CN103866026A - 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻苗期耐冷主效基因及其专用引物。该专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法,是以待检测水稻基因组DNA为模板,用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一种标记引物进行PCR扩增,然后对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析得到水稻耐冷性的鉴定,PCR扩增产物中有大小为140~170bp或230~270bp或290~310bp或380~400bp的条带,则该苗期水稻第3染色体包含耐冷主效基因qCTS-3-1。本发明水稻耐冷性筛选可节约生产成本,提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期,减小检测结果的误差。
Description
技术领域
本发明属于生物分子标记领域,具体地说涉及一种水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的分子标记,以及应用专用引物对耐冷水稻进行鉴定筛选的方法。
背景技术
水稻的低温冷害在世界上许多国家均有发生,是全球性自然灾害。在水稻广泛种植的温带以及热带、亚热带地区,冷害频繁发生,严重影响了水稻生产的稳定与发展,对世界粮食生产的安全与协调也产生了不小的影响。我国所有稻区均有冷害发生,每4~5年造就发生一次较大冷害,使我国灾年每年损失稻谷50亿~100亿kg。在中国南方双季稻区早稻播种后,幼苗生长期的温度一般低于20℃,尤其遇上寒潮天气的危害,轻者导致秧苗黄叶,生长迟钝;重者导致卷叶和死苗,不仅严重影响早稻的产量,而且还会由于生育期的推迟影响晚稻的生产计划和产量。冷害主要在苗期和生殖生长期出现,苗期冷害普遍发生在南北早春生长的水稻幼苗。2008年初发生的我国南方的严重低温冰雪天气,给华南地区已经播种杂交水稻制种亲本造成了极大的损失,可见苗期冷害不仅是北方粳稻也是南方籼稻生产的难题。目前我国培育的耐冷性品种主要是适于纬度较高地区种植的粳稻品种,而南方稻区籼稻的苗期耐冷性品种的培育并没有取得突破性的进展。适于南方稻区种植的耐冷性籼稻品种极少,主要原因之一是资源的利用效率差和耐冷育种的力度不够,因此进行水稻耐冷主效基因的挖掘和深入研究极其重要。
水稻耐冷基因定位方面已有不少的研究报道,如钱前等利用典型的籼粳交(ZYQ8/JX17)的DH 群体在1、2、3、4 染色体上检测到与苗期耐冷性有关的4个QTL。夏瑞祥等以东乡野生稻作为供体亲本,南京11 号为轮回亲本构建BC2F1分离群体,通过SSR 标记以根电导率作为耐冷性指标对东乡野生稻苗期耐冷性进行QTL 定位,检测到2 个位于第10 染色体的主效QTL qRC10-1 和qRC10-2,对表型的贡献率分别为34.13%和37.02%。Liu等利用桂朝2号和东乡野生稻构建的高世代回交群体,对东乡野生稻孕穗开花期耐冷性进行QTL 分析,在第1、6 、11染色体上定位了贡献率在4-7%之间的3 个孕穗开花期耐冷性QTL。Zhang等用耐冷粳稻品种Lemont与不耐冷籼稻品种特青杂交构建重组自交系在3、7、11 染色体上也发现3 个苗期耐冷性的QTL,贡献率分布为4-24%。Andaya用耐冷粳稻品种M202与冷敏感籼稻品种IR50杂交构建重组自交系,在第12号染色体精细定位1个苗期耐冷性的主效QTLqCTS12。然而这些耐冷基因没有能够很好的应用到水稻生产中,因此,水稻生产中迫切需要携带耐冷基因的优良品种。
中国专利,发明专利申请号CN200610088801.3,专利名称:一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物,申请人:中国农业大学,已授权。该发明公开了一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物。辅助筛选耐冷水稻的引物,是由序列表中序列1 和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该辅助筛选耐冷水稻的方法,是以待检测水稻的基因组DNA为模板,用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增,如该待测水稻的扩增产物中有大小为500-1000bp的条带,则该待测水稻为候选耐冷水稻。本发明的辅助筛选耐冷水稻的方法可用于选育耐冷水稻,缩短耐冷水稻的育种周期,加快育种速度,降低育种成本,具有操作简单,成本低廉,周期短的优点,适于推广应用,为选育耐冷的水稻种质提供了一种快捷的选择方法。但该方法的检测是通过扩增产物的大小为500-1000bp的条带来确定耐冷水稻,由于目标条带的范围过于宽泛,增大了检测结果的误差。
发明内容
本发明的目的是克服现有耐冷水稻检测鉴定存在误差大,易出现假阳性等问题,提供一种水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的分子标记的专用引物,以及该应用专用引物对耐冷水稻进行鉴定筛选的方法。
本发明的方案是通过这样实现的:一种水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物,该专用引物包括标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种。
以上所述的标记引物RM15040为由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:1序列为:CAAACAAATCGTGGATGGATGG,SEQ ID NO:2序列为:CGCACACACGCAAATATATAGTCC。
以上所述的标记引物ZCT13为由序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:3序列为:ATCAATCCACTAGTAAGAGGT,SEQ ID NO:4序列为:TATTTTGCTACGTCAACAGC。
以上所述的标记引物ZCT23为由序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:5序列为:TAAGTGACTCCAAAGACCAT,SEQ ID NO:6序列为:CTAAAGATCATAGGGCCCTG。
以上所述的标记引物RM15123为由序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:7序列为:AACCGTTGAGCAGATCACATCG,SEQ ID NO:8序列为:CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
一种利用以上专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法,是以待检测水稻基因组DNA为模板,用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种标记引物进行PCR扩增,然后对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15040为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT13为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT23为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15123为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻。
作为本发明的进一步限定,所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳其电泳凝胶中变性聚丙烯酰胺含量为5.5~8%。
作为本发明的进一步限定,所述的PCR扩增的反应体系为:正向引物0.10μM,反向引物0.10uM,250μM 的dNTPs,1.0ul的10×PCR反应缓冲液,水稻基因组DNA模板20ng,Taq DNA聚合酶1U,用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。
作为本发明的进一步限定,所述PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min;随后94℃ 30sec,50-60℃ 30sec,72℃ 30sec,共30个循环;最后72℃延伸5min。
本发明实现的技术原理是:由于水稻耐冷性是一个复杂的数量性状,利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的耐冷基因,本发明是在找到与水稻苗期耐冷基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上,通过回交和SSR标记辅助选择,建立普通野生稻染色体片段代换系,借助分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)技术则可以有目的地进行耐冷基因的导入和聚合,选育出苗期耐冷性优良品种。
为使本发明公开充分,以上所述标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123,标记引物RM15040的筛选获得步骤如下:
(1)以具有代表性、耐冷性较强的广西普通野生稻核心种质材料DP15和DP30为供体亲本、测序籼稻品种9311为受体亲本,通过回交和SSR标记辅助选择,建立普通野生稻染色体片段代换系,进行至BC4F2代选择有目标片段的230个株系进行苗期耐冷性鉴定,选择耐冷性强的DNA片段代换系DC907-3株系后代332株发展为作图群体。
(2)参照McCouch等公布的2240对新增SSR标记,从中选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记,从gramene网站(http://www.gramene.org/)下载引物序列合成引物,对两亲本间进行多态性分析。根据亲本间多态性分析结果选取多态性好、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。另一方面,基于该基因最后的定位区段,比较水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列,利用比较结果中差异序列两端的侧翼序列设计STS引物。
(3)用CTAB法(Murray & Thompson,1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325)提取亲本DP30和9311及BC4F2群体各株系的DNA。用步骤(1)获得的备选标记对两亲本进行多态性筛选,PCR反应在PTC-100扩增仪上进行,扩增产物在7%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析,记录并选择在亲本间具有多态性的SSR标记用于后续分析。
(4)苗期耐冷性鉴定方法为:种子浸泡催芽后播种于24cm×34cm的托盘中,每托盘播12行,每行20株,中间两行为对照,对照为低温敏感的籼稻亲本9311(感,记为S)和耐冷性强的粳稻品种藤坂5号(抗,记为R)。幼苗在温室生长至3叶期时转移至人工气候箱,在温度10℃、光照3000LX(12h/d)条件下处理5天,待对照品种9311全部死亡后转移至26℃气候箱恢复7天,统计活苗数作为耐冷性指标。
(5)根据BC4F2株系的耐冷性表型,分别选择10个极端耐冷单株和10个极端敏感单株的DNA混合构建耐冷、敏感池。同时,利用在亲本间有多态性的引物分别筛选耐冷、敏感池并获得在DNA池之间有多态性的分子标记,该类多态性标记表明与耐冷性状是连锁的。然后,根据连锁标记所在的染色体,选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC4F2分离群体的各个单株,PCR程序保持与步骤(3)中的程序相同,获得群体基因型。根据连锁交换规律,利用软件Mapmaker/Exp3.0将群体基因型构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后,结合BC4F2群体各个单株的分子标记基因型和相应的耐冷性表型鉴定,利用Mapmaker/QTL 1.1软件复合区间作图法,对目标染色体进行QTL位点扫描。
(6)根据QTL定位的结果,确定与苗期耐冷主效基因(该基因命名为qCTS-3-1)紧密连锁的分子标记RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123,苗期耐冷主效基因qCTS-3-1位于水稻第3条染色体上。因此,分子标记RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123引物为苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的标记引物,用于鉴定耐冷水稻并进行育苗筛选,其详细序列如表1。
表1. 水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物
本发明具备以下良好效果:
(1)通过本发明首次用SSR标记精细定位了野生稻材料DP30中的苗期耐冷主效基因qCTS-3-1,分子标记定位主效基因位点的明确使耐冷水稻筛选鉴定工作可快速实现。
(2)通过检测与该基因位点连锁的分子标记,即可以预测水稻植株苗期的耐冷性,又可用于水稻品种或品系的基因型检测,以判断该品种或品系是否具有苗期耐冷性,进而快速筛选苗期耐冷品种或品系用于水稻育种,该其检测方便快速,不受气候环境影响。
(3)在传统育种方法中,首先要收集具有耐冷基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交,而且要对水稻品种进行耐冷性状的鉴定并进行选择,若在人工低温条件下处理鉴定,其操作非常复杂;若要在自然条件下进行,受环境限制和影响极大,表型鉴定结果可靠性就很低,因此耐冷育种不仅费时,而且难度大,成本高。而本发明方法辅助育种选择目标明确,节约成本,通过检测耐冷主效基因位点,可以在苗期就鉴定出耐冷的单株,淘汰其他植株,不仅节约生产成本而且大大提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期。
(4)本发明水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物用于PCR扩增,对于目标条带的范围有明确的规定,且其条带判断大小较窄,相对于现有技术条带范围宽泛,减少了检测结果的误差性,检测准确率高达99%以上。
附图说明
图1.水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1在第3染色体的定位。A区为 qCTS-3-1初步定位,垂直线表示水稻第3染色体示意图,水平短线表示染色体上的分子标记,小椭圆形表示着丝粒;B区为qCTS-3-1定位区域的连锁标记,水平短线表示染色体上的分子标记,括号内的数值表示标记间的遗传距离(cM),qCTS-3-1定位于ZCT13和ZCT23之间150kb的区域。
具体实施方式
以下结合附图1和实施例描述本发明水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物,这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定,以下实施例中的若未特别说明,所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 :水稻杂交及分子标记分析
(一)染色体代换系的构建
耐冷供体亲本为广西普通野生稻核心种质材料DP30,受体亲本为已测序的籼稻品种9311。通过回交和SSR标记辅助选择,建立普通野生稻染色体片段代换系。两亲本杂交获得F1与9311连续回交至BC2F1,在BC2F1开始利用325个多态性SSR标记对各株系的10个单株作基因型分析,到BC4F1获得226个含DP30片段的株系,选择均匀分布于水稻12条染色体上的96对标记分别对其进行背景筛选,回复率在90%以上的单株自交并与9311回交以获得更短导入片段的代换系。分析BC4 F1的基因型,挑选外源片段较少、片段间能相互重叠的单株自交,得到120个来源于DP30相应的BC4 F2家系种子。用这些BC4F2代换系材料鉴定水稻苗期耐冷性。
(二)耐冷性鉴定
为确保对照和群体中的每个家系生长一致,所有供试材料在播种前25℃浸种24小时,35℃催芽24h后播种于44 cm×34 cm×8 cm盛有泥质均一稻田土的托盘中,每托盘播12行,每行20株,中间两行播对低温敏感的籼稻亲本9311和耐冷性强的粳稻品种藤坂5号。幼苗在温室生长至3叶期时淘汰病弱苗后转移至人工气候箱,在温度10℃、光照3000 lx(12 h/d)条件下处理5 d后,待9311全部死亡时,转移至26℃气候箱恢复7 d,统计活苗数,计算活苗率(活苗率=活苗数/总苗数×100%),实验重复4次。
(三)群体的分子标记分析
(1)用CTAB法(Murray & Thompson,1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325)提取亲本及回交群体各单株的基因组DNA。
(2)参照McCouch等公布的2240对新增SSR标记,从中选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记,从gramene网站(http://www.gramene.org/)下载引物序列合成引物,对两亲本间进行多态性分析。根据亲本间多态性分析结果选取多态性好、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。另一方面,基于该基因最后的定位区段,比较水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列,利用比较结果中差异序列两端的侧翼序列设计STS引物。
(3)SSR标记的分析参照Temnykh的方法(Temnykh S et al,2000. Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100:697-712)。10μl反应体系包括: 10×PCR 缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2),50μM dNTPs,0.2μM引物,0.5U Taq polymerase和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行:94℃ 2min;94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 30sec,30个循环;72℃ 5min。扩增产物用7%的聚丙烯酰胺凝胶分离,通过银染显色(Zhu et al, 2004 Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1 through linkage and differential analyses. Phytipathology 94:515-519)。扩增的DNA条带利用记录结果,亲本间有多态的引物在定位群体中进行分析,获取群体基因型资料。
(4)根据BC4F2单株的耐冷性表型,分别选择10个极端耐冷单株和10个极端敏感单株的DNA混合构建耐冷、敏感池。同时,利用在亲本间有多态性的引物分别筛选耐冷、敏感池并获得在DNA池之间有多态性的分子标记,该类多态性标记表明与耐冷性状是连锁的。然后,根据连锁标记所在的染色体,选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC4F2分离群体的各个单株,PCR程序步骤(3)中的PCR程序,获得群体基因型。根据连锁交换规律,利用软件Mapmaker/Exp3.0将群体基因型构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后,结合BC4F2群体各个单株的分子标记基因型和相应的抗性表型鉴,利用Mapmaker/QTL 1.1软件复合区间作图法,对目标染色体进行QTL位点扫描,对水稻耐冷主效基因分子标记分析。
实施例2:亲本及定位群体耐冷性鉴定
对供体亲本DP30及耐冷对照藤坂5号与受体亲本9311进行了苗期耐冷性鉴定。作为受体亲本即感性对照的9311活苗率为6.7%,两个供体亲本DP30及耐冷对照藤坂5号的活苗率分别为85.7%和88.5%,结果如表1所示。
表1 亲本及对照的耐冷性
用已建立的覆盖全基因组的230份BC4F2代换系材料进行苗期耐冷性筛选鉴定,各家系的耐冷性级别(活苗率)频率分布呈连续分布,DC907家系耐冷性最强为83%,而最小的为0。选择抗性强的DC907家系构建QTLs标记定位群体,对332个单株进行苗期耐冷性鉴定,结果获得耐冷性强的苗171株,死苗56株,结果显示该群体的抗感分离比符合3:1 (χ2 =0.10<χ2 0.5,1=0.45,P=0.5)。
根据gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的标记选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记对两亲本间进行多态性分析,亲本间多态性的标记308个,占43%。根据亲本间多态性分析结果选取多态性易于鉴别、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。
通过BSA法用亲本间有多态性的232对SSR引物在耐冷、敏感池中筛选到4个有多态性的标记引物RM1164、RM3400、RM6146及RM7431。用这4个多态性标记引物对BC4F2代907-3群体进行分子标记检测,在耐冷的171株抗性单株和不耐冷的56株感性单株中,用RM1164分别检测到3个和1个重组体;用RM3400分别检测到7个和2个重组体;用RM6146分别检测到7个和2个重组体; 用RM7431则分别检测到8个和2个重组体,结果如表2所示。4个标记均位于第3染色体着丝点附近,在染色体片段代换系中紧密连锁的同一代换片段上。
由于RM1164和RM3400之间距离较大,为了寻找与qCTS-3-1连锁更紧密的标记,本发明用RM1164和RM3400检测1200株分离群体。结果显示,共有35个单株在标记RM1164和RM3400之间存在重组。在这两个标记间合成新的SSR引物,选取在亲本间有多态性的引物RM15040和RM15123检测35个重组单株的基因型,发现有28个单株在标记RM15040和RM15123间发生重组。进一步,在这两个标记之间设计STS标记引物检测重组单株的基因型,并结合重组单株的耐冷性鉴定结果,最后将qCTS-3-1定位ZCT13和ZCT23之间。在测序的日本晴品种中,ZCT13和ZCT23之间的物理距离为150kb,因此,利用上述分子标记来鉴定qCTS-3-1耐冷性基因的存在具有非常高的效率,这样也大大提高我国水稻耐冷品种的育种进度,水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1在第3染色体的定位如图1所示。标记引物RM15040、标记引物RM15123、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23的详细序列如表3所示。
表2 耐冷QTL qSCT-3-1与各标记间的重组率
表3. 水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物
实施例3 分子标记的验证
使用的材料阴性品种:不耐冷品种9311和DP30×9311育种组合中的不耐冷材料80份。
阳性品种:耐冷亲本野生稻DP30和DP30×9311育种组合中的耐冷材料19份。分子标记引物:RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123。
验证方法1:CTAB抽提法提取阳性水稻(具有耐冷主效基因qSCT-3-1的水稻)、阴性水稻(不具有耐冷主效基因qSCT-3-1的水稻)样品基因组DNA(方法同实施例1),用标记引物RM15040扩增样品DNA。正向引物(SEQ ID NO:1)0.10μM,反向引物(SEQ ID NO:2)0.10uM,250μM 的dNTPs,1.0ul的10×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2),水稻基因组DNA模板20ng,Taq DNA聚合酶1U,用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min;随后94℃ 30sec,退火56℃ 30sec,72℃ 30sec,共30个循环;最后72℃延伸5min。根据引物的特性,对退火温度作相应的修改。PCR扩增产物在7.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析,19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带,而79份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现140~170bp的条带,准确率达99%以上。由此说明,本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因,从而大大提高水稻育种效率。
验证方法2:本验证方法使用标记引物ZCT13,正向引物(SEQ ID NO:3)0.10μM,反向引物(SEQ ID NO:4)0.10uM,PCR扩增的反应条件中退火50℃ 30sec,利用6.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析,19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带,而80份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现230~270bp的条带,准确率为100%,其他操作方法和条件与验证方法1相同。由此说明,本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因,从而大大提高水稻育种效率。
验证方法3:本验证方法使用标记引物ZCT23,正向引物(SEQ ID NO:5)0.10μM,反向引物(SEQ ID NO:6)0.10uM,PCR扩增的反应条件中退火57℃ 30sec,利用5.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析,19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带,而80份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现290~310bp的条带,准确率为100%,其他操作方法和条件与验证方法1相同。由此说明,本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因,从而大大提高水稻育种效率。
验证方法4:本验证方法使用标记引物RM15123,正向引物(SEQ ID NO:7)0.10μM,反向引物(SEQ ID NO:8)0.10uM,PCR扩增的反应条件中退火60℃ 30sec,利用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析,19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带,而79份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现380~400bp的条带,准确率达99%以上,其他操作方法和条件与验证方法2相同。由此说明,本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因,从而大大提高水稻育种效率。
本发明上述实施例方案仅是对本发明的说明而不能限制本发明,权利要求中指出了本发明的范围,而上述的说明并未指出本发明的范围,因此,在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应当认为是包括在权利要求书的范围内。
本发明是经过多位水稻育苗分子遗传学研究人员长期工作经验积累,并通过创造性劳动创作而出,本发明方法辅助育种选择目标明确,节约成本,通过检测耐冷主效基因位点,可以在苗期就鉴定出耐冷的单株,淘汰其他植株,不仅节约生产成本而且大大提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期;且水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物用于PCR扩增,对于目标条带的范围有明确的规定,且其条带判断大小较窄,相对于现有技术条带范围宽泛,减少了检测结果的误差性,检测准确率高达99%以上。
序列表
<110> 广西大学
<120> 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物
<130> 2013
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CAAACAAATC GTGGATGGAT GG 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGCACACACG CAAATATATA GTCC 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ATCAATCCAC TAGTAAGAGG T 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TATTTTGCTA CGTCAACAGC 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TAAGTGACTC CAAAGACCAT 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
CTAAAGATCA TAGGGCCCTG 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
AACCGTTGAG CAGATCACAT CG 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
CCGTGAACAA CCAGAAGATA ATGC 24
Claims (5)
1.一种水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物,其特征是,该专用引物包括标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种;
所述的标记引物RM15040为由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:1序列为:CAAACAAATCGTGGATGGATGG,SEQ ID NO:2序列为:CGCACACACGCAAATATATAGTCC;
所述的标记引物ZCT13为由序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:3序列为:ATCAATCCACTAGTAAGAGGT,SEQ ID NO:4序列为:TATTTTGCTACGTCAACAGC;
所述的标记引物ZCT23为由序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:5序列为:TAAGTGACTCCAAAGACCAT,SEQ ID NO:6序列为:CTAAAGATCATAGGGCCCTG;
所述的标记引物RM15123为由序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的一对引物,SEQ ID NO:7序列为:AACCGTTGAGCAGATCACATCG,SEQ ID NO:8序列为:CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
2.一种利用权利要求1所述专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法,其特征是,以待检测水稻基因组DNA为模板,用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种标记引物进行PCR扩增,然后对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,
若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15040为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻;
若以由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT13为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻;
若以由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT23为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻;
若以由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15123为PCR扩增引物,PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带,则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因,该待测水稻为候选耐冷水稻。
3.根据权利要求2所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法,其特征是,所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳其电泳凝胶中变性聚丙烯酰胺含量为5.5~8%。
4.根据权利要求2或3所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法,其特征是,所述的PCR扩增的反应体系为:正向引物0.10μM,反向引物0.10uM,250μM 的dNTPs,1.0ul的10×PCR反应缓冲液,水稻基因组DNA模板20ng,Taq DNA聚合酶1U,用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。
5.根据权利要求4所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法,其特征是,所述PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min;随后94℃ 30sec,50-60℃ 30sec,72℃ 30sec,共30个循环;最后72℃延伸5min。
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2014
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