CN109880930A - 一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用，所述水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记为M5和M6，利用所述分子标记M5和M6对应的引物进行PCR扩增，对扩增产物进行检测；所述分子标记M5和M6的鉴定方法在水稻耐冷qCTS12的定位中的应用。利用所述分子标记M5和M6能够有效检测水稻品种中是否含有该耐冷主效位点，快速提高水稻苗期耐冷材料的选择效率。采用本发明能够加快该耐冷qCTS12的定位，并将其应用于辅助选择育种，加快育种进程。

Description

一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和 应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体是一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用，适用于水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其在水稻苗期耐冷品种选育和基因资源筛选中的应用。

背景技术

水稻作为世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对于解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。然而，我国主要的水稻产区在水稻种植期间都常因低温胁迫而遭受冷害，如东北地区，平均3～4年就会遭遇一次冷害；长江中下游及南方的稻作区常出现的“倒春寒”使早稻出现烂秧的现象；南方晚稻遭遇“寒露风”则会引起水稻抽穗延迟；2008年初我国南方地区遭受的严重低温冰雪灾害，对华南地区已经播种的杂交水稻制种亲本造成了极大的损害。因此，为了克服低温对水稻栽培的不利影响，除了采取一般的农业措施之外，培育耐冷水稻品种是消除低温危害的最经济、最有效的手段之一。

水稻冷害发生时细胞外膜以及细胞器的质体膜透性增加，细胞内活性氧含量上升、光合呼吸作用下降，从而导致植株代谢能力下降、生长缓慢、叶片发黄或者枯死，这些生理症状为耐冷QTL的定位提供了表型基础。1996年几个水稻苗期耐低温QTLs被首次报道，之后随着生物技术的快速发展，水稻耐冷QTLs被不断被发现。迄今为止，在水稻的12条染色体上共有250多个水稻耐低温QTL被发现。然而大部分QTL只是停留在初定位的水平上，精细定位和克隆的QTL十分有限。

水稻耐冷QTL被精细定位的只有12个，包括萌发期耐低温QTL qLTG-9；苗期耐低温QTL qCTS4，qCtss11，qSCT1，qSCT11和qLOP2/qPSR2-1；苗期和成熟期耐低温QTL qRC10-2；孕穗期耐低温QTL qLTB3，qCTB7，qCTB8，qCT-3-2和qCTB10-2。

水稻耐冷QTL被成功克隆的只有7个，包括qLTG3-1，COLD1，qCTS-9，GSTZ2，LTG1、Ctb1和CTB4a。qLTG3-1能增强水稻在低温条件下种子萌发能力。COLD1编码的是一种G蛋白信号调节因子，低温下COLD1增强钙离子的内流激活下游基因提升水稻苗期抗寒性。过量表达qCTS-9显著提升水稻低温抗性。GSTZ2编码蛋白第99位的苯丙氨酸对蛋白行使低温应答功能至关重要。LTG1编码一个酪蛋白激酶Ⅰ，功能缺失型对低温敏感。Ctb1编码一个包含F-box结构域的蛋白，低温下参与泛素-蛋白酶体信号传导途径。CTB4a编码LRR-RLK(leucine-rich repeat receptor-like kinase)，它与ATP合成酶的β亚基AtpB互作，维持ATP酶在低温条件下的正常功能。这些基因的克隆极大地促进了人们对水稻耐冷机理的理解。

耐冷QTL的挖掘，可以深化我们对水稻耐冷调控网络的认识和理解。同时，其所获得的分子标记还可以用于辅助选择育种。由于分子标记辅助选择(Marker-AssistedSelection，MAS)方法是对品种的基因型进行的选择，不受环境的影响，因此MAS育种应用于对水稻耐冷QTL的改良，必将有效的提升育种的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记，通过检测水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记，能够快速筛选出苗期耐冷水稻品种，提高该性状的选择效率、加快育种进度。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记，所述分子标记为M5和M6，其对应的引物分别是：

M5：

上游引物：5'—ATAAGACGAAAGGTCAAACG—3'；

下游引物：5'—ATGGTCCACCTCCAGAGT—3'；

M6：

上游引物：5'—TGGCTAGAAAATAGTGGGAA—3'；

下游引物：5'—CCAGTTATCCACGATGAAAT—3'。

所述的水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的获取方法，包括以下步骤：

利用耐冷广西普通野生稻DP15作为供体亲本，以冷敏感水稻品种9311作为轮回亲本构建的染色体片段替换系群体(chromosome segment substitution lines，CSSLs)，通过连续回交、自交并定向选择，在BC₅F₂代获得稳定遗传的耐冷染色体片段代换系DC90，包含了12号染色体上的替换系片段qCTS12。为了进一步精细定位qCTS12，用DC90与9311回交，获得F₁杂交种，自交后获得F₂分离群体，通过基因型鉴定和表型鉴定，经过分子标记选择和苗期耐冷表型鉴定出W1，W2，W18，W32，W38，W50，W82，W175 8个重要的交换单株。本实验基于材料9311，DC90，NC，W1，W2，W18，W32，W38，W50，W82，W175通过PCR技术扩增亲本DP15和9311筛选多态性分子标记，并用所获得的多态性分子标记在各交换单株中进行验证，获得权利要求1所述的分子标记。

所述水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记在水稻苗期耐冷qCTS12的定位中的应用。

所述的水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记方法，包括以下步骤：

以待鉴定水稻材料全基因组DNA为模板，利用以上所述的分子标记M5和M6对应引物的进行PCR扩增，对扩增产物进行检测：

(1)采用分子标记M5引物进行PCR扩增，若扩增出167bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效QTL CTS12；

(2)采用分子标记M6引物进行PCR扩增，若扩增出132bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效QTL CTS12；

所述PCR的反应10ul体系如下：

所述PCR反应条件：94℃变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。

DNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并通过核染料标记扩增的DNA条带，通过凝胶成像仪对标记DNA成像。

所述的分子标记方法在选育水稻耐冷品种中的应用。

本发明的有益效果为:

(1)通过水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的发现，能够加快该耐冷QTLqCTS12的精细定位，并将其应用于辅助选择育种，便于及时的杂交转育，加快育种进程；

(2)建立了一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记方法，能够准确、快速地鉴别带有qCTS12的耐冷单株，提高该形状的选择效率，加快育种进度。

(3)通过水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的苗期耐冷抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有苗期耐冷抗性，进而快速筛选耐冷品种或品系用于水稻育种。丰富了人们对水稻耐冷调控网络的认识和理解，也增加了水稻耐冷基因资源的多样性，为培育不同类型的耐冷水稻品种提供了更多的选择；

附图说明

图1是染色体片段代换系CSSL12DC90的遗传背景；

图2苗期低温胁迫表型，其中：A：冷处理前9311、NC和DC90表型；B：在8-10℃下冷处理5天，9311、NC和DC90表型；C：冷处理5天后，在正常条件下恢复7天，9311、NC和DC90表型；

图3是F₂代交换单株苗期冷胁迫表型鉴定；

图4是qCTS12遗传连锁分析；

图5是分子标记引物M5和M6对52个不同的水稻品种扩增的部分扩增带型；其中，图5a为分子标记引物M5对52个不同的水稻品种的部分扩增带型；图5b为分子标记引物M5对52个不同的水稻品种的部分扩增带型；

图6a和图6b是52个不同的水稻品种冷胁迫处理后的部分表型图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

分子标记的筛选和定位

1.耐冷染色体片段代换系CSSL12的构建与代换片段耐冷表型分析

(1)、利用耐冷广西普通野生稻DP15作为供体亲本，以冷敏感水稻品种9311作为轮回亲本构建的染色体片段替换系群体(chromosome segment substitution lines，CSSLs)，通过连续回交、自交并定向选择，在BC₅F₂代得到了DC90和NC这两个遗传背景近似的染色体片段替换系。DC90大部分遗传背景与轮回亲本9311一致，只在3号和12号染色体上有DP15的片段替换，其长度分别为10Mb和20Mb。而NC只在3号染色体上有DP15的片段替换，且与DC90中3号染色体替换区域相同，如图1所示。

(2)、对DC90和NC进行耐冷表型鉴定，结果发现，DC90具有对冷胁迫耐受的能力，而NC表现为冷敏感，如图2所示。结合DC90与NC的遗传背景推断，DC90冷耐受能力是由位于12号染色体上DP15的片段控制的，位于分子标记M3和M12之间的20Mb大小的区域，因此获得了具有苗期耐冷抗性的替换系片段DC90。

2.DC90/9311的F₂分离群体的构建与遗传分析

(1)、利用耐冷染色体片段代换系DC90与受体亲本9311杂交，获得F₁杂交种，种植F₁杂交种，自交获得F₂分离群体，用于遗传分析。

(2)、用TPS法提取亲本及F2群体各单株的叶片基因组DNA。

(3)、将DP15和9311基因序列信息进行比对，在M3和M12区段设计了50多个STS标记用于进一步的精细定位。其中具有多态性的InDel分子标记有M4，M5，M6，M7，M8，M9，M10，M11。

(4)利用分子标记筛选F₂群体精细定位CTS12基因

根据QTL的定位结果，利用获得的多态性分子标记M4，M5，M6，M7，M8，M9，M10，M11鉴定F₂群体中每个个体的目标区域的基因型，从F2群体筛选得到了一系列交换型的单株，结合检测各单株的基因型和表型，考察标记与抗性表型共分离的情况。

上述连锁分析和初步定位过程，所采用的DNA提取方法和PCR反应条件分别为：

A.用常规的TPS法提取供体亲本、受体亲本和F₂分离群体各单株的DNA；

B.PCR的反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环，最后

72℃终延伸10min。

DNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过显色记录扩增的DNA条带。

由上述过程可以看出利用这些与耐冷主效QTL qCTS12的分子标记能够有效地开展耐冷QTL qCTS12的分子标记辅助选择育种；同时能够利用大的分离群体，加快对耐冷QTLqCTS12的精细定位。

(五)结果与分析

通过重组单株的基因型和相应耐冷表型鉴定，见表1及图3，结合基因型和表型遗传连锁分析：W18表现为冷敏感，则qCTS12应位于分子标记M6的左侧。W38表现为冷耐受，则qCTS12应位于M4的右侧。综上所述，qCTS12应定位于分子标记M4和M6之间1.36Mb的区域内，如图4所示。与之前的定位结果相比较，qCTS12属于一个新的水稻苗期耐冷QTL位点。

表1 F2交换单株基因型

注表1中：A代表9311基因型；B代表DP15基因型；H代表杂合型。

实施例2

分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料

52份不同来源的水稻品种

1.2方法

1.2.1PCR扩增：TPS抽提法提取水稻叶片基因组DNA，用引物M5和M6扩增所提取的样品DNA，方法同实施例1。

1.2.2冷胁迫表型鉴定：选取饱满的种子，在30℃水温中发芽3天。待种子“露白”，播于盛满大田土壤的塑料桶中正常生长，环境温度30℃，光照20000Lux，空气湿度40％。当幼苗长到3叶期后进行冷处理。当幼苗长到3叶期放入8℃—10℃的人工气候培养室中冷处理5天，期间光照周期为13h(光)/11h(暗)，光照强度20000Lux，空气湿度40％。冷处理结束后将幼苗转移到正常条件下生长，7天后统计水稻苗期冷胁迫后存活率。所述正常条件为白天28℃/晚上26℃,光照强度20000Lux，空气湿度40％。

2结果分析

(1)采用分子标记M5引物对不同水稻品种DNA进行扩增，若扩增出167bp的特异扩增片段，则表明有耐冷主效QTL qCTS12的存在，用B表示基因型；若能扩增出146bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段，用A表示基因型，如图5a所示；

(2)采用分子标记M6引物对不同水稻品种DNA进行扩增，若扩增出132bp的特异扩增片段，则表明有耐冷主效QTL qCTS12的存在，用B表示基因型；若能扩增出107bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段，用A表示基因型，如图5b所示；

(3)统计水稻基因型及苗期冷胁迫后存活率，如表2及图6a和图6b所示，基因型为A的水稻品种，苗期冷胁迫后存活率为0；基因型为B的水稻品种，苗期冷胁迫后存活率为68.97％。综合起来准确率可以达到82.69％。

基于上述2个分子标记来检测水稻品种，可验证是否含有耐冷主效QTL qCTS12的存在，可以快速进行耐冷水稻品种的选育，从而加快育种进度。

表2 52份水稻品种基因型及冷胁迫表型

注表2中：A代表9311基因型；B代表DC90基因型；

1代表活，0代表死。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataagacgaa aggtcaaacg 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtccacc tccagagt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggctagaaa atagtgggaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagttatcc acgatgaaat 20

Claims (10)

1.水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记，其特征在于，所述分子标记为M5和M6，其对应的引物为：

M5：

上游引物：5'—ATAAGACGAAAGGTCAAACG—3'；

下游引物：5'—ATGGTCCACCTCCAGAGT—3'；

M6：

上游引物：5'—TGGCTAGAAAATAGTGGGAA—3'；

下游引物：5'—CCAGTTATCCACGATGAAAT—3'。

2.水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记，其特征在于，采用M5或M6引物对水稻全基因组模块扩增出来的碱基序列(167bp、132bp)，其对应的引物为：

M5：

上游引物：5'—ATAAGACGAAAGGTCAAACG—3'；

下游引物：5'—ATGGTCCACCTCCAGAGT—3'；

M6：

上游引物：5'—TGGCTAGAAAATAGTGGGAA—3'；

下游引物：5'—CCAGTTATCCACGATGAAAT—3'。

3.如权利要求1所述的水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用耐冷广西普通野生稻DP15作为供体亲本，以冷敏感水稻品种9311作为轮回亲本构建的染色体片段替换系群体(chromosome segment substitution lines，CSSLs)，通过连续回交、自交并定向选择，在BC₅F₂代获得稳定遗传的耐冷染色体片段代换系DC90，包含了12号染色体上的替换系片段qCTS12，为了进一步精细定位qCTS12，用DC90与9311回交，获得F₁杂交种，自交后获得F₂分离群体，通过基因型鉴定和表型鉴定，经过分子标记选择和苗期耐冷表型鉴定出W1，W2，W18，W32，W38，W50，W82，W175 8个重要的交换单株，实验基于以上材料9311，DC90，NC，W1，W2，W18，W32，W38，W50，W82，W175,通过PCR技术扩增亲本DP15和9311筛选多态性分子标记，并用所获得的多态性分子标记在各交换单株中进行验证，获得所述的水稻耐冷主效QTL qCTS12的分子标记。

4.如权利要求1所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记在水稻耐冷qCTS12的定位中的应用。

5.一种水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待鉴定水稻材料全基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的分子标记M5和M6对应引物中的一对或多对进行PCR扩增，对扩增产物进行检测：

(1)采用分子标记M5引物进行PCR扩增，若扩增出167bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效QTL CTS12；

(2)采用分子标记M6引物进行PCR扩增，若扩增出132bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效QTL CTS12。

6.如权利要求5所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的鉴定方法，其特征在于：

所述PCR的反应10ul体系如下：

7.如权利要求5所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的鉴定方法，其特征在于：

PCR反应条件：94℃变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。

8.如权利要求5所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的鉴定方法，其特征在于：qCTS12定位于分子标记M4和M6之间1.36Mb的区域内。

9.如权利要求5所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记的鉴定方法，其特征在于：

DNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并通过核染料标记扩增的DNA条带，通过凝胶成像仪对标记DNA成像。

10.如权利要求5至7任一项所述的水稻苗期耐冷主效QTL qCTS12的分子标记方法在选育水稻耐冷品种中的应用。