp附近，在有籽和无籽油棕之间有差异条带，可以鉴别无籽油棕，如图5所示。
表4无籽油棕鉴别效果
Figure BDA0003391698180000091
Figure BDA0003391698180000101
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
序 列 表
<110>中国热带农业科学院椰子研究所
<120>鉴别无籽油棕的SSR标记引物、应用及方法
<160>4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213> 人工合成
<400>1
TTAAACGATGAATCCGAGCC 20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213> 人工合成
<400>2
CGTGAAGGAGGAGGAAGAAAA 21
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213> 人工合成
<400>3
TGGTGACGAACATTACCTTGAG 22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213> 人工合成
<400>4
TCTCCTGCCCTGATTCTTTAAC 22

Claims (3)

1.鉴别无籽油棕的SSR标记引物，其特征在于：包括两对引物组，分别为P16和P19；所述P16引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述P19引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的鉴别无籽油棕的SSR标记引物在育苗阶段对油棕的无籽性状进行早期鉴定中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的SSR标记引物鉴别无籽油棕的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤S1，取0.05-0.1g油棕叶片提取基因组DNA，稀释浓度到200ng/µl；
步骤S2，配制20ul反应体系对DNA进行PCR扩增，扩增方式为梯度降落法，扩增条件为：94˚C变性5 min，94˚C变性30s，退火温度从65˚ 降到56˚C，运行10个循环，每个循环降低1 ˚C，55˚C退火25个循环，每个循环45 s，72˚C延伸1 min，最后72˚C 延伸10 min，之后4˚C保存；
步骤S3，PCR产物中加入1µl 6×染料混合，取0.8-1.0 µl混合液，在6%聚丙烯酰胺凝胶上点样，电泳后银染，观察250-500bp之间的条带情况进行无籽油棕鉴定：250-500bp之间有条带的为有籽油棕，没有条带的为无籽油棕；
步骤S2中，反应体系包含1µl 基因组DNA，0.4 µl dNTPs，2 µl含有MgCl2的10×RealTimes buffer，2 µl RealTimes Taq DNA聚合酶 5 U µl-1，0.8 µl正向引物 10 µM，0.8 µl反向引物10 µM，13 µl灭菌超纯水。
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