CN110106271B - 用于辅助选择大粒蚕豆的ssr标记引物对及其应用 - Google Patents
用于辅助选择大粒蚕豆的ssr标记引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记引物对，该引物对用于对权利要求1所述的SSR标记进行扩增，其核苷酸序列为：上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。SSR标记引物对用于扩增蚕豆基因组模板，PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型，若带型显示为B带型：即为4条带，且所述4条带均位于120bp～150bp之间，则被检测的蚕豆材料为大粒蚕豆材料。该SSR标记引物对可用于辅助选择大粒蚕豆，准确率达到85％以上，对大粒性状具有显著的选择性，只需提取蚕豆总DNA进行PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及蚕豆遗传育种领域，尤其涉及用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记引物对及其应用。
背景技术
种子大小是蚕豆育种的主要目标，对种子外观，品质和产量起决定性作用。百粒重(hundred-grain weight):100粒种子的重量，以克表示，是体现种子大小与充实程度的一项指标，通常用于大粒种子如玉米、大豆、花生、棉花等。通常用100粒种子重量(100-SW)表示种子大小。蚕豆的种子重量受种子大小的影响，种子大小是一个重要的产量构成因素，与蚕豆种子产量呈正相关。因此，增加100-SW的选择已经成为蚕豆育种计划和遗传改良的主要目标之一。然而，蚕豆的种子产量或100-SW由多个数量性状位点(QTL)或基因以及各种环境条件控制，因此，使用传统的育种方法复杂且难以提高蚕豆产量。分子标记为育种者寻找新的变异来源提供了快速而准确的方法，也可以用于调查控制数量遗传性状的遗传因子。使用分子标记间接选择重要的农艺性状(如种子大小，种子重量等)或标记辅助选择(MAS)可以提高传统植物育种计划的效率。蚕豆育种的主要目标是改善种子产品的质量以满足人类和/或动物的需求。分子标记已经广泛在许多植物物种中进行了各种重要性状的鉴定，包括拟南芥，玉米，高粱、水稻等。因此，鉴定与种子大小紧密连锁的SSR位点将有助于加快蚕豆育种进程。
SSR标记因其为共显性标记，串联重复序列数目的不同使其具有丰富的多态性，以及可重复性好等特点。其具有简单快捷、成本低、标记数量多而且突变丰富的优点，已经被广泛应用于检测许多作物如小麦，水稻，大麦等。在本研究中，我们通过SSR标记对38份不同种子大小的蚕豆材料进行检测，稳定检测到与籽粒大小紧密连锁的SSR标记，能准确鉴定出大粒蚕豆材料。我们的研究结果可以提供给蚕豆籽粒大小的选择方向和理论基础。
蚕豆作为蛋白质含量高且氨基酸含量丰富的优质食用豆类，在缓解蛋白质热量营养不良、微量营养素缺乏和其他营养不良相关问题方面发挥着关键作用。我国青海、甘肃等地由于气候适宜，适宜种植大粒蚕豆，用于出口创汇。蚕豆作为出口商品，对籽粒大小有着严格的要求，籽粒越大,商品价值越高。出口品种要求种子百粒重>180g。因此，利用SSR标记在早期世代尽早筛选大粒蚕豆品种，对于加快选育商品外观好的大粒蚕豆品种，满足出口创汇的需求具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记引物对及其应用，该SSR标记引物对可用于辅助选择大粒蚕豆，准确率达到85％以上，对大粒性状具有显著的选择性。
本发明的目的之一在于提供一种用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记，该SSR标记的核心基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
(CAA)11aaatcccaaaaactgcaaattgtatgccatcttaaaccatac(CAA)7。
本发明的目的之二在于提供一种用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记引物对，该引物对用于对所述的SSR标记进行扩增，其核苷酸序列为：
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之三在于提供所述的SSR标记引物对在辅助选择大粒蚕豆中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种辅助选择大粒蚕豆的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、提取蚕豆基因组DNA；
步骤2、以蚕豆基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型，若带型显示为B带型：即为4条带，且所述4条带均位于120bp～150bp之间，则被检测的蚕豆材料为大粒蚕豆材料。
本发明的有益效果：
1、标记稳定：本研究鉴定了38份不同籽粒大小的蚕豆，在显示B带型的7个蚕豆品种(品系)中，6个为百粒重超过180g的大粒材料，准确率达到85％以上，对大粒性状具有显著的选择性。
2、快速准确：通过本发明提供的方法，只需提取蚕豆总DNA进行PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定蚕豆籽粒百粒重的大小，实现筛选大粒蚕豆的第一步。因此该分子标记在今后的大粒蚕豆辅助选择育种中具有巨大的应用前景。
3、对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，无需复杂的技术步骤。
附图说明
图1为38份蚕豆材料的SSR聚丙烯胺凝胶电泳检测结果；
其中泳道1-38分别为编号1-38的蚕豆材料；
A带型：泳道11，28，38；
B带型：泳道20，21，23，26，27，30，31；
C带型：泳道2，5，25，29，32，33；
D带型：泳道1，3，4，6-10，12-19，22，24，34-37。
具体实施方式
一、试验方法
步骤1、以待测蚕豆基因组DNA为模板，将引物对上述DNA模板进行PCR扩增；
上游引物：CAAAAATCCCAAAAACTGCAA；
下游引物：TCGATTTTTCGACTTGGGTC。
PCR反应总体系为15μL，其中Primer F和Primer R引物各0.6μL，模板DNA为1.5μL，ddH2O为10.2μL，dNTP为0.4μL，10×buffer为1.5μL，PCR扩增酶1μL。
PCR扩增在TGreat Gradient Thermal Cycler(96Well)OSE-GP-01型PCR仪上进行，盖温控制在105℃，先95℃恒温预变性5min；再进行35个循环的预变性(95℃,30s)、退火(温度随引物而不同30s)、延伸(72℃,45s)；然后在72℃下继续延伸10min；最后慢慢冷却至4℃。
步骤2、以步骤1扩增产物加入1/2体积的变性剂(5×TBE 10mL，甲酰胺90mL，溴酚蓝0.05g，二甲苯青0.05g)，95℃恒温变性5min。取4μL利用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测，观察分析带型。若显示为B带型：即为4条带，且所述4条带均位于120bp～150bp之间，则为超大粒蚕豆品种。
二、实验结果：38份蚕豆品种的带型结果如图1和表1所示。
表1-38份蚕豆品种(品系)百粒重和SSR带型结果
由图可知，泳道20，21，23，26，27，30，31的带型均为B带型，根据本发明的方法可以判定为超大粒蚕豆品种。
在显示B带型的7个蚕豆品种(品系)中，6个为百粒重超过180g的大粒材料，准确率达到85.7％以上，对大粒性状具有显著的选择性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 长江大学
<120> 用于辅助选择大粒蚕豆的SSR标记引物对及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<210> 3
<211> 96
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caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caaaaatccc aaaaactgca aattgtatgc 60
catcttaaac cataccaaca acaacaacaa caacaa 96
Claims (3)
1.一种SSR标记引物对在辅助选择大粒蚕豆中的应用，其特征在于，所述SSR标记引物对用于对SSR标记进行扩增，其核苷酸序列为：
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述SSR标记的核心基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种辅助选择大粒蚕豆的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、提取蚕豆基因组DNA；
步骤2、以蚕豆基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测PCR产物的带型，若带型显示为B带型：即为4条带，且所述4条带均位于120bp～150bp之间，则被检测的蚕豆材料为大粒蚕豆材料。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3为6%的PAGE变性凝胶。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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