CN103627799B - 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法 - Google Patents

一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103627799B
CN103627799B CN201310550708.XA CN201310550708A CN103627799B CN 103627799 B CN103627799 B CN 103627799B CN 201310550708 A CN201310550708 A CN 201310550708A CN 103627799 B CN103627799 B CN 103627799B
Authority
CN
China
Prior art keywords
longan
ssr
hybrid
est
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310550708.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103627799A (zh
Inventor
郑少泉
胡文舜
蒋际谋
黄爱萍
姜帆
陈秀萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences filed Critical Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201310550708.XA priority Critical patent/CN103627799B/zh
Publication of CN103627799A publication Critical patent/CN103627799A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103627799B publication Critical patent/CN103627799B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于EST-SSR标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法，包括龙眼亲本与杂种后代基因组DNA的提取，以龙眼基因组DNA为模板，使用SSR引物进行PCR扩增，扩增的产物进行凝胶电泳，电泳结果进行EST—SSR分析。本发明的检测方法在5h之内即可完成杂种后代真实性早期鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。

Description

一种基于EST-SSR标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法
技术领域
本发明属于农业的果树育种与技术应用领域，具体涉及龙眼杂交种纯度鉴定方法，是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂种真实性早期鉴定方法。
背景技术
龙眼(DimocarpuslonganLour.)是重要的热带南亚热带特色果树，主要生产国是中国，其次是泰国、越南，老挝、菲律宾、缅甸、马来西亚、印度尼西亚、美国、澳大利亚等国亦有栽培。目前世界各生产国的龙眼栽培品种以实生选种、芽变选种或引种为主，杂交育种研究起步晚、发展较慢。福建省农业科学院果树研究所于1994年选用优良亲本，在国际上率先开展龙眼人工有性杂交育种研究（郑少泉等，2006）。迄今为止，利用杂交育种方式育成的龙眼品种极少，已报道品种（系）有‘冬宝9号’（郑少泉等，2006）、‘高宝’（郑少泉等，2008）、‘东丰’（范妍等，2012）、‘东良’（尹金华等，2012）。龙眼是多年生木本果树，存在遗传杂合度高、树体大、童期长等特点。龙眼杂交一般采用人工去雄授粉方法生产杂交种，其种子成本高，而更重要的是容易出现因出现去雄不彻底或串粉等假杂种，由于假杂种不易在苗期鉴定出来，导致育种成本提高、育种效率降低。因此，开发快速、准确的杂种早期真实性鉴定方法已成为龙眼育种家和相关企业共同关注的重要技术。
目前关于龙眼杂种真实性早期鉴定的工作报道甚少。传统的形态学鉴定法以杂种苗定植后从花、叶片、果实等较为稳定的性状变异中，鉴别出真假杂种，其周期长（通常需要4~5年的时间）、工作量大、经验要求高。DNA分子标记是DNA在分子水平上遗传变异的直接反映，不受内外环境影响，具有可靠性高、信息量大、检测迅速、操作方便等突出优点，已成为理想的快速鉴定杂种纯度的方法之一。卢博彬等（2013）应用RAPD标记对‘凤梨朵’ב大乌圆’杂交群体中的230个单株进行杂种真实性鉴定，确定真杂种比例为96.96%。
SSR标记根据其来源可分为基因组SSR和EST-SSR，具有高度的重复性、相对简单的带型和共显性遗传模式，是一种稳定可靠的DNA指纹技术。迄今为止，尚未见到利用SSR分子标记技术鉴定龙眼杂种苗纯度的文献报道和专利申请。
发明内容
本发明的目的是提供一种龙眼杂种后代真实性早期鉴定的技术，利用EST—SSR标记通用性进行引物开发和应用，降低鉴定成本、提高工作效率。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
用于鉴定龙眼杂种真实性的1对SSR引物GLE-26，其特征包括上游引物序列：5′-ACTTGTGTTGCTTATCCTC-3′，下游引物序列：5′-AAACACAACAATGAAATACC-3′。
一种基于EST-SSR标记的龙眼杂种后代纯度鉴定方法，包括如下步骤：
（1）提取龙眼亲本与杂种后代基因组DNA；
（2）以龙眼基因组DNA为模板，使用上述的SSR引物进行PCR扩增；
（3）对扩增的产物进行凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析，杂种扩增结果中具有双亲特征条带的即为真杂种，只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种，计算种子纯度。
其中，SSR引物在亲本1产生约230bp和210bp的两条特异性条带，在亲本2产生约220bp的特异性条带。
本发明龙眼杂种后代纯度鉴定方法具体步骤如下：
（1）基因组DNA的提取采用植物DNA提取试剂盒，按照说明书方法进行操作。DNA质量和浓度的检测采用1%的琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计（GENEQUANT,Eppendorf）。稀释DNA浓度至50ng/μL，于4℃保存备用。
（2）参考孙清明等（2011）文献，选择龙眼近缘属植物荔枝EST-SSR引物50对，由上海生工合成，经筛选获得了高鉴定效率的1对SSR引物GLE-26，上游引物序列：5′-ACTTGTGTTGCTTATCCTC-3′，下游引物序列：5′-AAACACAACAATGAAATACC-3′。
（3）以龙眼基因组DNA为模板，使用上述的SSR引物进行PCR扩增，其中PCR反应的总体积为10μL：50ng/μL基因组DNA1μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O3μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
（4）对扩增的产物进行凝胶电泳：6%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(120V,90min)，用GeneGreen核酸染料(购自北京天根生化科技有限公司)染色15min，最后在BIO-RAD凝胶成像系统上拍照记录。
（5）供试龙眼杂交种EST-SSR结果分析：比较杂种后代及其双亲的特征谱带，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真杂种，杂种后代纯度=真杂种数量/供试样品数量×100%。
本发明的检测方法在不计算DNA提取过程耗时的情况下，98份样品以内的PCR耗时120min，凝胶电泳及拍照90-120min，结果分析30-60min，所以本发明的检测方法在5h之内即可完成杂种后代纯度鉴定工作。
本发明的有益效果在于：
1.基于近缘种EST-SSR引物开发龙眼SSR引物，省去了通过构建基因组文库或与分子标记技术相结合筛选微卫星的繁琐过程，花费小、效率高；
2.本发明提供的SSR引物标记位点在2份亲本材料上分别表现为纯合体和杂合体，杂种鉴定成功率高于一般SSR引物；
3.本发明的检测方法在5h之内即可完成杂种后代真实性早期鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作简单等优点，解决了传统的形态学鉴定方法周期长、工作量大、经验要求高，易受环境影响等问题；同时解决了其它快速方法存在的操作繁琐、重复性差、费用高等问题。
附图说明
图1为引物GLE-26对‘石硖♀╳香脆♂’部分实生苗的扩增结果，其中M：Markers；S:母本‘石硖’；X：父本‘香脆’；1-50：杂交F1实生苗；箭头表示双亲特异条带。
图2为引物GLE-26对‘香脆♀╳石硖♂’实生苗的扩增结果，其中M：Markers；S:父本‘石硖’；X：母本‘香脆’；1-12：杂交F1实生苗；箭头表示双亲特异条带。
图3为GLE-6对‘香脆♀╳石硖♂’实生苗的扩增结果，其中M：Markers；S:父本‘石硖’；X：母本‘香脆’；1-12：杂交F1实生苗；箭头表示父本特异条带，约200bp。
图4表示GLE-47对‘石硖♀╳香脆♂’部分实生苗的扩增结果，其中M：Markers；S:母本‘石硖’；X：父本‘香脆’；1-49：杂交F1实生苗；箭头表示父本特异条带，约370bp。
具体实施方式
为了充分公开本发明，以下结合实施例加以说明，但本发明不仅限于此。
实施例1
龙眼杂种后代纯度鉴定，以‘石硖♀╳香脆♂’杂交群体为例。
1.试验材料
2009年，课题组选用形态及遗传背景差异较大的‘香脆’和‘石硖’为父母本，进行杂交。在开花前对父本花粉进行收集、干燥、保存，在母本花穗雌花始花期进行彻底去雄并套袋隔离，待雌花盛开期授以父本花粉，然后套袋保护。果实成熟后采收播种，获得‘石硖♀╳香脆♂’112株，保存于国家果树种质福州龙眼圃。
2.试验方法
（1）基因组DNA的提取：采取父母本及F1植株共114份材料的叶片（嫩叶为宜），基因组DNA提取采用植物DNA提取试剂盒，按照说明书方法进行操作；DNA质量和浓度的检测采用1%的琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计（GENEQUANT,Eppendorf）；稀释DNA浓度至50ng/μL，4℃保存备用。
（2）筛选纯度鉴定的SSR引物：从所公布的龙眼近缘属植物荔枝EST-SSR引物50对中，筛选出1对杂交种带型为双亲的互补带型引物GLE-26，上游引物序列：5′-ACTTGTGTTGCTTATCCTC-3′，下游引物序列：5′-AAACACAACAATGAAATACC-3′。该标记带型清晰、多态性丰富、重复性好，在父本‘石硖’产生约230bp和210bp的两条特异性条带，在母本‘香脆’产生约220bp的特异性条带（见图1）。
（3）SSR-PCR扩增：PCR反应的总体积为10μL：50ng/μL基因组DNA1μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O3μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
（4）凝胶电泳：对扩增的产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(120V,90min)，用GeneGreen核酸染料(购自北京天根生化科技有限公司)染色15min，最后在BIO-RAD凝胶成像系统上拍照记录。
3.结果分析
杂种扩增结果中106份材料具有双亲特征条带，结果见图1，即为真杂种，杂种后代纯度为94.64%，与田间调查结果一致。
实施例2
龙眼杂种后代纯度鉴定，以‘香脆♀╳石硖♂’杂交群体为例。采用实施例1的方法对‘香脆♀╳石硖♂’组合的12株杂种苗DNA进行检测，结果见图2，鉴定11株为真杂种，杂种后代纯度为91.67%，与田间调查结果一致。
实施例3
不同EST-SSR引物的鉴定成功率比较，以实施例1和实施例2的试材为例。
1.亲本间多态性引物的筛选
选取已公布的龙眼近缘属植物荔枝EST-SSR引物50对，对‘石硖’和‘香脆’进行PCR扩增，选出共显性差异标记条带的引物4对，分别为GLE-3、GLE-6、GLE-26、GLE-47，引物序列见表1。
2.SSR-PCR扩增与凝胶电泳
采用上述4对特异性引物对124份供试材料（‘石硖♀╳香脆♂’112株、‘香脆♀╳石硖♂’杂交苗12株）进行杂种真实性鉴定，SSR-PCR扩增与凝胶电泳方法同实施例1。
3.结果分析
杂种扩增结果中具有双亲特征条带的植株为真杂种，部分引物扩增结果见图3、图4，统计结果见表1。鉴定效率=判定真杂种数量/供试样品数量×100%。
从表1可知：引物GLE-26一次性可以从‘石硖♀╳香脆♂’F1杂种苗中鉴定出106株真杂种，鉴定效率最高，达到94.64%；从‘香脆♀╳石硖♂’F1杂种苗中鉴定出11株真杂种，鉴定效率达91.67，仅次于GLE-3的100%，表明GLE-26在正反交杂种后代中均具有非常高的杂种鉴定效率，若加以GLE-3引物验证，鉴定效率可以达到95.54~100%。

Claims (1)

1.一种基于EST-SSR标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）提取龙眼亲本‘香脆’和‘石硖’以及杂种后代基因组DNA；
（2）以龙眼基因组DNA为模板，使用SSR引物进行PCR扩增；其中，SSR引物为GLE-26，包括上游引物序列：5′-ACTTGTGTTGCTTATCCTC-3′，下游引物序列：5′-AAACACAACAATGAAATACC-3′；PCR扩增的反应总体积为10μL：50ng/μL基因组DNA1μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O3μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存；
（3）对扩增的产物进行凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行EST-SSR分析，杂种扩增结果中具有双亲特征条带的即为真杂种，只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种，计算种子纯度；其中，SSR引物在‘石硖’产生230bp和210bp的两条特异性条带，在‘香脆’产生220bp的特异性条带。
CN201310550708.XA 2013-11-09 2013-11-09 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法 Active CN103627799B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310550708.XA CN103627799B (zh) 2013-11-09 2013-11-09 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310550708.XA CN103627799B (zh) 2013-11-09 2013-11-09 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103627799A CN103627799A (zh) 2014-03-12
CN103627799B true CN103627799B (zh) 2016-03-02

Family

ID=50209245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310550708.XA Active CN103627799B (zh) 2013-11-09 2013-11-09 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103627799B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913810B (zh) * 2018-09-30 2022-03-15 福建省农业科学院果树研究所 一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法
CN112266972B (zh) * 2020-10-12 2022-07-05 华南农业大学 一种用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组及其应用
CN115198030B (zh) * 2022-06-07 2023-09-01 上海市农业科学院 用于朱顶红杂交后代鉴定的ssr分子标记组合、ssr引物组合及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174510A (zh) * 2011-01-06 2011-09-07 广东省农业科学院果树研究所 利用est-ssr分子标记构建荔枝核心种质的方法
CN102443654A (zh) * 2012-01-17 2012-05-09 天津市农业科学院中心实验室 一种基于est-ssr标记的花椰菜杂交种种子纯度鉴定的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174510A (zh) * 2011-01-06 2011-09-07 广东省农业科学院果树研究所 利用est-ssr分子标记构建荔枝核心种质的方法
CN102443654A (zh) * 2012-01-17 2012-05-09 天津市农业科学院中心实验室 一种基于est-ssr标记的花椰菜杂交种种子纯度鉴定的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
荔枝EST 资源的SSR 信息分析及EST-SSR 标记开发;孙清明等;《中国农业科学》;20111231;第44卷(第19期);表4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103627799A (zh) 2014-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105505925B (zh) 一种与甘蓝型油菜含油量qtl紧密连锁的分子标记
CN104059992B (zh) 一种基于est-ssr标记的甜瓜杂交种种子纯度鉴定的方法
CN103740711B (zh) 黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其应用
CN107630099B (zh) 一种与油菜粒重或角果长多效性主效qtl紧密连锁分子标记及应用
CN103060318A (zh) 基于谷子全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
CN101492738B (zh) 一种洋葱细胞质雄性不育scar标记及其应用
CN107201404A (zh) 一种针对天门冬属雌雄异株植物性别的分子生物学鉴别方法及其应用
CN109929945B (zh) 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF2604引物及其应用
CN105349684A (zh) 与玉米抗粗缩病主效qtl紧密连锁的分子标记
CN104711361A (zh) 快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒
CN103866026A (zh) 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物
CN108384875A (zh) 一种与辣椒成熟果颜色基因相关的插入/缺失位点、分子标记、分子标记引物和应用
CN103993011A (zh) 芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用
CN105543222B (zh) 大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用
CN102864242B (zh) 一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法
CN103627799B (zh) 一种基于est-ssr标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法
CN104450694A (zh) 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV6及其分子标记方法
CN106967797B (zh) 甜瓜种子纯度检测的特异性序列及检测方法和应用
CN113789408B (zh) 不结球白菜品种鉴定ssr分子标记引物的筛选及应用
CN102766625B (zh) 抗稻褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用
CN104109713B (zh) 与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法
CN110004242B (zh) 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF0239引物及其应用
CN106399498A (zh) 一种花椰菜花球花梗长度的分子标记辅助选择方法
CN105506075A (zh) 一种与梨黑斑病抗性相关的snp标记及应用
CN106755465A (zh) 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau‑2D紧密连锁的分子标记及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant