CN103866026A - 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 - Google Patents
水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103866026A CN103866026A CN201410101188.9A CN201410101188A CN103866026A CN 103866026 A CN103866026 A CN 103866026A CN 201410101188 A CN201410101188 A CN 201410101188A CN 103866026 A CN103866026 A CN 103866026A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cold
- seq
- rice
- primer
- resistant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 146
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 141
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title claims description 6
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 141
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 22
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 22
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 6
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 6
- 244000118056 Oryza rufipogon Species 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 4
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000746966 Zizania Species 0.000 description 2
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000003320 cold-resistant material Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000002415 kinetochore Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 240000002582 Oryza sativa Indica Group Species 0.000 description 1
- 235000019082 Osmanthus Nutrition 0.000 description 1
- 241000333181 Osmanthus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种水稻苗期耐冷主效基因及其专用引物。该专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法，是以待检测水稻基因组DNA为模板，用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一种标记引物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析得到水稻耐冷性的鉴定，PCR扩增产物中有大小为140~170bp或230~270bp或290~310bp或380~400bp的条带，则该苗期水稻第3染色体包含耐冷主效基因qCTS-3-1。本发明水稻耐冷性筛选可节约生产成本，提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期，减小检测结果的误差。
Description
技术领域
本发明属于生物分子标记领域，具体地说涉及一种水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的分子标记，以及应用专用引物对耐冷水稻进行鉴定筛选的方法。
背景技术
水稻的低温冷害在世界上许多国家均有发生，是全球性自然灾害。在水稻广泛种植的温带以及热带、亚热带地区，冷害频繁发生，严重影响了水稻生产的稳定与发展，对世界粮食生产的安全与协调也产生了不小的影响。我国所有稻区均有冷害发生，每4～5年造就发生一次较大冷害，使我国灾年每年损失稻谷50亿～100亿kg。在中国南方双季稻区早稻播种后，幼苗生长期的温度一般低于20℃，尤其遇上寒潮天气的危害，轻者导致秧苗黄叶，生长迟钝；重者导致卷叶和死苗，不仅严重影响早稻的产量，而且还会由于生育期的推迟影响晚稻的生产计划和产量。冷害主要在苗期和生殖生长期出现，苗期冷害普遍发生在南北早春生长的水稻幼苗。2008年初发生的我国南方的严重低温冰雪天气，给华南地区已经播种杂交水稻制种亲本造成了极大的损失，可见苗期冷害不仅是北方粳稻也是南方籼稻生产的难题。目前我国培育的耐冷性品种主要是适于纬度较高地区种植的粳稻品种，而南方稻区籼稻的苗期耐冷性品种的培育并没有取得突破性的进展。适于南方稻区种植的耐冷性籼稻品种极少，主要原因之一是资源的利用效率差和耐冷育种的力度不够，因此进行水稻耐冷主效基因的挖掘和深入研究极其重要。
水稻耐冷基因定位方面已有不少的研究报道，如钱前等利用典型的籼粳交（ZYQ8/JX17）的DH 群体在1、2、3、4 染色体上检测到与苗期耐冷性有关的4个QTL。夏瑞祥等以东乡野生稻作为供体亲本，南京11 号为轮回亲本构建BC2F1分离群体，通过SSR 标记以根电导率作为耐冷性指标对东乡野生稻苗期耐冷性进行QTL 定位，检测到2 个位于第10 染色体的主效QTL qRC10-1 和qRC10-2，对表型的贡献率分别为34.13%和37.02%。Liu等利用桂朝2号和东乡野生稻构建的高世代回交群体，对东乡野生稻孕穗开花期耐冷性进行QTL 分析，在第1、6 、11染色体上定位了贡献率在4-7%之间的3 个孕穗开花期耐冷性QTL。Zhang等用耐冷粳稻品种Lemont与不耐冷籼稻品种特青杂交构建重组自交系在3、7、11 染色体上也发现3 个苗期耐冷性的QTL，贡献率分布为4-24%。Andaya用耐冷粳稻品种M202与冷敏感籼稻品种IR50杂交构建重组自交系，在第12号染色体精细定位1个苗期耐冷性的主效QTLqCTS12。然而这些耐冷基因没有能够很好的应用到水稻生产中，因此，水稻生产中迫切需要携带耐冷基因的优良品种。
中国专利，发明专利申请号CN200610088801.3，专利名称：一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物，申请人：中国农业大学，已授权。该发明公开了一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物。辅助筛选耐冷水稻的引物，是由序列表中序列1 和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该辅助筛选耐冷水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为500-1000bp的条带，则该待测水稻为候选耐冷水稻。本发明的辅助筛选耐冷水稻的方法可用于选育耐冷水稻，缩短耐冷水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为选育耐冷的水稻种质提供了一种快捷的选择方法。但该方法的检测是通过扩增产物的大小为500-1000bp的条带来确定耐冷水稻，由于目标条带的范围过于宽泛，增大了检测结果的误差。
发明内容
本发明的目的是克服现有耐冷水稻检测鉴定存在误差大，易出现假阳性等问题，提供一种水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的分子标记的专用引物，以及该应用专用引物对耐冷水稻进行鉴定筛选的方法。
本发明的方案是通过这样实现的：一种水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物，该专用引物包括标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种。
以上所述的标记引物RM15040为由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:1序列为：CAAACAAATCGTGGATGGATGG，SEQ ID NO:2序列为：CGCACACACGCAAATATATAGTCC。
以上所述的标记引物ZCT13为由序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:3序列为：ATCAATCCACTAGTAAGAGGT，SEQ ID NO:4序列为：TATTTTGCTACGTCAACAGC。
以上所述的标记引物ZCT23为由序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:5序列为：TAAGTGACTCCAAAGACCAT，SEQ ID NO:6序列为：CTAAAGATCATAGGGCCCTG。
以上所述的标记引物RM15123为由序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:7序列为：AACCGTTGAGCAGATCACATCG，SEQ ID NO:8序列为：CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
一种利用以上专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法，是以待检测水稻基因组DNA为模板，用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种标记引物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15040为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT13为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT23为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻。
若以由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15123为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻。
作为本发明的进一步限定，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳其电泳凝胶中变性聚丙烯酰胺含量为5.5~8%。
作为本发明的进一步限定，所述的PCR扩增的反应体系为：正向引物0.10μM，反向引物0.10uM，250μM 的dNTPs，1.0ul的10×PCR反应缓冲液，水稻基因组DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1U，用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。
作为本发明的进一步限定，所述PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min；随后94℃ 30sec，50-60℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃延伸5min。
本发明实现的技术原理是：由于水稻耐冷性是一个复杂的数量性状，利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的耐冷基因，本发明是在找到与水稻苗期耐冷基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，通过回交和SSR标记辅助选择，建立普通野生稻染色体片段代换系，借助分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）技术则可以有目的地进行耐冷基因的导入和聚合，选育出苗期耐冷性优良品种。
为使本发明公开充分，以上所述标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123，标记引物RM15040的筛选获得步骤如下：
（1）以具有代表性、耐冷性较强的广西普通野生稻核心种质材料DP15和DP30为供体亲本、测序籼稻品种9311为受体亲本，通过回交和SSR标记辅助选择，建立普通野生稻染色体片段代换系，进行至BC4F2代选择有目标片段的230个株系进行苗期耐冷性鉴定，选择耐冷性强的DNA片段代换系DC907-3株系后代332株发展为作图群体。
（2）参照McCouch等公布的2240对新增SSR标记，从中选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记，从gramene网站（http://www.gramene.org/）下载引物序列合成引物，对两亲本间进行多态性分析。根据亲本间多态性分析结果选取多态性好、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。另一方面，基于该基因最后的定位区段，比较水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列，利用比较结果中差异序列两端的侧翼序列设计STS引物。
（3）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325）提取亲本DP30和9311及BC4F2群体各株系的DNA。用步骤（1）获得的备选标记对两亲本进行多态性筛选，PCR反应在PTC-100扩增仪上进行，扩增产物在7%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，记录并选择在亲本间具有多态性的SSR标记用于后续分析。
（4）苗期耐冷性鉴定方法为：种子浸泡催芽后播种于24cm×34cm的托盘中，每托盘播12行，每行20株，中间两行为对照，对照为低温敏感的籼稻亲本9311（感，记为S）和耐冷性强的粳稻品种藤坂5号（抗，记为R）。幼苗在温室生长至3叶期时转移至人工气候箱，在温度10℃、光照3000LX（12h/d）条件下处理5天，待对照品种9311全部死亡后转移至26℃气候箱恢复7天，统计活苗数作为耐冷性指标。
（5）根据BC4F2株系的耐冷性表型，分别选择10个极端耐冷单株和10个极端敏感单株的DNA混合构建耐冷、敏感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选耐冷、敏感池并获得在DNA池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明与耐冷性状是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC4F2分离群体的各个单株，PCR程序保持与步骤（3）中的程序相同，获得群体基因型。根据连锁交换规律，利用软件Mapmaker/Exp3.0将群体基因型构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合BC4F2群体各个单株的分子标记基因型和相应的耐冷性表型鉴定，利用Mapmaker/QTL 1.1软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描。
（6）根据QTL定位的结果，确定与苗期耐冷主效基因（该基因命名为qCTS-3-1）紧密连锁的分子标记RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123，苗期耐冷主效基因qCTS-3-1位于水稻第3条染色体上。因此，分子标记RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123引物为苗期耐冷主效基因qCTS-3-1的标记引物，用于鉴定耐冷水稻并进行育苗筛选，其详细序列如表1。
表1. 水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物
本发明具备以下良好效果：
（1）通过本发明首次用SSR标记精细定位了野生稻材料DP30中的苗期耐冷主效基因qCTS-3-1，分子标记定位主效基因位点的明确使耐冷水稻筛选鉴定工作可快速实现。
（2）通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株苗期的耐冷性，又可用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有苗期耐冷性，进而快速筛选苗期耐冷品种或品系用于水稻育种，该其检测方便快速，不受气候环境影响。
（3）在传统育种方法中，首先要收集具有耐冷基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对水稻品种进行耐冷性状的鉴定并进行选择，若在人工低温条件下处理鉴定，其操作非常复杂；若要在自然条件下进行，受环境限制和影响极大，表型鉴定结果可靠性就很低，因此耐冷育种不仅费时，而且难度大，成本高。而本发明方法辅助育种选择目标明确，节约成本，通过检测耐冷主效基因位点，可以在苗期就鉴定出耐冷的单株，淘汰其他植株，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期。
（4）本发明水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物用于PCR扩增，对于目标条带的范围有明确的规定，且其条带判断大小较窄，相对于现有技术条带范围宽泛，减少了检测结果的误差性，检测准确率高达99%以上。
附图说明
图1.水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1在第3染色体的定位。A区为 qCTS-3-1初步定位，垂直线表示水稻第3染色体示意图，水平短线表示染色体上的分子标记，小椭圆形表示着丝粒；B区为qCTS-3-1定位区域的连锁标记，水平短线表示染色体上的分子标记，括号内的数值表示标记间的遗传距离（cM），qCTS-3-1定位于ZCT13和ZCT23之间150kb的区域。
具体实施方式
以下结合附图1和实施例描述本发明水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 ：水稻杂交及分子标记分析
（一）染色体代换系的构建
耐冷供体亲本为广西普通野生稻核心种质材料DP30，受体亲本为已测序的籼稻品种9311。通过回交和SSR标记辅助选择，建立普通野生稻染色体片段代换系。两亲本杂交获得F1与9311连续回交至BC2F1，在BC2F1开始利用325个多态性SSR标记对各株系的10个单株作基因型分析，到BC4F1获得226个含DP30片段的株系，选择均匀分布于水稻12条染色体上的96对标记分别对其进行背景筛选，回复率在90％以上的单株自交并与9311回交以获得更短导入片段的代换系。分析BC4 F1的基因型，挑选外源片段较少、片段间能相互重叠的单株自交，得到120个来源于DP30相应的BC4 F2家系种子。用这些BC4F2代换系材料鉴定水稻苗期耐冷性。
（二）耐冷性鉴定
为确保对照和群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前25℃浸种24小时，35℃催芽24h后播种于44 cm×34 cm×8 cm盛有泥质均一稻田土的托盘中，每托盘播12行，每行20株，中间两行播对低温敏感的籼稻亲本9311和耐冷性强的粳稻品种藤坂5号。幼苗在温室生长至3叶期时淘汰病弱苗后转移至人工气候箱，在温度10℃、光照3000 lx（12 h/d）条件下处理5 d后，待9311全部死亡时，转移至26℃气候箱恢复7 d，统计活苗数，计算活苗率(活苗率=活苗数/总苗数×100%)，实验重复4次。
（三）群体的分子标记分析
（1）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325）提取亲本及回交群体各单株的基因组DNA。
（2）参照McCouch等公布的2240对新增SSR标记，从中选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记，从gramene网站（http://www.gramene.org/）下载引物序列合成引物，对两亲本间进行多态性分析。根据亲本间多态性分析结果选取多态性好、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。另一方面，基于该基因最后的定位区段，比较水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列，利用比较结果中差异序列两端的侧翼序列设计STS引物。
（3）SSR标记的分析参照Temnykh的方法（Temnykh S et al，2000. Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100：697-712）。10μl反应体系包括： 10×PCR 缓冲液（10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2），50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq polymerase和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行：94℃ 2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，30个循环；72℃ 5min。扩增产物用7%的聚丙烯酰胺凝胶分离，通过银染显色（Zhu et al, 2004 Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1 through linkage and differential analyses. Phytipathology 94:515-519）。扩增的DNA条带利用记录结果，亲本间有多态的引物在定位群体中进行分析，获取群体基因型资料。
（4）根据BC4F2单株的耐冷性表型，分别选择10个极端耐冷单株和10个极端敏感单株的DNA混合构建耐冷、敏感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选耐冷、敏感池并获得在DNA池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明与耐冷性状是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC4F2分离群体的各个单株，PCR程序步骤（3）中的PCR程序，获得群体基因型。根据连锁交换规律，利用软件Mapmaker/Exp3.0将群体基因型构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合BC4F2群体各个单株的分子标记基因型和相应的抗性表型鉴，利用Mapmaker/QTL 1.1软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描，对水稻耐冷主效基因分子标记分析。
实施例2：亲本及定位群体耐冷性鉴定
对供体亲本DP30及耐冷对照藤坂5号与受体亲本9311进行了苗期耐冷性鉴定。作为受体亲本即感性对照的9311活苗率为6.7%，两个供体亲本DP30及耐冷对照藤坂5号的活苗率分别为85.7%和88.5%，结果如表1所示。
表1 亲本及对照的耐冷性
用已建立的覆盖全基因组的230份BC4F2代换系材料进行苗期耐冷性筛选鉴定，各家系的耐冷性级别（活苗率）频率分布呈连续分布，DC907家系耐冷性最强为83%，而最小的为0。选择抗性强的DC907家系构建QTLs标记定位群体，对332个单株进行苗期耐冷性鉴定，结果获得耐冷性强的苗171株，死苗56株，结果显示该群体的抗感分离比符合3:1 （χ2 =0.10＜χ2 0.5，1=0.45，P=0.5）。
根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的标记选取覆盖水稻全基因组遗传距离均匀的715个SSR标记对两亲本间进行多态性分析，亲本间多态性的标记308个，占43%。根据亲本间多态性分析结果选取多态性易于鉴别、在水稻遗传图谱上均匀分布的232个标记用于分离群体分析。
通过BSA法用亲本间有多态性的232对SSR引物在耐冷、敏感池中筛选到4个有多态性的标记引物RM1164、RM3400、RM6146及RM7431。用这4个多态性标记引物对BC4F2代907-3群体进行分子标记检测，在耐冷的171株抗性单株和不耐冷的56株感性单株中，用RM1164分别检测到3个和1个重组体；用RM3400分别检测到7个和2个重组体；用RM6146分别检测到7个和2个重组体； 用RM7431则分别检测到8个和2个重组体，结果如表2所示。4个标记均位于第3染色体着丝点附近，在染色体片段代换系中紧密连锁的同一代换片段上。
由于RM1164和RM3400之间距离较大，为了寻找与qCTS-3-1连锁更紧密的标记，本发明用RM1164和RM3400检测1200株分离群体。结果显示，共有35个单株在标记RM1164和RM3400之间存在重组。在这两个标记间合成新的SSR引物，选取在亲本间有多态性的引物RM15040和RM15123检测35个重组单株的基因型，发现有28个单株在标记RM15040和RM15123间发生重组。进一步，在这两个标记之间设计STS标记引物检测重组单株的基因型，并结合重组单株的耐冷性鉴定结果，最后将qCTS-3-1定位ZCT13和ZCT23之间。在测序的日本晴品种中，ZCT13和ZCT23之间的物理距离为150kb，因此，利用上述分子标记来鉴定qCTS-3-1耐冷性基因的存在具有非常高的效率，这样也大大提高我国水稻耐冷品种的育种进度，水稻苗期耐冷主效基因qCTS-3-1在第3染色体的定位如图1所示。标记引物RM15040、标记引物RM15123、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23的详细序列如表3所示。
表2 耐冷QTL qSCT-3-1与各标记间的重组率
表3. 水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物
实施例3 分子标记的验证
使用的材料阴性品种：不耐冷品种9311和DP30×9311育种组合中的不耐冷材料80份。
阳性品种：耐冷亲本野生稻DP30和DP30×9311育种组合中的耐冷材料19份。分子标记引物：RM15040、ZCT13、ZCT23、RM15123。
验证方法1：CTAB抽提法提取阳性水稻（具有耐冷主效基因qSCT-3-1的水稻）、阴性水稻（不具有耐冷主效基因qSCT-3-1的水稻）样品基因组DNA（方法同实施例1），用标记引物RM15040扩增样品DNA。正向引物（SEQ ID NO:1）0.10μM，反向引物（SEQ ID NO:2）0.10uM，250μM 的dNTPs，1.0ul的10×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2)，水稻基因组DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1U，用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min；随后94℃ 30sec，退火56℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃延伸5min。根据引物的特性，对退火温度作相应的修改。PCR扩增产物在7.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析，19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带，而79份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现140~170bp的条带，准确率达99%以上。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因，从而大大提高水稻育种效率。
验证方法2：本验证方法使用标记引物ZCT13，正向引物（SEQ ID NO:3）0.10μM，反向引物（SEQ ID NO:4）0.10uM，PCR扩增的反应条件中退火50℃ 30sec，利用6.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析，19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带，而80份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现230~270bp的条带，准确率为100%，其他操作方法和条件与验证方法1相同。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因，从而大大提高水稻育种效率。
验证方法3：本验证方法使用标记引物ZCT23，正向引物（SEQ ID NO:5）0.10μM，反向引物（SEQ ID NO:6）0.10uM，PCR扩增的反应条件中退火57℃ 30sec，利用5.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析，19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带，而80份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现290~310bp的条带，准确率为100%，其他操作方法和条件与验证方法1相同。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因，从而大大提高水稻育种效率。
验证方法4：本验证方法使用标记引物RM15123，正向引物（SEQ ID NO:7）0.10μM，反向引物（SEQ ID NO:8）0.10uM，PCR扩增的反应条件中退火60℃ 30sec，利用8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析，19份阳性水稻样品中PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带，而79份阴性水稻样品的PCR扩增产物中未出现380~400bp的条带，准确率达99%以上，其他操作方法和条件与验证方法2相同。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有水稻耐冷的主效基因，从而大大提高水稻育种效率。
本发明上述实施例方案仅是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求中指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。
本发明是经过多位水稻育苗分子遗传学研究人员长期工作经验积累，并通过创造性劳动创作而出，本发明方法辅助育种选择目标明确，节约成本，通过检测耐冷主效基因位点，可以在苗期就鉴定出耐冷的单株，淘汰其他植株，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期；且水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物用于PCR扩增，对于目标条带的范围有明确的规定，且其条带判断大小较窄，相对于现有技术条带范围宽泛，减少了检测结果的误差性，检测准确率高达99%以上。
序列表
<110> 广西大学
<120> 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物
<130> 2013
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CAAACAAATC GTGGATGGAT GG 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGCACACACG CAAATATATA GTCC 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ATCAATCCAC TAGTAAGAGG T 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TATTTTGCTA CGTCAACAGC 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TAAGTGACTC CAAAGACCAT 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
CTAAAGATCA TAGGGCCCTG 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
AACCGTTGAG CAGATCACAT CG 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
CCGTGAACAA CCAGAAGATA ATGC 24
Claims (5)
1.一种水稻耐冷主效基因鉴定方法的专用引物，其特征是，该专用引物包括标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种；
所述的标记引物RM15040为由序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:1序列为：CAAACAAATCGTGGATGGATGG，SEQ ID NO:2序列为：CGCACACACGCAAATATATAGTCC；
所述的标记引物ZCT13为由序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:3序列为：ATCAATCCACTAGTAAGAGGT，SEQ ID NO:4序列为：TATTTTGCTACGTCAACAGC；
所述的标记引物ZCT23为由序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:5序列为：TAAGTGACTCCAAAGACCAT，SEQ ID NO:6序列为：CTAAAGATCATAGGGCCCTG；
所述的标记引物RM15123为由序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的一对引物，SEQ ID NO:7序列为：AACCGTTGAGCAGATCACATCG，SEQ ID NO:8序列为：CCGTGAACAACCAGAAGATAATGC。
2.一种利用权利要求1所述专用引物的水稻耐冷主效基因鉴定方法，其特征是，以待检测水稻基因组DNA为模板，用标记引物RM15040、标记引物ZCT13、标记引物ZCT23、标记引物RM15123中的任一一种标记引物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，
若以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15040为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为140~170bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻；
若以由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT13为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为230~270bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻；
若以由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列组成的标记引物ZCT23为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为290~310bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻；
若以由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列组成的标记引物RM15123为PCR扩增引物，PCR扩增产物中有大小为380~400bp的条带，则该待测水稻的第3染色体上具有耐冷主效基因，该待测水稻为候选耐冷水稻。
3.根据权利要求2所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法，其特征是，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳其电泳凝胶中变性聚丙烯酰胺含量为5.5~8%。
4.根据权利要求2或3所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法，其特征是，所述的PCR扩增的反应体系为：正向引物0.10μM，反向引物0.10uM，250μM 的dNTPs，1.0ul的10×PCR反应缓冲液，水稻基因组DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1U，用灭过菌的去离子水补充反应体系到10ul。
5.根据权利要求4所述的水稻耐冷主效基因鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增的反应条件为先94℃预变性5min；随后94℃ 30sec，50-60℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃延伸5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410101188.9A CN103866026B (zh) | 2013-05-07 | 2014-03-19 | 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310164028.4 | 2013-05-07 | ||
| CN201310164028 | 2013-05-07 | ||
| CN2013101640284 | 2013-05-07 | ||
| CN201410101188.9A CN103866026B (zh) | 2013-05-07 | 2014-03-19 | 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103866026A true CN103866026A (zh) | 2014-06-18 |
| CN103866026B CN103866026B (zh) | 2016-04-13 |
Family
ID=50905027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410101188.9A Expired - Fee Related CN103866026B (zh) | 2013-05-07 | 2014-03-19 | 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103866026B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505922A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-04-20 | 中农常乐（深圳）生物育种技术有限公司 | 一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法 |
| CN105525000A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-04-27 | 江西师范大学 | 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法 |
| CN108315475A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-07-24 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻孕穗期耐冷基因qCT9.6X22的分子标记及应用 |
| CN108570516A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-09-25 | 江苏高航农业科技有限公司 | 珍味稻耐储藏主效qtl的分子标记及其应用 |
| CN108570515A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-09-25 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻孕穗期耐冷基因qCT6.7DOD的分子标记及应用 |
| CN109880930A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-14 | 广西大学 | 一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用 |
| CN111876513A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-11-03 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种检测水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4的功能标记及其应用 |
| CN112410460A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-02-26 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 稳定表达的水稻芽期耐冷qtl紧密连锁的分子标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1904073A (zh) * | 2006-07-18 | 2007-01-31 | 中国农业大学 | 一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物 |
-
2014
- 2014-03-19 CN CN201410101188.9A patent/CN103866026B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1904073A (zh) * | 2006-07-18 | 2007-01-31 | 中国农业大学 | 一种辅助筛选耐冷水稻的方法及其专用引物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 宫超: "分子标记辅助选择培育水稻五优稻1号（Pi9）和五优稻1号（cry1C*）", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
| 郑加兴等: "普通野生稻苗期耐冷性QTL的鉴定与分子定位", 《中国水稻科学》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505922B (zh) * | 2015-12-16 | 2019-07-30 | 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 | 一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法 |
| CN105505922A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-04-20 | 中农常乐（深圳）生物育种技术有限公司 | 一种水稻孕穗期稳定表达的耐冷基因qCT-3-2HHZ及其分子标记方法 |
| CN105525000B (zh) * | 2016-01-20 | 2021-03-19 | 江西师范大学 | 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法 |
| CN105525000A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-04-27 | 江西师范大学 | 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法 |
| CN108570515A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-09-25 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻孕穗期耐冷基因qCT6.7DOD的分子标记及应用 |
| CN108315475A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-07-24 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻孕穗期耐冷基因qCT9.6X22的分子标记及应用 |
| CN108570515B (zh) * | 2018-05-02 | 2021-08-31 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻孕穗期耐冷基因qCT6.7DOD的分子标记及应用 |
| CN108570516A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-09-25 | 江苏高航农业科技有限公司 | 珍味稻耐储藏主效qtl的分子标记及其应用 |
| CN108570516B (zh) * | 2018-05-15 | 2021-10-22 | 福建六三种业有限责任公司 | 珍味稻耐储藏主效qtl的分子标记及其应用 |
| CN109880930A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-14 | 广西大学 | 一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用 |
| CN111876513A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-11-03 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种检测水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4的功能标记及其应用 |
| CN112410460A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-02-26 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 稳定表达的水稻芽期耐冷qtl紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN112410460B (zh) * | 2020-12-14 | 2022-02-11 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 稳定表达的水稻芽期耐冷qtl紧密连锁的分子标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103866026B (zh) | 2016-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103866026B (zh) | 水稻耐冷主效基因鉴定方法及其专用引物 | |
| CN103642801B (zh) | 水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记及其应用 | |
| CN102220430B (zh) | 一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物 | |
| CN101962640A (zh) | 甘蓝型油菜粒重相关基因的特异分子标记及应用 | |
| CN102181440B (zh) | 水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记及其应用 | |
| CN101914531A (zh) | 水稻抗褐飞虱主效基因Bph6的分子标记及其应用 | |
| GUO et al. | Development and identification of introgression lines from cross of Oryza sativa and Oryza minuta | |
| CN103993011A (zh) | 芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用 | |
| CN103045588A (zh) | 大豆籽粒蛋白质含量主效qtl 的分子标记及其应用 | |
| CN105543222B (zh) | 大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用 | |
| CN108048594A (zh) | 一种与棉花黄萎病抗性有关的qtl/主效基因的分子标记 | |
| CN102703438A (zh) | 一种甘蓝型油菜粒重性状的分子标记及制备方法与应用 | |
| CN103866006B (zh) | 小麦抗穗发芽QTL位点QPhs.sicau-3B.1的分子标记M3B-1a和M3B-2a及其应用 | |
| CN104109713B (zh) | 与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法 | |
| CN103160584A (zh) | 筛选或辅助筛选高抗穗发芽小麦的方法及其专用引物 | |
| CN102766625B (zh) | 抗稻褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用 | |
| CN110468229B (zh) | 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1 | |
| CN110777218B (zh) | 一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用 | |
| CN110358861B (zh) | 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14 | |
| CN114032235B (zh) | Ssr标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关ssr标记位点的筛选方法 | |
| CN101368181A (zh) | 与水稻紫叶鞘基因PSH1(t)连锁的分子标记及其获得方法和应用 | |
| CN104073488A (zh) | 一种矮化小麦标记基因的分子标记及其引物和应用 | |
| CN110358862B (zh) | 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14 | |
| Ali et al. | Molecular implications from SSR markers for stripe rust (Puccinia striiformis f. sp. tritici) resistance gene in bread wheat line N95175 | |
| CN108570515B (zh) | 水稻孕穗期耐冷基因qCT6.7DOD的分子标记及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160413 |