CN112760408A - 一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用，本发明提供了一种与苦荞壳厚度相关的分子标记的SSR引物组，包括21对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示，本发明还提供了该SSR引物组的筛选方法及应用方法。本发明提供的SSR分子标记可将易脱壳苦荞(薄壳或裂壳)和普通苦荞(厚壳)种质区分开来,操作简单、重现性好、准确度高,可有效克服用田间苗期表型鉴定方法难以准确区分易脱壳苦荞(薄壳或裂壳)和普通苦荞(厚壳)组建的后代代资源群体的缺点,在薄壳苦荞种质资源鉴别及分子标记辅助育种中具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域，特别是涉及一种利用分子标记快速鉴定易脱壳苦荞(薄壳或裂壳)种质的方法。
背景技术
苦荞的加工与利用与水稻、小麦、玉米等主粮加工利用相比，更具区域性和特色性。荞麦食品早已成为各地脍炙人口的美食名片，比其特色美味更吸引人的是荞麦的营养成份，荞麦具有显著区别于其他谷物食材的特质，在功能健康食品中具有“不可替代”理由。尤其在临床营养已经开始进入“个体化营养干预”的发展阶段，研发能够满足消费者需求的功能化细分食品，需要多样化的食材原料，荞麦就是理想的资源之一。
苦荞皮壳是指荞麦籽粒的外种皮，占籽粒总重量的25％-30％，是荞麦籽粒的天然保护层，具有柔韧而坚实的结构，是苦荞籽粒木质化程度最高的部位，苦荞仁脆性大，仁与壳之间缝隙较小，导致苦荞脱壳难。苦荞脱壳效率，主要是检查是否能保存完整的苦荞仁，完整的苦荞仁对苦荞加工产品的价值有一定的影响。目前苦荞的脱壳工艺，需要高温蒸煮熟化后进行机械磨盘式脱壳，整半仁率仅能达到37.6％。随着消费者对苦荞加工产品的热爱，针对苦荞壳的厚度相关研究，培育易脱壳表型(薄壳或裂壳)品种已成为苦荞的重点。
近年来，随着分子生物学和基因组学研究的不断深入，DNA分子标记技术的研究与应用得到了迅速的发展。DNA分子标记反映了DNA水平上生物个体间的遗传差异，其技术广泛应用在物种起源、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等，具有数量丰富、多态性高、不受环境影响、检测快速等优点。目前DNA分子标记的方法主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP和SNP等。
微卫星标记(m ic rosa telli te)又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸，甚至更多核苷酸为基本单位组成的串联重复序列片段，其长度大多在200bp以内，普遍存在于真核生物和原核生物基因组中，分布于编码区和非编码区。由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，具有扩增稳定，特异性高，共显性，开发成本相对低等优点，因此微卫星标记的应用非常广泛。
SSR标记完全符合作物品种鉴别的4个基本准则，即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性，其已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记，该标记可通过比较材料之间的扩增条带，就可以较好地将同一物种的不同品种的亲缘关系进行有效鉴定评价，鉴定结果客观公正、可靠性高。
发明内容
本发明涉及与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用，本发明是鉴定苦荞壳厚度的分子标记是基于对易脱壳米荞1503米55-1(薄壳或裂壳)和品苦1号(厚壳)组建的F2代资源群体定位结果筛选得到36个基因，根据36个基因的SSR位点开发SSR引物。36个基因的筛选和定位方法参考本专利发明人团队在CN 110419401A公开的相关内容，在开发的SSR引物中经过筛选，选择50对引物对表1所示的编号1-6的材料包括父母本，F2材料中易脱壳、正常壳各2份进行筛选，筛选得到21对引物可以有效地区分易脱壳和正常壳的材料。利用21对引物对对F2代资源群体98个单株为模板进行PCR扩增，将所得的扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳检测，结合单株表型，将控制该性状的基因进行定位。
本分发明提供了一种与苦荞壳厚度相关的分子标记的SSR引物组，包括21对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示。
本发明还提供了一种与苦荞壳厚度相关的分子标记SSR引物组的筛选方法，包括以下步骤：
1)对苦荞易脱壳基因初步定位结果中候选基因36个，对所获得基因序列进行处理并检查该序列中的SSR位点；
2)设计SSR标记的引物序列(引物序列的具体设计方法可参考本专利发明人团队在CN110195126A中公开的相关内容)；
3)从田间获取易脱壳F2群体单株以及父母本植株的嫩绿叶片,提取其总DNA；
4)用步骤2)所设计的SSR标记的引物序列扩增步骤3)中编号1-6的材料，编号1-6的材料包括父、母本，F2材料中易脱壳、正常壳苦荞各2份；
5)获得在步骤3)中编号1-6的苦荞材料中有差异的SSR标记,其序列如序列表所示。
具体各引物的上游序列(5'-3')和下游序列(5'-3')如下表1所示。
表1
| 引物 | 上游序列(5'-3') | 下游序列(5'-3') |
| P1 | CGACTGCGTTGAGTTCAAAA | AAACCGCCATCTTCACAAAC |
| P2 | GTTTCTTCCGTTCGCTTTG | TGTTTTGCTCTGTTCCGTTG |
| P6 | CTTCGTCCAGGTCGATCATT | AGGGTTCTTTGTGATGGCAC |
| P7 | TAACTTTTTGCTCGTTCCCC | TTCCATCATGTCCGTTCAAA |
| P10 | CGAGATTGGAATAGACCGGA | GCATCATTCCAGCAATCCTT |
| P14 | TGACATTCCGGGAAAAGAAG | AGTTGGATCGCAGAGGAAAA |
| P16 | GATAATTGAGCGGTTTGGGA | GATCCGTCGACACAGTCTGA |
| P20 | TTGAGTTTGTTGGTGGACGA | GACGTTGCCTCCTTAGATGC |
| P23 | AGCGTGCTGAAGTTCATGTG | ACCATGCTCAAAATCGGTGT |
| P24 | CCGATTCGGTTATTCGATTG | CTCGTAAGGTGGATTGGCAT |
| P25 | AATAGCTTCGAGGCTTTCCC | TGAGGCATGAGTCTTCTGCT |
| P26 | GAATGGAATATGGAGGAGCAA | ACGGTATTACCAACCCAGCA |
| P27 | CAACTACGCATGTGCCATCT | ATGACAGGCGAGAGGAAGAA |
| P28 | TGTGGAGAGGGATGTTTGTTC | ATGCAACGTACAAGCCACAC |
| P32 | AGAAGCGTGATCAAGGGAAA | TACCCATCCGTTTTCAGGTC |
| P35 | GAACAGGTGGAATCCCTTCA | CAGCTACGAGCCTATGATGTTG |
| P37 | GTCGGTTTTGGAATTGGATG | AGGCATACGTTTTCGGATTG |
| P39 | TGGTCTTCTGGTTTTCCTGG | AGGTTTGCCCTTCTTGTGTG |
| P42 | GGGACCCACTCTCTCCTACC | TCCATCCATCATCACCCTTT |
| P47 | CGAGAGTAAAGAGATAATGCCAAA | CAATGTAGGGGGAAGACCAA |
| P50 | ACGAAAACGGATAAGGTCCA | TCGAAATCCGGTAAAAACCA |
。
本发明还提供了一种与苦荞壳厚度相关的分子标记SSR引物组的应用方法：所述的21对引物标记PCR扩增F2群体单株中的易脱壳苦荞和正常壳苦荞，计算每对引物的多态性信息含量并对F2群体扩增的标记进行连锁作图，所述的21对引物可以有效地区分易脱壳和正常壳的材料。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明提供的SSR分子标记可将易脱壳苦荞(薄壳)和普通苦荞(厚壳)种质区分开来,操作简单、重现性好、准确度高,可有效克服用田间苗期表型鉴定方法难以准确区分易脱壳苦荞(薄壳)和普通苦荞(厚壳)组建的后代代资源群体的缺点,在薄壳苦荞种质资源鉴别及分子标记辅助育种中具有重要作用。
附图说明
图1本发明与苦荞壳厚度相关的分子标记物之间的连锁遗传图谱。
图2为引物P9、P10、P11、P12、P13、P14、P16在编号1-6的材料中检测到的多态性图谱。
图3为引物P25、P26、P27、P28、P29、P30、P31、P32在编号1-6的材料中检测到的多态性图谱。
图4为毛细管电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明，以使本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：
一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用方法，包括以下步骤：
1)对苦荞易脱壳基因初步定位结果中候选基因36个，对所获得基因序列进行处理并检查该序列中的SSR位点；
2)设计SSR标记的引物序列；
3)从田间获取编号1-104的易脱壳F2群体单株以及父母本植株的嫩绿叶片,提取其总DNA；
4)用步骤2)所设计的SSR标记的引物序列PCR扩增步骤3)中编号1-6的材料，编号1-6的材料包括父、母本，F2材料中易脱壳、正常壳苦荞各2份；
5)获得在步骤3)中编号1-6的苦荞材料中有差异的SSR标记,其序列如序列表所示；
6)用步骤5)所获得的SSR标记PCR扩增步骤3)中编号7-104的F2群体单株；
7)计算每对引物的多态性信息含量并对步骤6)所获得的F2群体PCR扩增的标记进行连锁作图。
21对引物可以有效地区分易脱壳和正常壳的材料。
上述提及的PCR扩增具体参数和步骤如下：
(1)PCR反应体系：
SSR引物体系(共20ul)：ddH2O 14.8ul，dNTP 0.4ul，Buffer 2ul，F 0.3ul，R0.3ul(20uM)，DNA模板2ul，Taq 0.2ul；
(2)PCR反应采用如下循环参数：
SSR PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min，(3)聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳检测PCR产物：
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15uL加入上样板中，再加入1uL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳。
步骤(7)计算每对引物的多态性信息含量并对步骤6)所获得的F2群体PCR扩增的标记进行连锁作图,统计分析方法如下：
利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，采用0/1赋值法，在相同的迁移位置上有扩增条带记为1，无扩增条带记为0，构建0、1二元数据矩阵。采用NTSYSpc 2.11软件包进行个体遗传距离与相似系数计算并采用UPGMA法进行聚类分析。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
序列表
<110> 山西省农业科学院农作物品种资源研究所
<120> 一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgactgcgtt gagttcaaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaccgccat cttcacaaac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttcttccg ttcgctttg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
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<400> 4
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<210> 5
<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
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tcgaaatccg gtaaaaacca 20
Claims (3)
1.一种与苦荞壳厚度相关的分子标记的SSR引物组，其特征在于，包括21对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示。
2.一种与苦荞壳厚度相关的分子标记SSR引物组的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对苦荞易脱壳基因初步定位结果中候选基因36个，对所获得基因序列进行处理并检查该序列中的SSR位点；
2)设计SSR标记的引物序列；
3)从田间获取易脱壳F2群体单株以及父母本植株的嫩绿叶片,提取其总DNA；
4)用步骤2)所设计的SSR标记的引物序列PCR扩增步骤3)中编号1-6的材料，编号1-6的材料包括父、母本，F2材料中易脱壳、正常壳苦荞各2份；
5)获得在步骤3)中编号1-6的苦荞材料中有差异的SSR标记,其序列如序列表所示。
3.一种与苦荞壳厚度相关的分子标记SSR引物组的应用方法，其特征在于，权利要求1所述的21对引物标记PCR扩增F2群体单株中的易脱壳苦荞和正常壳苦荞，计算每对引物的多态性信息含量并对F2群体扩增的标记进行连锁作图，所述的21对引物可以有效地区分易脱壳和正常壳的材料。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110187079.3A CN112760408A (zh) | 2021-02-10 | 2021-02-10 | 一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110187079.3A CN112760408A (zh) | 2021-02-10 | 2021-02-10 | 一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112760408A true CN112760408A (zh) | 2021-05-07 |
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ID=75705549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110187079.3A Pending CN112760408A (zh) | 2021-02-10 | 2021-02-10 | 一种与苦荞壳厚度相关的分子标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112760408A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317811A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-04-12 | 山西农业大学 | 一种鉴定苦荞脱壳性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110195126A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-03 | 山西省农业科学院农作物品种资源研究所 | 基于苦荞全基因组数据开发的ssr核心引物组及其应用 |
| CN110419401A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-11-08 | 山西省农业科学院农作物品种资源研究所 | 一种易脱壳苦荞种质的创制方法 |
-
2021
- 2021-02-10 CN CN202110187079.3A patent/CN112760408A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110195126A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-03 | 山西省农业科学院农作物品种资源研究所 | 基于苦荞全基因组数据开发的ssr核心引物组及其应用 |
| CN110419401A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-11-08 | 山西省农业科学院农作物品种资源研究所 | 一种易脱壳苦荞种质的创制方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 贺润丽等: "苦荞种皮转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发", 《分子植物育种》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317811A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-04-12 | 山西农业大学 | 一种鉴定苦荞脱壳性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用 |
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