CN110195126A - 基于苦荞全基因组数据开发的ssr核心引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于苦荞全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用,开发过程包括:(1)获取苦荞基因组序列；(2)搜索含有SSR的基因组序列；(3)SSR引物设计；(4)SSR引物筛选。本发明的SSR核心引物组包括12对引物，其核苷酸序列如SEQ No.1‑24所示。本发明所提供的SSR核心引物组在苦荞基因组中具有分布均匀、多态性丰富，扩增重复性好，带型清晰等优点，同时适合普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台和毛细管荧光检测平台检测，可以应用于苦荞遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建、分子标记辅助育种等研究领域。
Description
技术领域
本发明涉及苦荞SSR标记，具体地说是基于苦荞全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
苦荞(Fagopyrum tartaricum L.Gertn)属蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum Mill)，一年生双子叶植物。我国是苦荞的起源中心和遗传多样性中心，是世界上大面积种植和利用苦荞的国家。苦荞具有自花授粉、生育期短、抗逆性强，耐旱、耐冷、耐瘠薄等特性，自古就作为应对干旱形势的战略储备作物。
苦荞是当今世界上集营养、保健和治疗于一体的天然保健食品之一，被称为“食药两用”的粮食珍品。苦荞经济价值极高，全身是宝，幼芽嫩叶、成熟秸秆、茎叶花果、米面皮壳无一废物。从食用到防病治病，从自然资源利用到养地增产，从农业到畜牧业，从食品加工到轻工业生产，苦荞都有积极作用。
我国作为苦荞的主产国，苦荞品种数量繁多。准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。传统的品种鉴定方法是田间种植鉴定，是将鉴定品种种植在相同的生长条件下，在生长发育的各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等做出观察记载，并与近似品种进行结果比较，一般要经过2～3年的重复观察，才能最后作出合理、客观的评价。传统品种鉴定方法存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多、工作量大等问题，无法适应大量品种的鉴定需求。
分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析等优势，已逐步用于新品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)，也称微卫星(microsatellite)，是指以1-6个核苷酸为单位在基因组中多次串联重复的DNA序列，具有易检测、共显性遗传、重复性好、数量丰富和多态性高以及遍布整个基因组等优点，已经作为重要的DNA标记广泛应用于植物遗传多样性研究、品种鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择及比较基因组研究等领域。与水稻、小麦等作物相比，现有的苦荞SSR标记数量少，不能满足苦荞研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前苦荞研究的重要工作之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于苦荞全基因组序列开发的SSR核心引物组，这些引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于苦荞遗传多样性、品种鉴定、DNA指纹图谱构建等研究。
本发明的还提供了SSR核心引物组在苦荞遗传多样性和品种鉴定中的应用。
本发明是这样实现的：从苦荞基因组中高通量开发SSR标记的方法，包括如下步骤：(1)利用已完成的苦荞基因组序列对苦荞基因组进行SSR搜索；(2)根据搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基因组SSR标记。
步骤(2)中所述SSR搜索的同时也对序列的上下游各200bp进行搜索，供设计引物用。
所述涉及引物是根据SSR序列，采用生物信息学软件primer3.0进行引物设计。
具体如下：获取苦荞基因组序列，采用MISA1.0搜索含有SSR(即简单序列重复)的基因组序列，根据含有SSR的基因组序列采用Primer3.0进行引物设计，利用来源地不同表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源对设计的SSR引物进行有效性筛选。
具体步骤如下：
(1)获取苦荞基因组序列：利用已完成的苦荞基因组序列；
(2)搜索含有SSR的基因组序列：采用MISA1.0对苦荞基因组序列进行SSR序列识别；
(3)SSR引物设计：利用Primer3.0模块进行SSR引物批量设计，共设计479对引物；
(4)SSR引物筛选：来源地不同表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源采集苗期叶片进行DNA提取，利用提取的DNA对步骤(3)中所设计的SSR引物进行PCR扩增，然后用6-8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性检测，筛选SSR有效引物；
步骤(2)中SSR序列识别的具体方法为：安装perl语言并从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html下载misa.pl程序，将序列文件命名为S.fasta，拷贝至C盘perl\bin目录中，在perl环境下执行命令C:\perl\bin\perl misa.pl S.fasta，搜索序列中的SSR位点并得到S.fasta.misa和S.fasta.statistics两个文件。其中1、2、3、4、5、6个碱基的重复次数最低分别为10,6,5,5,5,5，两个SSR之间距离小于100bp则合并为一个复合型SSR位点。
SSR引物批量设计的方法为：在perl环境下，使用primer3模块批量设计SSR引物，将p3_out.pl拷贝至c:\perl\bin目录，并运行命令“c:\perl\bin>perlp3_in.plS.fasta.misa”，得到S.fasta.p3in输入文件。将S.fasta.p3in文件拷贝到c盘perl\bin\primer3\bin目录下，运行C:\Perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<S.fasta.p3in>S.fasta.p3out实现批量的引物设计并产生一个名为S.fasta.p3out的文件，最后将s.fasta.p3out文件拷贝至C:\Perl\bin目录下，运行命令C:\perl\bin>perlp3_out.plS.fasta.p3outS.fasta.misa，得到S.fasta.results文件，SSR引物设计完成。
本发明还提供了基于苦荞基因组开发SSR引物组在荞麦可在品种鉴定中的应用。
应用本发明所述方法成功设计497对SSR引物，利用表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源进行有效性验证，其中386对SSR引物在苦荞资源中检测到清晰的目的条带，具有多态性，12对同时在苦荞资源和甜荞资源中检测到清晰的目的条带，具有多态性。
所述引物组包括12对引物，其核苷酸序列如序列表1所示。
表1 对苦荞和甜荞同时表现出多态性的12对SSR引物
附图说明
图1为引物62在19份苦荞品种中检测到的多态性图谱。
图2为引物204在19份苦荞品种中检测到的多态性图谱。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
高通量获得苦荞基因组的SSR标记
SSR标记的搜索与引物的设计
1、获取苦荞基因组序列
以课题组完成的苦荞基因组序列为模板序列。
2、搜索含有SSR的基因组序列
安装perl语言，从http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html下载misa.pl程序，将包含Unigene的序列文件命名为S.fasta拷贝至C盘perl\bin目录中，在perl环境下执行命令C:\perl\bin\perlmisa.plS.fasta，搜索序列中的SSR位点并得到S.fasta.misa和S.fasta.statistics两个文件。其中1-6个碱基的最低重复次数分别为10,6,5,5,5,5，两个SSR之间距离小于100bp就合并为一个复合型SSR。
表2 SSR长度统计表
3、引物设计
在perl环境下，使用primer3模块批量设计SSR引物。将p3_out.pl拷贝至c:\perl\bin目录并运行命令“c:\perl\bin>perl p3_in.pl S.fasta.misa”，得到S.fasta.p3in输入文件,将S.fasta.p3in文件拷贝到c盘perl\bin\primer3\bin目录下，运行C:\Perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<S.fasta.p3in>S.fasta.p3out实现批量的引物设计并产生一个名为C.fasta.p3out的文件，最后将C.fasta.p3out文件拷贝至C:\Perl\bin目录下，运行命令C:\perl\bin>perl p3_out.pl S.fasta.p3out S.fasta.misa，得到S.fasta.results文件，至此SSR引物设计完成。表2为所设计的SSR重复基元的统计结果。
4苦荞基因组SSR引物的筛选
选择5份苦荞资源和3份甜荞资源，用于检测苦荞基因SSR标记的扩增情况及多态性
采用合成的479对引物，以8份材料的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物。
根据筛选结果，选取多态性最丰富且带型清晰的引物，共12对。
利用12对引物对19份苦荞品种进行PCR扩增及毛细管电泳。
PCR反应体系共计10μL，其中包括1.5μL(30ng/μL)基因组DNA,5μL2×TaqPCRMasterMix(天根,KT:121221)，2μL(0.002nmol/μL)的正反引物合计。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
表3 19份苦荞材料
| 序号 | 品种名称 | 来源地区 | 所有权单位 |
| 1 | 野生苦荞 | 山西五台 | 山西农科院品资所 |
| 2 | 岭东苦荞 | 山西广灵 | 山西农科院品资所 |
| 3 | 扁籽荞 | 宣威县 | 云南永胜农技中心 |
| 4 | 苦荞 | 大方 | 贵州威宁农科所 |
| 5 | 麻子荞 | 毕节 | 贵州威宁县农科所 |
| 6 | 初额 | 越西县 | 四川凉山州昭觉农科所 |
| 7 | 大白原苦荞 | 巧家县 | 云南农科院粮作所 |
| 8 | 黑绿荞 | 通渭县 | 甘肃农科院 |
| 9 | 苦荞 | 波密县 | 中国农科院品资所 |
| 10 | 苦荞 | 洛札县 | 中国农科院品资所 |
| 11 | 辽荞75号(苦) | 辽宁 | 辽宁农科院 |
| 12 | 苦荞 | 临洮县 | 甘肃农科院 |
| 13 | 苦荞 | 志丹 | 陕西榆林地区农科所 |
| 14 | 米米苦荞 | 陇县 | 陕西榆林地区农科所 |
| 15 | 苦荞 | 太湖县 | 安徽省农科院作物所 |
| 16 | 苦荞 | 赫章 | 贵州威宁农科所 |
| 17 | 大苦荞 | 威宁 | 贵州威宁农科所 |
| 18 | 黑苦荞 | 镇原 | 甘肃农科院 |
| 19 | 苦荞 | 平利 | 陕西榆林地区农科所 |
试剂盒法提取基因组DNA
采用试剂盒法提取供试材料的DNA:采集苗期叶片2g，利用高通量粉碎机进行叶片的粉碎，采用上海生工DNA提取试剂盒(Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，B518261-0050)进行叶片DNA提取，在酶标仪上进行DNA质量检测以及浓度的测定,并将DNA稀释至终浓度30ng/μL，至于-20℃保存。
实施例2 SSR引物的多态性验证
利用表3记载的表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源进行种植，分别采集苗期叶片2g，利用高通量粉碎机进行叶片的粉碎，采用上海生工DNA提取试剂盒(Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，B518261-0050)进行叶片DNA提取，在酶标仪上进行DNA质量检测以及浓度的测定,并将DNA稀释至终浓度30ng/μL，至于-20℃保存。利用份材料DNA和随机选择的对SSR引物进行PCR扩增，验证引物的多态性。PCR反应体系共计10μL，其中包括1.5μL(30ng/μL)基因组DNA,5μL2×TaqPCRMasterMix(天根,KT:121221)，2μL(0.002nmol/μL)的正反引物合计。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后产物加入2μLloadingbuffer并离心，以100-600bpDNAladder为标准，采用6-8％的非变性聚丙烯酰胺进行凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200-300电压电泳2-3h，至扩增片段电泳到凝胶中部为止。电泳结束后采用银染法染色，最终将凝胶置于成像仪上成像并标记拍照。
表4 5份苦荞资源和3份甜荞资源来源地及表型特征
| 资源编号 | 来源地 | 籽粒形状 | 籽粒颜色 | 翅刺 | 花型 |
| KQ1 | 山西 | 短锥 | 黑色 | 无 | 雌雄等长 |
| KQ2 | 西藏 | 短锥 | 黑色 | 无 | 雌雄等长 |
| KQ3 | 甘肃 | 长锥 | 灰色 | 无 | 雌雄等长 |
| KQ4 | 青海 | 长锥 | 灰色 | 无 | 雌雄等长 |
| KQ5 | 山西 | 短锥 | 深棕色 | 有 | 雌雄等长 |
| TQ1 | 山西 | 三角形 | 黑色 | 无 | 雌雄异长 |
| TQ2 | 贵州 | 三角形 | 黑色 | 无 | 雌雄等长 |
| TQ3 | 内蒙古 | 三角形 | 褐色 | 无 | 雌雄异长 |
对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行验证。结果表明12对引物能够同时在苦荞和甜荞中检测到多态性位点。
图1为引物62在19份苦荞品种中检测到的多态性图谱,图2为引物204在19份苦荞品种中检测到的多态性图谱。图中字母P为引物英文的首字母，图中可以看出P62和P204在19份苦荞品种中均具有非常明显的多态性，其中图2中P200、P223，引物的基因序列为本发明专利进行探索实验室使用的引物，多态性较P204不明显。
虽然上文中已用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详细的描述，但在本发明基础上，可对其做出一些修改或改进，这对本领域技术人员来说是彰明较著的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。
序列表
<110> 山西省农业科学院农作物品种资源研究所
<120> 基于苦荞全基因组数据开发的SSR核心引物组及其应用
<130> 20190703
<141> 2019-07-16
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaatcttc ctcctcaagg tca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagctttgga gacttcatct tcg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggaggaag accgtttata ggc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人共序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcattccaaa gactgcttga atc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcctctag ctcttctagc gat 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaacgactt ccactttctc ttc 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agctgaagca gtttctacac acc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagcctcatt ctcattctcc ttc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctcaatct tctctgcagc aac 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggatatta gtttgttgag cca 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgctttgctt gactctgatg ata 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgagcttgt aacttcctcc tca 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtagctctac aacaacaggc acc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccatggtgg ttaccagaag tat 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctatacttg gtgaggagtc gga 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcccttata gccatttgct ctt 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tagttaacat cctgatggcg ttt 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atcatgacca ctgtgtttgt gtc 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctttcacacc aaaccatctt ctc 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgttgctcga ctttttcttc ttc 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggaaaatgt tgttaattgt ggt 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccaatttcca aaacaggatc ata 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agaggtgtca gcaatagtcg aag 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgagtttcc ttgtgatgac gat 23
Claims (7)
1.基于苦荞全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征在于，它包括12对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～24所示。
2.权利要求1所述的基于苦荞全基因组序列开发的SSR核心引物组在荞麦品种鉴定中的应用。
3.基于苦荞全基因组序列开发SSR核心引物组的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取苦荞基因组序列：利用已完成的苦荞基因组序列；
(2)搜索含有SSR的基因组序列：采用MISA1.0对苦荞基因组序列进行SSR序列识别；
(3)SSR引物设计：利用Primer3.0模块进行SSR引物批量设计，共设计479对引物；
(4)SSR引物筛选：对来源地不同表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源采集苗期叶片进行DNA提取，利用提取的DNA和步骤(3)中所设计的SSR引物进行PCR扩增，然后用6-8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性检测，筛选SSR有效引物。
4.根据权利要求3所述的基于苦荞全基因组序列开发SSR核心引物组的方法，其特征在于，步骤(2)中采用MISA1.0对苦荞基因组序列进行SSR序列识别的具体步骤为：安装perl语言并从
http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html下载misa.pl程序，将序列文件命名为S.fasta，拷贝至C盘perl\bin目录中，在perl环境下执行命令C:\perl\bin\perlmisa.pl S.fasta，搜索序列中的SSR位点并得到S.fasta.misa和S.fasta.statistics两个文件，其中1、2、3、4、5、6个碱基的重复次数最低分别为10,6,5,5,5,5，两个SSR之间距离小于100bp则合并为一个复合型SSR位点。
5.权利要求3所述的一种从苦荞基因组中高通量开发SSR标记的方法，其特征在于，步骤(3)SSR引物设计为SSR引物批量设计，具体步骤为：在perl环境下，使用primer3.0模块批量设计SSR引物，将p3_out.pl拷贝至c:\perl\bin目录，并运行命令“c:\perl\bin>perlp3_in.plS.fasta.misa”，得到S.fasta.p3in输入文件,将S.fasta.p3in文件拷贝到C盘perl\bin\primer3\bin目录下，运行C:\Perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<S.fasta.p3in>S.fasta.p3out实现批量的引物设计并产生一个名为S.fasta.p3out的文件，最后将是.fasta.p3out文件拷贝至C:\Perl\bin目录下，运行命令C:\perl\bin>perlp3_out.plS.fasta.p3outS.fasta.misa，得到S.fasta.results文件，SSR引物设计完成。
6.权利要求1所述的基于苦荞基因组开发的SSR引物组在荞麦品种鉴定的方法，其特征在于：步骤(3)利用Primer3.0模块进行SSR引物批量设计，共设计479对引物；利用表型差异大的5份苦荞资源和3份甜荞资源进行有效性验证，其中386对引物SSR引物在苦荞资源中检测到清晰的目的条带，具有多态性，48对引物在甜荞资源中检测到清晰的目的条带，具有多态性，12对引物同时在苦荞资源和甜荞资源中检测到清晰的目的条带，具有多态性。
7.一种苦荞有效的SSR标记筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA提取
提取待鉴定样品总DNA；
(2)引物扩增及电泳检测
以步骤(1)提取的待鉴定样品为模板，利用权利要求1步骤(3)批量设计的479对SSR引物进行PCR扩增，扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；筛选出条带清晰且与预期扩增片段大小相似的引物，即为有效的SSR引物对；
(3)核心引物
根据以上述步骤(2)的筛选结果，获得有效的SSR标记。
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